李殿昊 朱 萍 王夢(mèng)媛 關(guān)樺楠 葉 華

（江蘇科技大學(xué)糧食學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212100）

糧食質(zhì)量安全一直是社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)，其中小分子危害物引發(fā)的糧食安全問題不容小覷，近年來(lái)食品安全監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)的問題都離不開小分子危害物。如：2021 年12 月，深圳市市場(chǎng)監(jiān)督管理局抽樣發(fā)現(xiàn)“鹽津鋪?zhàn)印焙谔窃捗分秀U含量超標(biāo)、陳克明家用小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量超標(biāo)；2022 年4月，陜西省市場(chǎng)監(jiān)督管理局通告稱楊凌居江大潤(rùn)商貿(mào)有限公司銷售的白花生米中黃曲霉毒素B1 含量超標(biāo)；等等。小分子危害物含量超標(biāo)給糧食安全和群眾健康帶來(lái)了巨大威脅，加強(qiáng)糧食及其加工產(chǎn)品中小分子危害物快速檢測(cè)意義重大。

一些傳統(tǒng)的檢測(cè)方法如薄層層析法（thin layer chromatography，TLC）[1]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[2]、高效液相色譜-質(zhì)譜法等儀器法及酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[3-5]已廣泛應(yīng)用于糧食小分子危害物檢測(cè)。這些檢測(cè)方法靈敏度高，但設(shè)備昂貴、技術(shù)要求高、操作繁瑣、檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，難以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)[6，7]。小分子危害物由于分子量小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，通常只有免疫反應(yīng)而沒有免疫原性，所以并不是每種小分子都能制備抗體[8]。因此，開發(fā)新型識(shí)別分子探針，可彌補(bǔ)抗體檢測(cè)方面的不足。

核酸適配體（aptamer）是利用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）篩選獲得的一段單鏈DNA或RNA 功能核酸序列，其具有制備周期短、無(wú)需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、親和力高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能特異性識(shí)別各種靶標(biāo)[9，10]。作為一種新型分子識(shí)別探針在小分子檢測(cè)方面得到了廣泛的應(yīng)用，先后建立了基于適配體技術(shù)的比色法[11]、熒光法[12]、熒光偏振法[13]、電化學(xué)法[14]等多種檢測(cè)方法。其中熒光偏振法是一種操作簡(jiǎn)單且無(wú)需分離、靈敏度高的均相檢測(cè)方法，和儀器法、免疫分析法相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)，起初主要應(yīng)用于分子量大的靶標(biāo)檢測(cè)，而小分子物質(zhì)由于分子量小，難以引起明顯的熒光偏振信號(hào)變化，而且檢測(cè)限也比較低[15]。為此，人們研究各種策略來(lái)彌補(bǔ)這種方法的不足，已成功將熒光偏振技術(shù)應(yīng)用于小分子目標(biāo)物的檢測(cè)。文中介紹了熒光偏振技術(shù)原理，從直接檢測(cè)法和信號(hào)放大競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)法兩個(gè)方面總結(jié)了其在糧食小分子危害物檢測(cè)應(yīng)用進(jìn)展情況，并對(duì)未來(lái)發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

1 熒光偏振技術(shù)原理

光波可以在光的任一平面上發(fā)生均勻地振動(dòng)，當(dāng)光通過某一平面時(shí)，光的振動(dòng)平面就發(fā)生了改變，導(dǎo)致某個(gè)方向的振動(dòng)強(qiáng)于或弱于其他平面，這樣產(chǎn)生的光即偏振光。熒光偏振是由熒光分子與偏振光相結(jié)合的一種技術(shù)，由Perrin 在20 世紀(jì)20 年代首次提出。他研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶液中的熒光分子受到偏振光激發(fā)時(shí)，熒光分子可產(chǎn)生相應(yīng)的偏振熒光。如果激發(fā)時(shí)，熒光分子處于靜止?fàn)顟B(tài)，則該熒光分子仍保持原有激發(fā)光的偏振性質(zhì)；如果熒光分子處于運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，即分子不斷發(fā)生翻轉(zhuǎn)或旋轉(zhuǎn)，這時(shí)候產(chǎn)生的偏振熒光與原有激發(fā)光可能不在同一個(gè)偏振平面，就產(chǎn)生了不同的偏振性質(zhì)[16]。因此，可以通過測(cè)量不同方向上的偏振熒光強(qiáng)度來(lái)表達(dá)熒光偏振的大小[17]。在實(shí)際檢測(cè)中，熒光偏振強(qiáng)度可用式（1）進(jìn)行定義。

式中IV和IH式分別表示熒光分子被偏振光激發(fā)后，在垂直和水平方向上的偏振強(qiáng)度。一般來(lái)說(shuō)，熒光偏振強(qiáng)度與分子大小、分子旋轉(zhuǎn)或翻轉(zhuǎn)速度、溫度、溶液黏度等因素有關(guān)。熒光偏振強(qiáng)度與各因素之間的關(guān)系可用式（2）表示[18]。

式中P 表示熒光偏振強(qiáng)度，P0表示極限熒光偏振強(qiáng)度，和氣體常數(shù)R 一樣通常是一個(gè)常數(shù)，T 是絕對(duì)溫度，V 是摩爾分子體積，t 代表熒光壽命，h 是溶液黏度。

從式（2）可以看出，當(dāng)溶液體系一定時(shí)，即溶液黏度不變，在一定溫度下，熒光偏振強(qiáng)度主要取決于熒光分子的體積，分子體積越大，旋轉(zhuǎn)速率越慢，熒光偏振強(qiáng)度P 值越大；反之，熒光偏振強(qiáng)度越小。因此，可以利用這一原理對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定量分析。由于熒光偏振強(qiáng)度是是一個(gè)比值，不受樣品顏色等因素影響[19，20]，且無(wú)需分離步驟，操作簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)均相快速檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)效率，已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域[21]。

2 熒光偏振適配體生物傳感器在糧食小分子危害物檢測(cè)方面的應(yīng)用

2.1 直接檢測(cè)法

直接檢測(cè)法是利用標(biāo)記熒光分子的適配體與小分子待測(cè)危害物結(jié)合后引起構(gòu)象改變，從而產(chǎn)生一定的熒光偏振信號(hào)變化，這種檢測(cè)方法無(wú)須引入其他信號(hào)放大因子。如ZHAO 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，四甲基羅丹明（TMR）熒光基團(tuán)標(biāo)記在適配體不同位置會(huì)引起不同的熒光偏振信號(hào)變化，推測(cè)這可能是由于靶結(jié)合誘導(dǎo)適配體構(gòu)象發(fā)生改變以及TMR 與堿基之間的分子內(nèi)相互作用導(dǎo)致的。因此利用TMR 標(biāo)記的適配體開發(fā)了赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）小分子危害物的熒光偏振直接檢測(cè)法。SUN 等[23]則通過標(biāo)記位點(diǎn)優(yōu)化最終確定了TMR 標(biāo)記在第26 個(gè)堿基T 位置上時(shí)，檢測(cè)時(shí)熒光偏振信號(hào)響應(yīng)明顯。他們基于此現(xiàn)象構(gòu)建了T26 標(biāo)記TMR 熒光基團(tuán)成功實(shí)現(xiàn)了黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）的熒光偏振直接檢測(cè)法，結(jié)果顯示，其最低檢測(cè)限可達(dá)2 nM（約0.6 ng/mL）。YU 等[24]利用同樣的原理成功構(gòu)建了Cd2+的熒光偏振直接檢測(cè)方法，其最低檢測(cè)限可達(dá)6.1 nM。這種直接檢測(cè)法需要優(yōu)化設(shè)計(jì)熒光基團(tuán)標(biāo)記位置，前期成本相對(duì)較高，盡管優(yōu)化位點(diǎn)后能產(chǎn)生一定的信號(hào)變化，但是檢測(cè)限不高，且該方法受靶標(biāo)和適配體結(jié)合構(gòu)象變化的影響，并不一定能適應(yīng)于所有待檢測(cè)靶標(biāo)，因此在實(shí)際應(yīng)用中具有一定的局限性。

2.2 信號(hào)放大競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)法

實(shí)際上，基于適配體識(shí)別的熒光偏振技術(shù)檢測(cè)真菌毒素多采用信號(hào)放大競(jìng)爭(zhēng)策略，即引入納米材料[25]、蛋白質(zhì)[26]、酶[27]、核酸[28]等作為質(zhì)量放大因子進(jìn)行熒光信號(hào)放大，從而實(shí)現(xiàn)小分子目標(biāo)物的快速檢測(cè)。

2.2.1 納米材料信號(hào)放大技術(shù)

在熒光偏振適配體傳感器中，納米材料如納米金（AuNPs）、納米銀（AgNPs）、氧化石墨烯納米片（Graphene oxide nanosheets，GOs）等常作為質(zhì)量放大因子提高熒光偏振信號(hào)強(qiáng)度[29]。 如SAMOKHVALOV 等[30]引入納米金作為載體和質(zhì)量放大因子，將其修飾鏈霉親和素后與生物素標(biāo)記的赭曲霉毒素A（OTA）適配體通過共價(jià)鍵相結(jié)合，利用熒光標(biāo)記的OTA 分子構(gòu)建了一種競(jìng)爭(zhēng)型的熒光偏振適配體生物傳感器，并應(yīng)用于白酒中的OTA 檢測(cè)，其檢測(cè)限低至2.3 mg/kg，是沒有引入AuNPs 作為信號(hào)放大因子時(shí)的25 倍，且檢測(cè)時(shí)間僅需15 min，其檢測(cè)原理如圖1（A）所示；JIANG 等[31]則利用納米銀（AgNPs）作為質(zhì)量放大因子，構(gòu)建了Hg2+的熒光偏振適配體生物傳感器，研究結(jié)果表明，該信號(hào)放大型生物傳感器在10 nM～0.4 mM 濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限低至6.6 nM。

圖1 基于不同策略放大信號(hào)實(shí)現(xiàn)熒光偏振檢測(cè)小分子靶標(biāo)原理圖

除納米金、納米銀外，氧化石墨烯納米片由于具有吸附單鏈和質(zhì)量放大雙重作用，也常作為納米材料增強(qiáng)熒光偏振信號(hào)。YE 等[32]引入氧化石墨烯作為質(zhì)量放大因子構(gòu)建了一種基于適配體的熒光偏振方法快速檢測(cè)AFB1。他們利用GO 吸附熒光標(biāo)記的AFB1適配體形成大分子的GO/aptamer 復(fù)合物，從而分子旋轉(zhuǎn)速度變慢，產(chǎn)生較大的熒光偏振信號(hào)，但目標(biāo)物AFB1出現(xiàn)時(shí)，由于適配體的高親和性和特異性，將適配體從GO 表面解離下來(lái)形成AFB1/aptamer 復(fù)合物，分子質(zhì)量變小，分子旋轉(zhuǎn)速度變快，從而使得熒光偏振值降低。根據(jù)熒光偏振信號(hào)前后變化實(shí)現(xiàn)了大米中AFB1檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果表明，其在0.05～5 nM 濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，其檢測(cè)限達(dá)0.05 nM。近年來(lái)，納米材料被廣泛應(yīng)用于分析檢測(cè)之中，其分子質(zhì)量遠(yuǎn)大于適配體或真菌毒素，同時(shí)由于具有較大的比表面積、熱穩(wěn)定性等特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，是質(zhì)量放大策略的首選放大因子。

2.2.2 蛋白質(zhì)輔助信號(hào)放大技術(shù)

蛋白質(zhì)的分子量或體積相對(duì)于適配體較大，也可以起到熒光偏振信號(hào)放大作用。鏈霉親和素是一種四聚體蛋白，分子量約為66 KDa，常被用來(lái)做熒光偏振輔助放大因子[34，35]。如SAMOKHVALO 等[36]基于鏈霉親和素和生物素標(biāo)記的IgG 單克隆抗體作為熒光偏振信號(hào)放大因子，開發(fā)了一種基于適配體識(shí)別的熒光偏振方法檢測(cè)OTA。研究結(jié)果表明，在鏈霉親和素和IgG 的雙重增強(qiáng)作用下，可以在15 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)葡萄酒中OTA 納米級(jí)的檢測(cè)，檢測(cè)限可達(dá)3.6 nM。

鏈霉親和素本身不僅可以作為分子質(zhì)量放大作用，還可以利用生物素親和素共價(jià)作用連接更大的分子進(jìn)行質(zhì)量放大作用實(shí)現(xiàn)熒光偏振信號(hào)的變化[37]。LI 等[38]則利用抗體偶聯(lián)適配體互補(bǔ)鏈作為質(zhì)量放大因子構(gòu)建了AFB1的熒光偏振檢測(cè)方法。當(dāng)連接有抗體的互補(bǔ)鏈與適配體結(jié)合后，形成的復(fù)合物分子量增大，分子轉(zhuǎn)動(dòng)速度變慢，導(dǎo)致熒光偏振強(qiáng)度增大。但AFB1出現(xiàn)后與適配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合形成適配體/靶標(biāo)復(fù)合物，分子量降低，分子轉(zhuǎn)動(dòng)速度加快，熒光偏振信號(hào)降低，檢測(cè)其最低檢測(cè)限可達(dá)25 pM，其原理圖見圖1（B）。

盡管蛋白質(zhì)質(zhì)量放大策略可以提高熒光偏振檢測(cè)的靈敏度，但與納米材料相比，蛋白質(zhì)對(duì)熱不穩(wěn)定，在熒光偏振測(cè)定中具有可變性，并且需要在與生物分子的性質(zhì)和穩(wěn)定性相匹配的實(shí)驗(yàn)條件下才能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。

2.2.3 酶輔助信號(hào)放大技術(shù)

基于酶輔助的熒光偏振信號(hào)放大技術(shù)在小分子目標(biāo)物檢測(cè)中也具有較好的應(yīng)用[39，40]。核酸外切酶（Exo III）是一種能沿3'→5'方向催化DNA 外切而產(chǎn)生5'-磷酸單核苷酸的酶[27]。MA 等[41]利用Exo III這一特點(diǎn)，在鏈霉親和素作為熒光偏振信號(hào)放大因子的基礎(chǔ)上，在19 bp 長(zhǎng)熒光標(biāo)記的玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）適配體3'端設(shè)計(jì)了生物素標(biāo)記的locker 序列，構(gòu)建了酶輔助熒光偏振信號(hào)放大技術(shù)實(shí)現(xiàn)了ZEN 的快速、靈敏檢測(cè)。結(jié)果表明在0.01～100 ng/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限低至0.004 ng/mL，圖1（C）是其檢測(cè)原理圖。在這項(xiàng)研究中，Exo III 被用于催化降解探針分子進(jìn)行不斷循環(huán)，從而顯著提高熒光偏振變化強(qiáng)度。雖然酶可以實(shí)現(xiàn)熒光偏振信號(hào)的放大，但由于酶受溫度和pH 影響較大，容易變性，在復(fù)雜的生物樣品檢測(cè)中難以控制操作[42]，限制了該方法的擴(kuò)大應(yīng)用。

2.2.4 核酸輔助信號(hào)放大技術(shù)

而核酸尤其是DNA 性質(zhì)相對(duì)較穩(wěn)定，近年來(lái)常被應(yīng)用開發(fā)熒光偏振信號(hào)放大檢測(cè)技術(shù)，常見的有核酸雜交互補(bǔ)鏈以及PCR 擴(kuò)增等技術(shù)等[43]。如HONG 等[44]在熒光標(biāo)記的單鏈DNA 上設(shè)計(jì)了線性和發(fā)夾型兩種互補(bǔ)雜交鏈，形成C-Ag+-C 結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生熒光偏振信號(hào)的明顯變化，基于此原理可以實(shí)現(xiàn)Ag+的檢測(cè)（圖1（D））。MA 等[45]以適配體為模板，設(shè)計(jì)了熒光標(biāo)記的正向引物和生物素修飾的反向引物，利用PCR 擴(kuò)增以及生物素-鏈霉親和素共價(jià)作用系統(tǒng)增加適配體模板的分子量，通過雙重信號(hào)放大作用增強(qiáng)熒光偏振信號(hào)，建立了一種新型的熒光偏振適配體生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了氯霉素的高靈敏檢測(cè)。研究結(jié)果表明，在0.001～200 nM 濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，其檢測(cè)限可低至皮摩爾級(jí)，達(dá)到0.5 pM。蜂蜜樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示了該方法具有較好的回收率和實(shí)際樣品檢測(cè)能力。

3 結(jié)論與展望

基于適配體的熒光偏振檢測(cè)技術(shù)利用了適配體和熒光偏振兩個(gè)方面的優(yōu)勢(shì)。利用熒光偏振技術(shù)檢測(cè)糧食小分子危害物也是一項(xiàng)挑戰(zhàn)，學(xué)者們通過設(shè)計(jì)熒光基團(tuán)在適配體不同位置上標(biāo)記產(chǎn)生熒光偏振信號(hào)響應(yīng)進(jìn)行直接檢測(cè)，以及通過質(zhì)量放大作用進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)，均取得了一定的成果。

在糧食小分子危害物的熒光偏振檢測(cè)方法，今后可在以下方面加強(qiáng)。

（1）設(shè)計(jì)性能更好的適配體識(shí)別分子，提高適配體與靶標(biāo)的親和性和特異性。

（2）基于蛋白質(zhì)、酶等不穩(wěn)定特點(diǎn)，納米材料可能是質(zhì)量放大策略首選考慮因素，因此需要開發(fā)更多的、性能更穩(wěn)定、操作更方便的納米材料，從而提高熒光偏振信號(hào)的變化強(qiáng)度，以適應(yīng)不同體系的糧食小分子危害物檢測(cè)。

（3）利用熒光偏振無(wú)需分離、快速檢測(cè)的特點(diǎn)，開發(fā)便攜式熒光偏振生物傳感設(shè)備或系統(tǒng)，以適應(yīng)于現(xiàn)場(chǎng)檢查需要，提升糧食中小分子危害物快速檢測(cè)水平。