邱英麒， 王宏偉， 朱宏巖， 於洪亮， 謝 凡， 姜翠寶

1 ?？谑腥嗣襻t(yī)院臨床研究中心， 海口 570208； 2 上海泉生生物工程有限公司， 上海 201401通信作者： 姜翠寶， jiangcuibao@xibaozhiliao.cn（ ORCID： 0000-0001-6213-0829）

肝硬化是由多種原因引起的，形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為彌漫性纖維化、再生結(jié)節(jié)和肝實(shí)質(zhì)及血管結(jié)構(gòu)的扭曲［1-2］。目前的治療手段尚無法全面阻止肝硬化進(jìn)展，終末期階段行異體肝移植亦受到肝源缺乏、并發(fā)癥多、排異反應(yīng)和價格昂貴等諸多因素影響，難以在臨床廣泛應(yīng)用，因此亟須開拓更多新的治療方案［3-5］。干細(xì)胞是一種具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞［6-7］，在特定條件下可誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞［8-11］，為肝硬化的治療提供了新的選擇。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUC-MSC）是一種從人類臍帶中提取的新型間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC），可在體內(nèi)修復(fù)損傷組織和進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，還有多向分化潛能，能夠改善肝硬化模型大鼠的肝功能指標(biāo)及病理學(xué)改變［12］。本研究將探討兩種不同hUC-MSC制劑（冷凍細(xì)胞制劑/新鮮細(xì)胞制劑）通過兩種給藥途徑（門靜脈/尾靜脈）移植對肝硬化大鼠的治療效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 水合氯醛，CCl4（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，國藥編碼：ZA051842、XW05623502），橄欖油（歐麗薇蘭，商品編號：958796），hUC-MSC注射液（浙江泉生生物科技有限公司，批號：QSC1012019101101），40%高脂實(shí)驗(yàn)料（上海普路騰生物科技有限公司，貨號：PSY1102），北京紅星二鍋頭（北京紅星股份有限公司，5 L，56°）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 ES-300-1 包埋機(jī)，ES-300-2C 冷臺（金華市華速科技有限公司），RM2235石蠟切片機(jī)（德國萊卡公司），BX-9030A 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海柏欣儀器設(shè)備廠），DK-8D 三溫三控水槽（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），Countstar Rigel S2 智能一體化熒光分析儀（上海睿鈺生物科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 雄性SD 大鼠［生產(chǎn)許可證編號：SCXK（京）2019-0002，使用許可證編號：SYXK（滬）2018-0027］，6～8 周，220 g 左右，由上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 肝硬化大鼠造模及分組 70 只SPF 級健康雄性SD大鼠隨機(jī)分組：正常組13只，予以普通自來水及普通鼠糧喂養(yǎng)；肝硬化模型組57 只，給予CCl4/橄欖油溶液（體積比1∶1）混合液3 mL/kg，每周2次，皮下多點(diǎn)注射造模，期間給予高脂飼料和10%乙醇水溶液充當(dāng)飲用水，以增強(qiáng)CCl4肝臟毒性效應(yīng)。第8周觀察2組大鼠的生長狀況，取正常組及模型組小鼠各3 只行組織病理學(xué)檢查，明確肝硬化形成。選取50只肝硬化模型組大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、門靜脈（新鮮細(xì)胞制劑）組、門靜脈（冷凍細(xì)胞制劑）組、尾靜脈（新鮮細(xì)胞制劑）組、尾靜脈（冷凍細(xì)胞制劑）組，每組10只。采取大鼠眼眶靜脈血，檢測肝功能指標(biāo)。

1.4.2 大鼠肝硬化模型hUC-MSC 移植 尾靜脈移植組：用75%乙醇反復(fù)擦拭大鼠尾部，使尾靜脈充分顯露，注射0.1 mL細(xì)胞懸液，脫脂棉球輕輕按壓1 min。門靜脈移植組：給予大鼠10%水合氯醛溶液0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，無菌條件下常規(guī)消毒、備皮、鋪巾，選上腹縱切口，暴露肝臟，于門靜脈注入0.1 mL 細(xì)胞懸液，壓迫片刻后關(guān)腹；模型組：給予尾靜脈注射復(fù)方電解質(zhì)液0.1 mL。

給藥方式：尾靜脈注射hUC-MSC，2×107個/kg，1 次/周，連續(xù)4 周；門靜脈注射hUC-MSC，1×107個/kg，共1次。給藥后觀察4周［13-15］。

1.4.3 常規(guī)檢查 所有大鼠每周稱重一次，記錄體質(zhì)量；觀察行為、皮毛和精神狀態(tài)等，了解大鼠大體狀態(tài)。

1.4.4 肝功能檢測 對模型大鼠實(shí)施hUC-MSC 移植術(shù)后4 周（第12 周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時），所有大鼠12 h 禁食后腹主動脈取血各5 mL，3 500 r/min 離心10 min，提取血清。檢測ALT、AST、TBil及ALP水平，了解肝臟合成代謝功能，另外觀察腹腔有無腹水存在。

1.4.5 組織病理學(xué)檢查 移植后4周，大鼠脫頸椎處死后打開腹腔取肝組織，PBS 清洗血跡后，取2塊肝大葉中部約1 cm×1 cm 大小肝組織分別置于10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，行HE、Masson 和天狼星紅染色，觀察病理變化；剩余肝組織取材部分，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以xˉ±s表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量變化 正常組大鼠體質(zhì)量一直保持穩(wěn)定的上升趨勢，模型組和給藥組大鼠體質(zhì)量增加趨勢低于正常組（圖1）。

2.2 第8 周大鼠肝功能指標(biāo)比較 造模第8 周，肝硬化模型組大鼠均出現(xiàn)腹水。正常組和肝硬化模型組大鼠ALT、AST、TBil、ALP 水平對比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均<0.001），且差距較大，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期（表1）。

表1 第8周大鼠肝功能檢測結(jié)果比較Table 1 Comparison of liver function test results of rats at the 8th week

2.3 第8周大鼠的肝組織病理變化 正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝竇無擴(kuò)張，肝細(xì)胞排列正常，肝細(xì)胞正常。肝硬化模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，被粗細(xì)不等的纖維組織包繞，肝細(xì)胞排列紊亂，胞漿疏松，細(xì)胞變性、壞死，可見炎性細(xì)胞浸潤，符合肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)；Masson、天狼星紅染色切片光鏡下可見肝小葉被粗細(xì)不同的纖維組織分隔包繞，形成假小葉（圖2）。

圖2 模型組和正常組的HE、Masson、天狼星紅染色結(jié)果Figure 2 H&E ，Masson and Sirus red staining results of model group and normal group

2.4 第12周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時大鼠肝功能指標(biāo)的變化 5組間大鼠ALT、AST、TBil、ALP 水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均<0.001）（表2、圖3）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示，模型組ALT、AST、TBil、ALP 水平均顯著高于正常組（P值均<0.01）；門靜脈（新鮮細(xì)胞制劑）組、門靜脈（冷凍細(xì)胞制劑）組、尾靜脈（新鮮細(xì)胞制劑）組、尾靜脈（冷凍細(xì)胞制劑）組ALT、AST、TBil、ALP 水平均顯著低于模型組（P值均<0.01）。

表2 第12周大鼠肝功能檢測結(jié)果比較Table 2 Comparison of liver function test results of rats at the 12th week

圖3 第12周終點(diǎn)各組肝功能指標(biāo)結(jié)果比較Figure 3 Comparison the indicators of liver function among groups at the 12th week

2.5 第12 周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時大鼠的肝組織病理變化各組染色結(jié)果見圖4。光鏡下觀察HE染色結(jié)果：正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞形態(tài)正常；模型組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松，發(fā)生少許脂肪變，部分細(xì)胞變性、壞死，炎癥細(xì)胞浸潤，小葉結(jié)構(gòu)分界不清，形成大小不等的多個假小葉結(jié)構(gòu)；門靜脈給藥組有較多肝細(xì)胞脂肪變性，結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)，炎癥細(xì)胞少見；尾靜脈給藥組與門靜脈給藥組結(jié)果相近，但有較多的脂肪變性。

Masson 染色結(jié)果：正常組大鼠幾乎未見藍(lán)色纖維化帶；模型組大鼠可見明顯藍(lán)色纖維化（沉積）條帶；門靜脈給藥組幾乎未見藍(lán)色纖維化帶，僅有少量淺藍(lán)色的著色部分；尾靜脈給藥組仍然存在部分藍(lán)色纖維化帶。

天狼星紅染色結(jié)果：正常組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝竇無擴(kuò)張，肝細(xì)胞排列正常；模型組可見大量肝小葉被粗細(xì)不同的纖維組織分隔包繞，形成假小葉；門靜脈（新鮮細(xì)胞制劑）組和門靜脈（冷凍細(xì)胞制劑）組少見假小葉，肝中央靜脈之間有纖維間隔相連；尾靜脈（新鮮細(xì)胞制劑）組和尾靜脈（冷凍細(xì)胞制劑）組的纖維組織較粗和數(shù)量較多，假小葉稍明顯。

3 討論

目前，臨床尚無肝硬化的根治方法，僅通過病因治療、抗纖維化延緩疾病進(jìn)展［16-17］。在長期以來的研究中，MSC 成為肝硬化或肝纖維化治療的關(guān)注熱點(diǎn)。首先從骨髓MSC 治療肝硬化探索［18］，后續(xù)人臍帶MSC［19-21］、脂肪MSC等［22-24］治療肝硬化的研究相繼出現(xiàn)，且研究結(jié)果積極。既往研究［25］通過大鼠實(shí)驗(yàn)嘗試采用尾靜脈、門靜脈和肝動脈移植骨髓MSC治療肝硬化，結(jié)果顯示不同途徑移植治療效果無顯著差異。而hUC-MSC不僅具有MSC的共性，而且具有更穩(wěn)定的生物學(xué)特性，相對容易獲得，來源豐富，抗原性低，不存在倫理問題，是治療肝纖維化和肝硬化的良好選擇，同種異體來源的MSC注射液使用是安全的［26］。

MSC 移植途徑的選擇，可能直接影響移植細(xì)胞在肝臟內(nèi)的定植［27］，Huang 等［28］研究結(jié)果表明局部給藥（注入靶組織可提高歸巢效率）后，定植在肝臟的干細(xì)胞數(shù)量會比全身給藥多；與靜脈注射MSC 相比，并未產(chǎn)生更好的結(jié)果，這可能與組織和炎癥狀態(tài)有關(guān)［29-30］；以往研究及本研究結(jié)果表明，局部或全身給藥，治療效果無顯著差異。另外有關(guān)資料［31］顯示：新鮮分離的MSC具有較強(qiáng)的歸巢效率和組織修復(fù)作用，而臨床試驗(yàn)中使用的MSC通常是低溫保存的，這損害了MSC的歸巢能力，縮短了其在體內(nèi)和組織修復(fù)的耐久性。有文獻(xiàn)［32］報(bào)道：新鮮培養(yǎng)的和低溫保存的骨髓MSC 在臨床前的體內(nèi)原代效力和體外傳代效力結(jié)果之間沒有顯著差異。局部和全身給藥的干預(yù)效果相近；冰凍保存后對干細(xì)胞歸巢和修復(fù)作用有一定影響，但是療效和新鮮細(xì)胞制劑相比無明顯差異。所以從使用的方便性、安全性與簡繁程度來看，靜脈給予冷凍制劑是符合臨床應(yīng)用需要的，也可能是未來干細(xì)胞制劑的主要類型之一。

hUC-MSC治療肝硬化的可能機(jī)制主要基于細(xì)胞的旁分泌作用、轉(zhuǎn)分化能力［33］和免疫調(diào)節(jié)功能［34］。其中報(bào)道較多是通過TGF-β1/Smad類似信號通路以旁分泌方式發(fā)揮抗纖維化功能［35-36］，抑制TGFβ1/Smad信號通路的激活，起到抗纖維化作用。

綜上，hUC-MSC移植是一種有效的治療肝硬化的方法。經(jīng)外周靜脈途徑移植或門靜脈注射移植（冷凍細(xì)胞制劑和新鮮細(xì)胞制劑）均可有效改善肝硬化，且兩種移植途徑和兩種細(xì)胞制劑治療效果無明顯差異。但結(jié)合實(shí)際臨床操作的難易程度及治療費(fèi)用等問題，更傾向于選擇外周靜脈途徑移植冷凍細(xì)胞制劑。隨著未來更多深入的研究，hUC-MSC有望在肝硬化的治療方面發(fā)揮更大作用，成為肝硬化治愈的希望所在，并為以后臨床應(yīng)用提供參考和依據(jù)。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2018年11月12日經(jīng)由上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審批，批號：20181112，符合實(shí)驗(yàn)室動物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：邱英麒負(fù)責(zé)課題研究和設(shè)計(jì)；姜翠寶負(fù)責(zé)研究數(shù)據(jù)收集分析，論文撰寫；謝凡、朱宏巖參與研究數(shù)據(jù)的獲取分析解釋過程；王宏偉提供指導(dǎo)意見，以及論文修改與定稿；於洪亮負(fù)責(zé)文章校核與修訂。