侯逸文， 張榮杰， 紀龍珊， 李 茜， 高月求， 李 曼

1 上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院 a. 細胞免疫實驗室， b. 肝病科， 上海 201203； 2 肝腎疾病病癥教育部重點實驗室， 上海 201203；

酒精性肝?。ˋLD）是一種因過量飲酒導致迅速出現(xiàn)以黃疸和肝臟相關(guān)并發(fā)癥為特征的疾病，具有較高的短期病死率［1］。ALD是引起全球慢性肝病的主要原因之一［2］，也是全球最常見的晚期肝病之一［3］，其中僅酒精性相關(guān)的肝硬化和肝癌死亡數(shù)就占全球死亡人數(shù)的1%［4］。在美國，ALD 占其肝硬化病死率的48%［2］，而在我國，隨著社會的發(fā)展，飲酒人群比例和ALD的患者數(shù)量也逐年升高［5］。ALD 主要包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝硬化，嚴重的情況下甚至導致肝癌的發(fā)生［6］。酒精可以通過各種機制作用，最后導致脂肪在肝臟的沉積，而酒精在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物會引起免疫反應(yīng)，可能會造成炎癥和損傷［7］，隨著病情進展和代謝產(chǎn)物的積累，最終可能會導致肝癌的形成。ALD 的治療方法主要有戒酒、營養(yǎng)支持和預防肝硬化的發(fā)生及進展［8］，除此之外，沒有針對ALD的具體治療方案［6］。戒酒只能減輕ALD 的部分癥狀，尋求有效的治療ALD、減緩ALD進展的藥物是必要的。

ALD 的發(fā)病機制復雜［9］，目前已知的機制主要涉及氧化應(yīng)激失衡，腸道內(nèi)毒素的增加，免疫炎癥信號通路的激活，以及飲酒對肝細胞的直接損傷等［10］。氧化應(yīng)激失衡由抗氧化能力和活性氧（ROS）之間的失衡引起的［11］。酒精的氧化代謝產(chǎn)物如乙醛和ROS在酒精性肝炎的臨床和病理譜中發(fā)揮著重要作用。酒精氧化代謝影響細胞內(nèi)信號通路，擾亂多個基因的轉(zhuǎn)錄控制，導致脂質(zhì)積累、纖維化、先天免疫和適應(yīng)性免疫的激活。此外，乙醇代謝激活天然免疫和獲得性免疫在ALD的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，乙醛和脂多糖誘導細胞釋放ROS、促炎細胞因子和趨化因子，導致中性粒細胞的浸潤。

中草藥含有多種天然化合物，存在低毒性、多靶點等作用優(yōu)勢，在ALD 的預防和治療方面已受到廣泛關(guān)注［12］。ALD 在中醫(yī)學一般歸屬于“黃疸”“酒疸”［13］“傷酒”“酒脹”［14］等范疇。主要病機在于內(nèi)濕為患，寒濕內(nèi)蘊或濕郁化熱，進一步至脾虛肝郁，肝失疏泄，氣滯血瘀，最終導致肝、脾、腎等臟腑功能失常［1］?！督饏T要略》中張仲景對于酒疸的治則是“清解濕熱”，以“上下分消”為治法［15］，據(jù)此提出梔子大黃湯（ZZDHT）治療酒疸［16］，該方由梔子十四枚、大黃一兩、枳實五枚、豉一升組成。本研究顯示了ZZDHT 能夠減輕慢性酒精喂養(yǎng)加急性酒精灌胃ALD 小鼠模型（NIAAA 模型小鼠）的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，改善中性粒細胞浸潤水平。通過采用網(wǎng)絡(luò)藥理學、非靶向代謝組學和RNA轉(zhuǎn)錄組測序等方法，研究ZZDHT 治療ALD 的可能作用機制，以期為ALD的治療提供研究思路和參考。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學分析

1.1.1 ZZDHT 活性成分篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP），檢索“梔子”“大黃”“枳實”“淡豆豉”此4 味中藥的化合物，以口服利用度值（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 作為篩選條件，過濾獲得復方的有效化合成分及對應(yīng)靶點。使用Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫對篩選出來的中藥復方藥物靶點，借助Uniport數(shù)據(jù)庫，將物種限定為Homo sapiens，將靶點全稱統(tǒng)一規(guī)范轉(zhuǎn)換為對應(yīng)的基因symbol進行校正，便于后期的分析與數(shù)據(jù)處理。

1.1.2 ZZDHT-ALD 靶點網(wǎng)絡(luò)可視化分析 使用GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank五個數(shù)據(jù)庫以“Alcoholic liver disease、alcohol-related liver diseases、alcohol-associated liver disease”為檢索詞獲取ALD 相關(guān)基因，將篩選到的藥物靶點基因和疾病相關(guān)基因取交集，得到藥物-疾病相關(guān)基因，使用jvenn 網(wǎng)絡(luò)平臺（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）繪制交集基因Venn 圖。通過Cytoscape3.8.0 軟件對藥物-疾病相關(guān)基因進行可視化網(wǎng)絡(luò)分析，得到中藥復方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.3 ZZDHT-ALD 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）構(gòu) 建 使 用String 平 臺（https：//cn.string-db.org/）對交集基因進行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析，物種選擇“Homo sapiens”，設(shè)置互動分數(shù)為0.900，去除網(wǎng)絡(luò)圖中已斷開連接的節(jié)點。將分析結(jié)果導入Cytoscape3.8.0軟件，使用CytoNCA插件計算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點中心性得分，根據(jù)節(jié)點的Betweenness（BC）、Closeness（CC）、Degree（DC）、Eigenvector（EC）、LAC、Network（NC）各項得分均大于中位值進行過濾，最終可以得到網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點基因。

1.1.4 ZZDHT-ALD 基因本體（gene ontology，GO）分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析 使用David數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對核心基因進行功能富集分析，以P<0.05 作為過濾條件，進行GO 和通路富集分析。使用R-4.1.1軟件的ggpubr包繪制柱狀圖對富集結(jié)果進行展示。

1.2 ZZDHT 非靶代謝組分析 使用非靶代謝組學技術(shù)檢測ZZDHT 在小鼠血清和肝臟中代謝物變化情況，配制兩倍中劑量濃度的梔子大黃湯予以小鼠灌胃，準備36 只C57BL/6J 小鼠，隨機分為對照組和用藥組，每組18 只。用藥組前3 天早晚各灌胃ZZDHT 一次（0.1 mL/10 g），第3 天晚上禁食，第4 天早上灌胃一次，分別于間隔2 h及4 h后再灌胃一次。對照組灌胃對應(yīng)體積的生理鹽水。分別于最后一次灌胃后10 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h，隨機從2 組各取3 只小鼠麻醉后取小鼠血清和肝組織，血清每只取30 μL，肝組織每只取30 mg，分別混合18 只小鼠的血清和肝組織進行后續(xù)質(zhì)譜分析。使用超高液相色譜技術(shù)，分離和鑒定ZZDHT 在血清和肝組織中的代謝物，對ZZDHT 有效成分進行驗證。

1.3 ZZDHT 改善NIAAA 模型小鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)動物實驗

1.3.1 實驗動物、藥物及造模飼料 采用8 周齡SPF級C57BL/6J 雄性小鼠。購自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0001，實驗動物使用許可證編號：SYXK（滬）2019-0003。

ZZDHT 藥物來自上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院中藥房的免煎顆粒（江陰天江藥業(yè)有限公司）。Lieber-DeCarli 對照液體飼料，Lieber-DeCarli 酒精液體飼料，購自南通特洛菲飼料科技有限公司。

1.3.2 主要試劑 HE 染色試劑盒（北京酷來搏生物科技有限公司，貨號：SL7070-100ML），DAB 顯色試劑盒（茹創(chuàng)生物有限公司，貨號：220105），Trizol（碧云天生物科技有限公司，貨號：R0016 ECL），RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊公司，貨號：R223-01），RNA 擴增試劑盒（南京諾唯贊公司，貨號：Q711-02），ALT、AST檢測試劑盒（南京建成生物工程有限公司，貨號：C009-2-1、C010-2-1）、組織固定液（Biosharp 公司，貨號：70081800），磷酸鹽緩沖液（美侖生物技術(shù)有限公司，貨號：PWL101），檸檬酸鈉抗原修復液（Bioss公司，貨號：C02-02002），EDTA 抗原修復液（BBI 公司，貨號：E673003-0100），3%過氧化氫修復液（北京酷來搏生物科技有限公司，貨號：DZSL30222501）。

1.3.3 藥物制備 ZZDHT 由梔子15 g，大黃3 g，枳實10 g，淡豆豉15 g 組成［14］。按公式：小鼠的正常給藥劑量（g/kg）=成人用藥量（g）/成人標準體質(zhì)量（kg）×9，配制ZZDHT，一劑藥溶于66 mL 蒸餾水中即為ZZDHT 中劑量用藥組［ZZDHT（M）］，溶于33 mL 蒸餾水中，為高劑量用藥組［ZZDHT（H）］，溶于132 mL 蒸餾水中，為低劑量用藥組［ZZDHT（L）］。配制好的藥物放在4 ℃冰箱，備用。

1.3.4 模型制備、給藥與取材 NIAAA 模型小鼠制備［17-18］：C57BL/6J雄性小鼠50只，8周齡，體質(zhì)量20～30 g，SPF級。（1）對照飲食制備：稱量218.8 g對照飲食飼料，加入1 L滅菌純水充分混勻，制備成1 L對照液體飲食。（2）酒精飲食制備：稱量148 g酒精飲食飼料，加入950 mL滅菌純水充分混勻，制備成950 mL的酒精飲食，再加入50 mL無水乙醇混合（保存用于第2天的酒精液體飲食使用時再加入相應(yīng)比例酒精），配制成酒精液體飲食，按照比例每次配制2天用量，除液體飲食外不予其他食物和水。將50只C57BL/6J雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組、模型組、ZZDHT（L）組、ZZDHT（M）組、ZZDHT（H）組，每組10只。對照組和模型組予等量生理鹽水灌胃，各用藥組予相應(yīng)的ZZDHT劑量灌胃。灌胃量為0.1 mL/10 g小鼠體質(zhì)量，在造模當日起給藥，每天1次，給藥時間為10天，第11天稱重后，模型組和用藥組用單劑酒精灌胃（5 g/kg體質(zhì)量）1次，對照組用單劑量麥芽糖糊精灌胃（9 g/kg 體質(zhì)量），灌胃9 h后進行取材，使用3%戊巴比妥鈉（80～100 mg/kg）腹腔注射麻醉后摘眼球取血，斷頸處死后肝臟取材。血液室溫靜置1 h后離心（4 ℃，3 500 r/min，15 min）取上清，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩冸x小鼠肝臟，切取兩塊肝大葉中部約0.5 cm×0.5 cm肝組織分別置于4%多聚甲醛固定和OCT膠液氮速凍，剩余肝組織保存于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 檢測指標及方法

1.3.5.1 小鼠血清生化指標檢測 根據(jù)試劑盒說明書檢測小鼠血清ALT、AST和TG表達水平。

1.3.5.2 小鼠血清和組織ELISA 檢測 將血清稀釋5倍后，在微孔酶標板分別加入樣本和標準品各50 μL，再加入辣根過氧化物酶100 μL，37 ℃恒溫孵育60 min，棄液拍干，洗滌液洗滌5次后，每孔加底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min，加終止液50 μL 并在15 min 內(nèi)于450 nm波長處測定OD值。

1.3.5.3 肝組織qPCR檢測 提取肝組織總RNA，將4 μL的HiScript Ⅱ Q RT SuperMix和16 μL的RNA溶液（1 μg總RNA）制成20 μL的上樣體系，在50 ℃、15 min，85 ℃、5 s的條件下，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。cDNA 與引物和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 混合在95 ℃、2 min，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，40 個循環(huán)的條件下進行擴增，讀取Ct值。以2-△△Ct方法計算結(jié)果。

1.3.5.4 肝組織HE 染色 肝組織固定24 h后，依次經(jīng)過50%乙醇，70%乙醇，90%乙醇，無水乙醇，逐級脫水。二甲苯中透明40 min。包埋，以4 μm 進行切片，貼片。

石蠟切片置于70 ℃烤箱中，烤片1 h，脫蠟，依次通過100%乙醇，90%乙醇，每種醇溶液10 min，進行水化。蘇木素染色2 min，自來水沖洗。伊紅染色液染色20 s，自來水沖洗，鏡下觀察染色情況。中性樹脂封片。

1.3.5.5 肝組織油紅染色 將冰凍切片置室內(nèi)回溫5～10 min，試劑一應(yīng)用液染色10～15 min，37 ℃蒸餾水洗滌5～20 s，試劑二復染液染色3～5 min，蒸餾水洗30～60 s，滴加試劑三水性封固劑進行封片，隨后鏡檢。

1.3.5.6 肝組織髓過氧化物酶（MPO）免疫組化染色石蠟切片進行烤片、脫蠟、水化?？乖迯停簩⑶衅萦?×EDTA/檸檬酸鈉抗原修復液中，再置于微波爐中，高火5 min，低火15 min 修復。室溫冷卻。PBS 洗滌3 次，每次5 min。免疫組化筆畫圈后用3%的過氧化氫阻斷劑封閉30 min。PBS 洗滌3 次，每次5 min。用10% BSA 溶液室溫封閉1 h。一抗4 ℃孵育過夜。室溫平衡20 min。PBS 洗3 次，每次5 min。二抗室溫孵育1 h。PBS 洗3 次，每次5 min。DAB 顯色，蘇木素復染。中性樹脂封片。

1.3.5.7 肝組織超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）檢測［19］稱取肝組織并按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例加入生理鹽水并勻漿，離心取上清液，一部分上清液用BCA 測定蛋白濃度。后續(xù)測定SOD 和MDA。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學分析

2.1.1 ZZDHT 活性成分及ALD 相關(guān)基因的篩選通過TMSP 數(shù)據(jù)庫共檢索得到符合篩選標準活性成分53 個，對應(yīng)227 個靶點。通過GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank上檢索得到ALD相關(guān)基因8 685 個，將兩者取交集后得到222 個藥物-疾病靶點（圖1）。使用Cytoscape3.8.0 軟件對這些靶點進行可視化處理，得到ZZDHT的復方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖（附錄A）。

圖1 ZZDHT和ALD交集靶點venn圖Figure 1 Venn diagram of ZZDHT and ALD intersection target

2.1.2 ZZDHT-ALD 的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和可視化 使用String 平臺中對222 個藥物-疾病靶點進行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并通過Cytoscape3.8.0 軟件CytoNCA 插件對PPI構(gòu)建結(jié)果進行網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析，以BC、CC、DC、EC、LAC、NC 各項得分均大于分數(shù)中位值進行過濾，最終篩選出45 個核心節(jié)點基因，186 條邊。根據(jù)Degree 值的大小對節(jié)點進行排序，排名前10 位的節(jié)點分別為MAPK3、JUN、TP53、MAPK1、RELA、MYC、MAPK14、TNF、FOS、AKT1（附錄B）。

2.1.3 ZZDHT-ALD 的GO 功能分析和KEGG 通路富集分析 通過對45個核心基因進行功能富集分析，結(jié)果顯示45 個核心基因涉及功能和通路與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。其中GO 富集到response to oxygen-containing compound、cellular response to oxygencontaining compound、response to lipid等主要功能，KEGG富集到interleukin-6 signaling、TNF signaling pathway、alcoholic liver disease、inflammatory mediator regulation of TRP channels 和AMPK signaling pathway 等主要通路（圖2、3）。

圖2 核心靶點的GO富集分析圖Figure 2 GO enrichment analysis of core target

圖3 核心靶點的KEGG富集分析圖Figure 3 KEGG enrichment analysis diagram of core target

2.2 非靶代謝組分析 通過對ZZDHT 組小鼠和對照組小鼠肝組織和血清的非靶代謝組分析，以|logFC|>1進行篩選，得到ZZDHT在小鼠肝臟中差異代謝物225個，在血清中差異代謝物227 個，共同代謝物126個（圖4）。

圖4 ZZDHT在肝臟和血清中的差異代謝物交集venn圖Figure 4 Venn diagram of different metabolites of ZZDHT in liver and serum

通過KEGG進行代謝物通路富集分析，結(jié)果顯示，肝 臟 代 謝 物 與Glycerolipid metabolism、Inflammatory mediator regulation of TRP channels、Biosynthesis of unsaturated fatty acids 和Fatty acid biosynthesis 等通路有關(guān)；血清代謝物與AMPK signaling pathway、Oxidative phosphorylation 和Inflammatory mediator regulation of TRP channeis等通路有關(guān)。肝臟和血清中代謝通路均與脂質(zhì)代謝和氧化應(yīng)激緊密相關(guān)（圖5、6）。

圖5 肝臟差異代謝物KEGG富集分析圖Figure 5 Analysis of KEGG enrichment of liver differential metabolite

圖6 血清差異代謝物KEGG富集分析圖Figure 6 Enrichment analysis of serum differential metabolite KEGG

2.3 ZZDHT對NIAAA模型小鼠的調(diào)節(jié)作用

2.3.1 ZZDHT 對NIAAA 模型小鼠肝臟和脾臟的改善 對照組肝臟表面光滑有亮澤，脾臟紅潤，大小適中；模型組小鼠肝臟表面有粗糙顆粒感，脾臟有輕微淤血；ZZDHT（L）組小鼠肝臟表面有輕微粗糙感，脾臟紅潤，大小適中；ZZDHT（M）和ZZDHT（H）組小鼠肝臟表面較光滑，脾臟紅潤，大小適中（圖7）。

圖7 ZZDHT對NIAAA模型小鼠肝臟和脾臟大體觀的改善作用Figure 7 The improvement effect of ZZDHT on the liver and spleen of NIAAA model mice

2.3.2 ZZDHT 降低NIAAA 模型小鼠血清ALT、AST和TG 水平 與對照組相比，模型組小鼠血清AST、ALT 和TG 水平均明顯升高（P值均<0.05），與模型組相比，ZZDHT（L）、ZZDHT（M）和ZZDHT（H）組小鼠血清AST、ALT 和TG 水平均明顯降低（P值均<0.05），各用藥組組間差異無統(tǒng)計學意義（P值均>0.05）（圖8）。

圖8 ZZDHT對NIAAA模型小鼠血清ALT、AST和TG表達水平的調(diào)節(jié)作用Figure 8 The regulatory effect of ZZDHT on the expression level of serum ALT， AST and TG in NIAAA mice

2.3.3 ZZDHT 對NIAAA 模型小鼠肝組織結(jié)構(gòu)的影響 HE 結(jié)果顯示，對照組肝細胞形態(tài)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)正常；模型組見嚴重脂肪變性壞死，組織結(jié)構(gòu)破壞嚴重，可見炎性細胞浸潤；ZZDHT（L）、ZZDHT（M）和ZZDHT（H）組肝細胞脂肪變性和炎癥浸潤明顯輕于模型組，各用藥組組間無明顯差異，ZZDHT（L）組脂肪變性小氣泡略多于其他用藥組（圖9）。

圖9 ZZDHT對NIAAA模型小鼠肝組織結(jié)構(gòu)的影響（HE染色）Figure 9 The effect of ZZDHT on the liver tissue structure of NIAAA model mice （HE staining）

2.3.4 ZZDHT 減少NIAAA 模型小鼠肝臟脂質(zhì)沉積肝組織油紅染色結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組脂肪浸潤明顯加重（P<0.05），與模型組相比，ZZDHT（M）脂肪浸潤明顯減輕（P<0.05）（圖10）。

圖10 ZZDHT對NIAAA模型小鼠肝臟脂質(zhì)沉積的改善作用（油紅染色）Figure 10 Improvement effect of ZZDHT on liver lipid deposition in NIAAA model mice （oil red staining）

2.3.5 ZZDHT 減少NIAAA 模型小鼠肝臟中性粒細胞浸潤 MPO 染色結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組MPO 陽性數(shù)量明顯增多，與模型組相比，ZZDHT（M）組陽性數(shù)量明顯減少（圖11）。

圖11 ZZDHT對NIAAA模型小鼠肝臟中性粒細胞浸潤的改善作用（免疫組化染色）Figure 11 Improvement effect of ZZDHT on liver neutrophil infiltration in NIAAA model mice （IHC staining）

2.3.6 ZZDHT 改善NIAAA 模型小鼠肝臟氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)

2.3.6.1 肝組織 與對照組相比，模型組Ly6g、Ncf1、Ncf2、IL-6、TNF-α、IL-1β 水平均明顯升高（P值均<0.05），與模型組相比，ZZDHT（M）組Ly6g、Ncf1、Ncf2、IL-6、TNF-α、IL-1β 水平均明顯降低（P值均<0.05）（圖12）。與對照組相比，模型組SOD 水平明顯降低（P<0.05），與模型組相比，ZZDHT（M）組SOD 水平明顯升高（P<0.05）；與對照組相比，模型組MDA、4-HNE、Gp91 和P22 水平均明顯升高（P值均<0.05），與模型組相比，ZZDHT（M）組MDA、4-HNE、Gp91 和P22水平均明顯降低（P值均<0.05） （圖13、14）。

圖12 ZZDHT對NIAAA模型小鼠肝臟氧化應(yīng)激和炎性因子的調(diào)節(jié)作用Figure 12 The regulatory effect of ZZDHT on liver oxidative stress and inflammatory factors in NIAAA model mice

圖13 ZZDHT對NIAAA模型小鼠肝臟SOD、MDA和4-HNE蛋白水平的調(diào)節(jié)作用Figure 13 Regulation of ZZDHT on liver SOD， MDA and 4-HNE protein levels in NIAAA model mice

圖14 ZZDHT對NIAAA模型小鼠肝臟Gp91和P22基因水平的調(diào)節(jié)作用Figure 14 Regulation of ZZDHT on Gp91 and P22 gene levels in liver and liver of NIAAA model mice

2.3.6.2 血清 與對照組相比，模型組4-HNE水平明顯升高（P<0.05），與模型組相比，ZZDHT（M）組4-HNE水平明顯降低（P<0.05）。與對照組相比，模型組GSHPx 水平均明顯降低（P<0.05），與模型組相比，ZZDHT（M）組GSH-Px水平均明顯升高（P<0.05）（圖15）。

圖15 ZZDHT對NIAAA模型小鼠血清4-HNE和GSH-Px的調(diào)節(jié)作用Figure 15 The regulatory effect of ZZDHT on serum 4-HNE and GSH-Px in NIAAA model mice

3 討論

梔子大黃湯出自《金匱要略》，為其治療酒疸的方藥，《金匱要略》中原文為“心中懊憹而熱，不能食，時欲吐，名曰酒疸”［13］。酒疸是由于嗜酒傷中，濕熱內(nèi)蘊所致；酒熱傷胃，所以心中懊憹而熱；飲酒過多，助濕蘊熱，影響脾胃的升降，故不能食，時欲吐；濕熱熏蒸肝膽，膽汁外溢肌表而身黃［15］。由此可見，酒疸與嗜酒過度發(fā)病有關(guān)，所以跟ALD 病因一致，同屬一類疾病。酒為濕熱之品，飲酒無節(jié)會導致濕熱之邪內(nèi)蘊，膽熱液溢，浸淫肌膚而發(fā)黃疸。梔子大黃湯由梔子、大黃、淡豆豉和枳實組成，其中梔子，歸心經(jīng)、肺經(jīng)、三焦經(jīng)，有清熱利濕、瀉火除煩的功效，可除酒疸之“心中懊憹而熱”。大黃，歸脾胃經(jīng)、肝經(jīng)、大腸經(jīng)、心包經(jīng)，有清熱瀉下的功用［20］，《金匱要略》原文中有“酒疸，心中熱，欲吐者，吐之愈”，“酒黃疸者，或無熱，靖言了了，腹?jié)M欲吐，鼻燥。其脈浮者先吐之，沉弦者先下之”［21］。大黃因其清瀉之力，可用“沉弦著下之”退盡酒疸之熱毒，而梔子和大黃的通用功效為利膽退黃，祛除黃疸尿赤，“酒疸”屬于“黃疸”一類，病情嚴重者會有身目黃赤之狀，此二味藥可共奏祛黃之效。淡豆豉由遍身濕熱導致的心中懊憹或熱痛，可通過梔子大黃湯的上下分消盡數(shù)消除，淡豆豉、梔子可上清濕熱，枳實、大黃可中泄熱濕，使?jié)駸釓纳?、下（二焦）分消而解。其中酒疸脈浮者，當先吐之，吐之可用淡豆豉；脈沉弦者，當先下之，下之用大黃，因此梔子大黃湯同時兼有吐、下的功能。

隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學的興起與發(fā)展，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法分析中藥復方“多成分-多靶點-多通路”的技術(shù)日益成熟。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法篩選ZZDHT 中化學成分的靶點基因，并與ALD 靶點基因進行映射，發(fā)現(xiàn)222 個交集靶點基因。將這些靶點基因進行GO 富集和KEGG 通路分析、化學成分-靶點-通路及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，探討ZZDHT“多成分-多靶點-多通路”的作用機制。

ALD 因過量飲酒導致，后期體內(nèi)病理變化涉及多基因突變、一系列分子事件的動態(tài)變化，如信號通路活化、炎性細胞聚集、炎性因子過表達及氧化應(yīng)激等。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學分析得出ZZDHT 與ALD 的核心靶點基因多富集在氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)通路，非靶代謝組分析得出ZZDHT 與ALD 核心通路與氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)通路有關(guān)。Chu 等［22］動物和細胞研究顯示，氧化應(yīng)激是導致ALD 的重要原因，具有抗氧化和抗炎作用的藥物才能更有效的保護肝臟。而Ncf1 和Ncf2 是NADPH 氧化酶復合體的重要功能亞基［23-24］。Kim 等［25］動物研究顯示，與抗氧化應(yīng)激相關(guān)基因的缺失會導致小鼠肝損傷。ALD 的發(fā)病機制復雜，但是乙醇的氧化代謝產(chǎn)物ROS 和乙醛在ALD 中起著促進疾病發(fā)生發(fā)展的作用［26］，乙醛同時還促進ROS 的產(chǎn)生，ROS 的增加會誘導氧化應(yīng)激［27］。ALD 的特征之一是肝臟中性粒細胞的浸潤，它通過產(chǎn)生ROS、釋放蛋白酶和產(chǎn)生促炎介質(zhì)來對抗細菌感染，并加重肝細胞損傷、肝臟炎癥和纖維化。酒精會增加中性粒細胞向肝臟的募集，募集的中性粒細胞可以通過其標志物Ly6G和MPO 來檢測到［9］。中性粒細胞募集后釋放有害介質(zhì)，如過氧化氫、彈力酶、氯胺和蛋白酶-3，這些物質(zhì)都與ALD 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［28］。中性粒細胞的移動促進了它們與趨化因子修飾的內(nèi)皮細胞的接觸，從而被誘導激活。完全激活可能是一個由促炎性細胞因子，如TNF-α、IL-1β 和IL-6，啟動的兩個步驟的過程。而中性粒細胞被激活時，會產(chǎn)生大量的ROS 和自由基。有研究表明，AMPK 通路的激活可調(diào)節(jié)自噬，自噬在去除脂滴中起重要作用［29］，活化AMPK可以減少脂質(zhì)堆積［30-31］，促進脂肪酸氧化［32］。有臨床研究［28］表明，IL-6 的活性改變在ALD 的發(fā)展過程中起著重要作用。同時有動物研究［11］顯示，抑制IL-6的表達可改善乙醇誘導的肝損傷。而IL-1β對ALD中的脂肪變性和炎癥反應(yīng)有促進作用［33］。本研究結(jié)果顯示，ZZDHT 能顯著降低ALD 小鼠模型炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 和中性粒細胞相關(guān)指標Ly6g、Ncf1、Ncf2 的水平，同時能顯著改善肝組織SOD、MDA、4-HNE 和血清氧化應(yīng)激指標4-HNE、GSH-Px，有效降低肝臟ALT、AST、TG 水平，提示ZZDHT 可能通過調(diào)節(jié)肝臟炎癥和氧化應(yīng)激狀況，改善ALD。

綜上所述，ZZDHT 可有效改善NIAAA 模型小鼠的肝臟脂質(zhì)沉積和炎癥損傷，非靶向代謝組學結(jié)果提示，ZZDHT 可能通過多條通路干預ALD 小鼠肝臟中氧化應(yīng)激和中性粒細胞浸潤，改善小鼠肝臟狀態(tài)，為后續(xù)進一步研究其具體分子作用機制提供了一定參考方向。

倫理學聲明：本研究方案于2023年2月9日經(jīng)由上海南方模式生物研究中心倫理委員會審批，批號：2023-0003，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：侯逸文負責課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；張榮杰、紀龍珊、李茜參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；高月求、李曼負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。