羅龍龍， 王麗菲， 鄭 英， 李 斌， 盧利霞， 李初誼， 于曉輝， 張久聰

1 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 蘭州 730000； 2 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院消化內(nèi)科， 蘭州 730050

自身免疫性肝炎（AIH）主要表現(xiàn)為高球蛋白血癥、自身抗體陽性和組織學(xué)上界面性肝炎及匯管區(qū)漿細(xì)胞浸潤等［1］。隨著人類生活環(huán)境的改變，診療水平的提高，以及生物制劑的廣泛使用，AIH 發(fā)病率在全球范圍呈逐年上升趨勢，已成為繼病毒性肝炎和代謝脂肪性肝病之后的第三大類肝病［2］。目前臨床上主要采用激素類藥物，同時(shí)輔以硫唑嘌呤等藥物治療，但其長期應(yīng)用會(huì)引起嚴(yán)重的代謝綜合征、骨質(zhì)疏松、脊柱骨折等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。服用硫唑嘌呤的患者可表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、發(fā)熱、胃腸道不適等，最嚴(yán)重的可表現(xiàn)為骨髓毒性。二線藥物適用于對(duì)一線治療反應(yīng)不佳或?qū)μ瞧べ|(zhì)激素或硫唑嘌呤的副作用不耐受的AIH 患者，如嗎替麥考酚酯、他克莫司均有較好療效。這些藥物不良反應(yīng)有：神經(jīng)反應(yīng)（震顫，頭痛），腎臟反應(yīng)（高血壓，腎功能不全）以及脫發(fā)等。另外，對(duì)于AIH 引起的急性肝衰竭，肝移植是一種有效的治療方法，但其缺陷主要有供體缺乏、手術(shù)創(chuàng)傷大、費(fèi)用高等［3］。

因此，AIH需要新的治療措施，近年來間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）在AIH治療中的潛在優(yōu)勢逐漸突顯。有文獻(xiàn)［4］報(bào)道MSC 可向肝臟遷移，分化為肝細(xì)胞，替代受損細(xì)胞進(jìn)而恢復(fù)肝功能。MSC 還可通過其免疫調(diào)節(jié)功能促進(jìn)肝細(xì)胞存活進(jìn)而抑制炎癥。MSC來源外泌體（mesenchymal stem cell-derived exosome，MSC-EXO）具有類似MSC 的功能，且具有更低的免疫原性、較長的循環(huán)半衰期、良好的滲透性和良好的生物相容性［5］。因此本文就MSC 和MSC-EXO 在自身免疫性肝炎中的研究進(jìn)展作一綜述，以期為AIH 的診治提供新的思路。

1 MSC及其外泌體概述

1.1 MSC MSC 源自出生前胚胎發(fā)育階段的中胚葉和外胚層，存在于多種組織器官，是一種可從骨髓、脂肪組織、牙髓、臍帶和胎盤、外周血以及誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞中分離得到的具有多向分化潛能的干細(xì)胞［6］。MSC 可以調(diào)節(jié)其局部環(huán)境、細(xì)胞通信和釋放多種因子，并參與組織損傷的再生。此外，MSC 具有歸巢能力，可以遷移到損傷部位，具有分化為損傷部位局部成分的能力［7］，并能夠分泌有助于組織再生的趨化因子、細(xì)胞因子和生長因子［8］。大量證據(jù)表明，MSC 可作用于自然殺傷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞，通過抑制激活，增殖和分化為效應(yīng)細(xì)胞［9］。因?yàn)镸SC具有自我復(fù)制、自我更新和無限繁殖的特性，并具有非常強(qiáng)大的免疫調(diào)控和再生的特征，被普遍應(yīng)用到移植物抗宿主疾病、心血管疾病、腫瘤、骨關(guān)節(jié)炎、自身免疫性疾病、糖尿病和退行性疾病中［10］。

1.2 外泌體 外泌體是一種直徑為40～160 nm的細(xì)胞外囊泡，富含DNA、RNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)，通過不同的信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞間通信。外泌體含有大量的膜聯(lián)蛋白、四跨膜蛋白家族（如CD63、CD81 和CD9）和 熱 休 克 蛋 白（如Hsp60、Hsp70 和Hsp90）［11］。外泌體由脂肪細(xì)胞、上皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等多種健康細(xì)胞產(chǎn)生和釋放。此外，其還存在于腦脊液、滑膜、血液等多種體液中，在炎癥、抗原呈遞和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等多種生物過程中發(fā)揮著重要作用［12］。

研究［13-14］表明，MSC-EXO 通過向受損細(xì)胞或組織傳遞信息參與組織再生，并發(fā)揮類似于MSC的生物活性。不同組織來源的MSC-EXO 具有不同的功能，如人臍帶MSC-EXO 可以表達(dá)標(biāo)志性蛋白CD9 及CD63，能夠通過上調(diào)調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞（Treg）和抑制輔助性T淋巴細(xì)胞（Th）17參與自身免疫功能調(diào)節(jié)［15］。骨髓MSC-EXO 通過Wnt/β-catenin 途徑減少CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化，促進(jìn)肝細(xì)胞再生［16］。因此，可利用MSC-EXO 修復(fù)受損組織，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和發(fā)揮抗炎作用來治療由免疫失衡介導(dǎo)的AIH，以及修復(fù)受損的肝細(xì)胞。

2 AIH的發(fā)病機(jī)制

AIH 的具體原因目前尚不明確，但其發(fā)生機(jī)制與其自身抗原呈遞后的免疫活化和機(jī)體的免疫耐受被打破有關(guān)。

2.1 自身抗原呈遞后的免疫活化 在AIH 期間，CD4+Th0在適當(dāng)?shù)墓泊碳ば盘?hào)存在的抗原呈遞過程中被激活。一旦被激活，Th0通過微環(huán)境中存在的細(xì)胞因子和抗原可以分化成不同的Th細(xì)胞群。在IL-12存在的情況下，Th0 分化為Th1，而IL-4 豐富的環(huán)境則有利于分化為Th2。此外，TGF-β、IL-1 和IL-6 促進(jìn)分化為Th17［17］。每個(gè)細(xì)胞亞群都釋放細(xì)胞因子，通過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致對(duì)肝細(xì)胞的自身免疫攻擊（圖1）。

圖1 AIH的發(fā)病機(jī)制Figure 1 The pathogenesis of AIH

分化的Th1 可產(chǎn)生IL-2 和IFN-γ，同時(shí)激活CTL，后者產(chǎn)生IFN-γ和TNF，肝細(xì)胞接觸IFN-γ會(huì)導(dǎo)致主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ類分子和MHC Ⅱ類分子的異常表達(dá)，從而導(dǎo)致T 淋巴細(xì)胞的進(jìn)一步激活和肝損傷［18］。Th2通過分泌細(xì)胞因子誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞成熟為漿細(xì)胞，而B 淋巴細(xì)胞又分泌自身抗體以抗體依賴的細(xì)胞毒補(bǔ)體依賴的方式攻擊正常肝細(xì)胞，導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡［19］。Th17 可產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子IL-17、IL-22和TNF 并誘導(dǎo)肝細(xì)胞分泌IL-6 來促進(jìn)自身免疫［20］。但Th17在AIH中的其他作用仍在研究中。

2.2 免疫耐受被打破 自身免疫性疾病是由自我耐受機(jī)制的破壞所造成的。Treg在維持免疫耐受方面起著核心作用，并在自身免疫性疾?。òˋIH）中起著關(guān)鍵作用。Treg 作為免疫抑制細(xì)胞，通過分泌免疫抑制細(xì)胞因子，如IL-10、TGF-β和IL-35，以及顆粒酶和穿孔素，抑制CD4+T 淋巴細(xì)胞和CTL 介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)［21］。Treg 的數(shù)量與疾病活動(dòng)的標(biāo)志物（如抗可溶性肝抗原抗體和抗肝腎微粒體1抗體）滴度成反比［22］，表明Treg 數(shù)量的減少有利于AIH 發(fā)展。在AIH 中，Treg表達(dá)外核苷三磷酸二酯水解酶1（NTPDase 1，也稱為CD39）的數(shù)量減少，不能充分水解促炎癥的核苷酸，并且不能有效抑制效應(yīng)CD4+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-17，說明AIH 免疫調(diào)節(jié)缺陷是由于Treg 數(shù)量和功能減少所引起的［23］。AIH 患者肝臟中叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3（factor forkhead box P3，F(xiàn)oxP3）增加，特別是在疾病的活躍期，被稱為肝臟中Treg的富集［24］。

最新研究［25］表明濾泡輔助性T 淋巴細(xì)胞（T follicular helper，TFH）在AIH 發(fā)病中也起重要作用，TFH 是輔助性CD4+T 淋巴細(xì)胞的一個(gè)亞群，通過產(chǎn)生IL-21 和表達(dá)CD40 配體等刺激分子，能夠誘導(dǎo)成熟漿細(xì)胞中B 淋巴細(xì)胞的激活和分化，分泌免疫球蛋白。IL-21是通過mTOR途徑調(diào)節(jié)Treg的分化和功能，促進(jìn)Th17 的產(chǎn)生，并通過自分泌信號(hào)促進(jìn)TFH 的分化。嚴(yán)重的AIH 患者血清中IL-21 的水平非常高，并與疾病活動(dòng)相關(guān)。

3 MSC移植治療AIH的作用機(jī)制

MSC 發(fā)揮其治療作用的具體機(jī)制是抑制淋巴細(xì)胞活化和增殖以及促進(jìn)Treg形成（圖2）。MSC通過分泌NO、IL-10、PD-L1、TGF-β1、IL-6、吲哚胺2，3-雙加氧酶、前列腺素E2、肝細(xì)胞生長因子等抗炎因子抑制T淋巴細(xì)胞增殖和CD8+T 淋巴細(xì)胞的活化，并能減輕細(xì)胞毒性［26］。

圖2 MSC移植治療AIH的作用機(jī)制Figure 2 Mechanism of action of MSC transplantation for AIH

3.1 MSC抑制自身抗原呈遞后的免疫活化 Chen等［27］研究了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）移植對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肝炎的治療作用，發(fā)現(xiàn)BMSC 移植，特別是多劑量移植可以上調(diào)肝臟PD-L1 并抑制IL-17 的分泌從而發(fā)揮免疫抑制作用，進(jìn)而改善小鼠肝功能。扁桃體源性MSC 通過PD-L1表達(dá)減弱Th17的分化，直接調(diào)控STAT3的磷酸化［28］。此外，有研究［29］發(fā)現(xiàn)，利用慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建的PD-L1 高表達(dá)的MSC-EXO，通過與PD-1 在細(xì)胞表面相互作用成功激活T 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的免疫抑制信號(hào)。此項(xiàng)研究通過構(gòu)建潰瘍性結(jié)腸炎和銀屑病小鼠自身免疫性疾病模型，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PD-L1 高表達(dá)的MSC-EXO 可特異性靶向肝臟病變部位，有效調(diào)節(jié)Th1、Th2、Th17 和Treg 細(xì)胞亞群之間的平衡，從而減弱AIH的自身免疫性反應(yīng)。

MSC 的免疫調(diào)節(jié)作用不僅是由于可溶性因素的作用，也與細(xì)胞間接觸有關(guān)。MSC 構(gòu)成性地表達(dá)FasL和PD-L1。FasL 可誘導(dǎo)活化的T 淋巴細(xì)胞凋亡，而MSC 表面的PD-L1 與T 淋巴細(xì)胞表面的PD-1 結(jié)合，通過MHCⅡ發(fā)揮免疫抑制作用。MSC 還能分泌IFN-β，增加T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 的表達(dá)，加強(qiáng)對(duì)T 淋巴細(xì)胞的抑制［30］。

IL-35是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型的細(xì)胞因子，其能誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生進(jìn)而限制炎癥反應(yīng)［31］。Wang等［32］在刀豆蛋白A 誘導(dǎo)的重型肝炎小鼠模型中，通過灌注IL-35-MSC，研究了其在刀豆蛋白A 誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎中的保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSC 可以通過減少肝細(xì)胞分泌的IL-17減輕肝損傷，而IL-35-MSC不僅可以減少Th17 分泌IL-17，還可以通過JAK1-STAT1/STAT4信號(hào)通路降低Th1上IFN-γ和肝細(xì)胞FasL 的表達(dá)，從而防止肝細(xì)胞凋亡。

3.2 MSC 維持免疫耐受 AIH 發(fā)病機(jī)制的核心是免疫調(diào)節(jié)的喪失，其治療應(yīng)該集中于恢復(fù)Treg 擴(kuò)展的能力，從而增加其數(shù)量和功能。MSC 可以促進(jìn)Treg 的增殖和轉(zhuǎn)化，抑制Th17 的增殖和部分細(xì)胞因子分泌。在炎癥環(huán)境中，MSC 通過分泌IL-10、血凝素-1 和其他抗炎細(xì)胞因子來抑制T 淋巴細(xì)胞的活化和增殖。此外，MSC 也可以分泌TGF-β 等抗炎細(xì)胞因子來促進(jìn)Treg 的增殖和分化［33］。Chen 等［34］發(fā)現(xiàn)MSC 在脂多糖的刺激下可分泌肝細(xì)胞生長因子來誘導(dǎo)完全分化的Th17 向有功能的Treg 轉(zhuǎn)化，從而調(diào)節(jié)了CD4+T 淋巴細(xì)胞群中Th17/Treg平衡。

有研究［35］表明，BMSC能顯著增加Treg的比例，誘導(dǎo)CD4+CD25-細(xì)胞向Treg分化，抑制Th17的分化，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。Kim等［36］發(fā)現(xiàn)胎盤源性的MSC通過FoxP3 促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞向Treg 分化。Melief 等［37］研究表明，MSC 分泌TGF-β1 參與了對(duì)T 淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，TGF-β1可在T淋巴細(xì)胞受體共刺激下誘導(dǎo)Treg，促進(jìn)單核細(xì)胞活化為Ⅱ型巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的IL-10 進(jìn)一步抑制Th17 的致病性。此外，TGF-β 還可誘導(dǎo)Foxp3 表達(dá)，抑制Th17 的分化，并刺激Treg的發(fā)育。

4 MSC-EXO治療AIH的作用機(jī)制

MSC-EXO是一種重要的旁分泌效應(yīng)體，通過攜帶親代細(xì)胞的生物活性物質(zhì)在細(xì)胞間通信中發(fā)揮重要作用。MSC-EXO 包括細(xì)胞質(zhì)、膜蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、脂質(zhì)、DNA、RNA等，這些分子可轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞通過抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫發(fā)揮其治療作用［38］。MSC-EXO作為無細(xì)胞療法的載體，在自身免疫性疾病的治療中受到廣泛關(guān)注，因?yàn)樗鼈儾粌H具有MSC本身的大部分治療作用，而且降低了引入活細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)。在臨床治療中，MSC-EXO 相比MSC 具有明顯的優(yōu)勢（如損傷組織修復(fù)高效、靶向遞送、安全性高等），未來有可能完全替代MSC 治療［39］。因此，一種使用MSC-EXO 的新型無細(xì)胞療法有望治療AIH。

MSC-EXO 通過特定的miRNA 調(diào)節(jié)肝臟Treg 和Th17 的免疫對(duì)AIH 起治療作用。Lu 等［40］發(fā)現(xiàn)攜帶miR-223-3p 的MSC-EXO 可減弱AIH 肝臟中的炎癥反應(yīng)。其機(jī)制與miRNA-223-3p 介導(dǎo)的對(duì)STAT3 基因和炎性細(xì)胞因子（IL-1β 和IL-6）表達(dá)的調(diào)節(jié)以及Treg/Th17 比值的升高有關(guān)。在BMSC-EXO 中，miR-223 通過下調(diào)實(shí)驗(yàn)性AIH 模型中NLRP3 和caspase-1 的蛋白水平來逆轉(zhuǎn)肝臟炎癥和細(xì)胞死亡，同時(shí)降低血清和肝臟組織中促炎癥因子（TNF-α、IL-17A 和IL-1β）的水平。Zhao 等［41］發(fā)現(xiàn)MSC-EXO 作為地塞米松的載體，在肝臟中大量定植，并有效地內(nèi)化到巨噬細(xì)胞，對(duì)巨噬細(xì)胞有明顯的抑制作用，進(jìn)而抑制AIH的發(fā)展。

5 小結(jié)與展望

AIH 患者的現(xiàn)有治療方法有限，迫切需要一種新的治療方法。MSC 具有改善組織微環(huán)境、促進(jìn)組織再生的能力，其低免疫原性和高安全性使其成為AIH 最有希望的治療選擇。移植后，MSC 遷移至受損肝臟并進(jìn)行靶向分化，通過外泌體傳遞關(guān)鍵細(xì)胞因子，保護(hù)肝臟，并通過抗炎和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制減緩AIH 的進(jìn)展。作為一種新型的無細(xì)胞療法，外泌體可以將多種生物分子輸送至靶細(xì)胞，參與組織修復(fù)和再生，避免MSC過度遷移和致癌的潛在風(fēng)險(xiǎn)。盡管MSC 和MSC-EXO 在AIH 動(dòng)物模型中已經(jīng)顯示出明顯的治療效果，但仍需繼續(xù)深入開展基礎(chǔ)和臨床研究，全面評(píng)價(jià)MSC 和MSC-EXO 移植治療的安全性和有效性。可以預(yù)見，在研究人員和臨床醫(yī)生的不懈努力下，利用MSC 和MSC-EXO治療AIH將給患者帶來新的希望。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：羅龍龍負(fù)責(zé)檢索文獻(xiàn)，撰寫論文；王麗菲、鄭英、李斌、盧利霞、李初誼參與修改論文；于曉輝、張久聰負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。