謝文濤， 魚康康， 程 琦， 李 寧

復旦大學附屬華山醫(yī)院感染科， 上海市傳染病與生物安全應急響應重點實驗室， 國家傳染病醫(yī)學中心，上海 200040

肝纖維化是病毒感染、酒精與代謝紊亂等慢性肝損傷導致的肝內膠原等細胞外基質過度沉積，引起的肝臟結構及功能異常［1］。肝星狀細胞（HSC）的活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)?；罨腍SC 是肝纖維化過程中細胞外基質的主要來源，因而抑制HSC活化是控制肝纖維化的關鍵。

microRNA（miRNA）通過表觀遺傳的方式參與基因表達調控，在HSC的活化過程中起重要作用。本課題組既往研究［2-3］發(fā)現(xiàn)，血清miR-223-3p 的表達有助于肝硬化無創(chuàng)診斷；隨著纖維化從S0～S2（早期纖維化）發(fā)展到S3～S4（晚期纖維化），血清miR-223-3p 水平顯著下調。但miR-223-3p 在HSC 活化中的作用仍不明確。因此，本研究使用轉化生長因子β（TGF-β）建立活化的HSC模型，初步闡明了miR-223-3p抑制HSC活化的作用機制，為肝纖維化的治療提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝星狀細胞系LX2 來自復旦大學基礎醫(yī)學院病原生物系吳健課題組饋贈；293T細胞系由本課題組保存；胎牛血清購自Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基、Trypsin-EDTA、Pen-Strep Solution購自BI公司；定量PCR引物由北京擎科生物有限公司合成；cDNA 第一鏈合成預混試劑及熒光定量預混試劑購自天根生化科技有限公司；miR-223-3p 模擬物（miR-223-3p）及對照模擬物（mimic NC）、兔抗微管相關蛋白1B（microtubuleassociated protein，MAP1B）的商品化siRNA、miR-223-3p定量PCR 引物及內參引物均由廣州銳博生物公司合成；TGF-β 購自PeproTech 公司；小鼠抗平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體、兔抗Ⅰ型膠原（COLIA1）抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗小鼠IgG及HRP標記的山羊抗兔IgG 購自Abcam 公司；小鼠抗GAPDH 單克隆抗體購自Proteintech公司、兔抗MAP1B購自Abclonal公司；miRNA 轉染試劑INTERFERin 購自Polyplus 公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑購自Promega公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將LX2細胞及293T細胞置于5% CO2培養(yǎng)箱，37 ℃恒溫培養(yǎng)，使用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基。

1.2.2 HSC 活化模型的建立 將處于對數(shù)生長期的LX2細胞，胰酶消化并計數(shù)，取適量細胞接種于12孔細胞培養(yǎng)板過夜，待細胞匯合度達到70%左右時，每孔加入濃度為10 ng/mL的TGF-β，在5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)刺激24 h，建立HSC活化模型。

1.2.3 過表達miR-223-3p 在細胞加入TGF-β 刺激8 h 后，將細胞分為miR-223-3p mimic 組及mimic NC對照組，使用不含胎牛血清及抗生素的DMEM 培養(yǎng)基配制轉染體系，分別轉染miR-223-3p 及mimic NC，轉染濃度為50 nmol/L，轉染試劑為INTERFERin?；24 h后觀察細胞狀態(tài)并換用新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集蛋白及RNA。

1.2.4 實時熒光定量PCR 檢測LX2 細胞的α-SMA、COLIA1、MAP1B 及miR-223-3p 的mRNA 表達 細胞根據(jù)以上方式處理后，提取總RNA 并定量，分別使用天根生化的cDNA 第一鏈合成試劑盒及增強型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒經(jīng)逆轉錄獲得mRNA及miRNA 的cDNA，使用天根生化熒光定量預混試劑盒（SYBR Green）及增強型miRNA 熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）進行熒光定量PCR。α-SMA 正向引物為：5′-AAGTACCCGATAGAACATGGC-3′，反向引物 為：5′-CTCTTCAGGGGCAACACGAA-3′；COLIA1正向引物為：5′-GAGGGCCAAGACGAAGACATC-3′，反向引物為：5′-CAGATCACGTCATCGCACAAC-3′；MAP1B 的正向引物為：5′-GTCCACCTCGCCTAGCCTG-3′，反向引物為：5′-CCTTGCCTTCCTTCTTAATGACT-3′；GAPDH正向引物為：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，反向引物為：5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。根據(jù)公式2-ΔΔCt計算LX2 細胞中各組mRNA 及miRNA 的相對表達量。

1.2.5 Western Blot 法 檢 測LX2 細 胞 中α-SMA、COLIA1 及MAP1B 的蛋白表達 用裂解液提取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離，將蛋白濕轉到NC 膜上。用1×TBST配置的5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入鼠抗GAPDH（1∶10 000）抗體、鼠抗α-SMA（1∶2 000）抗體、兔抗COLIA1（1∶2 000）抗體及兔抗MAP1B（1∶2 000）抗體。4 ℃搖床過夜，1×TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入HRP 標記的山羊抗兔IgG（1∶5 000）或HRP 標記的山羊抗小鼠IgG（1∶5 000），室溫孵育1 h。1×TBST洗膜3次，每次10 min。使用ECL發(fā)光液于Tanon4600化學發(fā)光儀器上檢測化學發(fā)光并拍照。

1.2.6 細胞免疫熒光驗證過表達miR-223-3p 對HSC活化標志物的影響 將miR-223-3p mimic轉染至LX2細胞，48 h 后固定、封閉，后使用α-SMA 及COLIA1 一抗孵育，PBS 洗滌后孵育相應熒光二抗，PBS 洗滌后，最后使用DAPI 染細胞核并制片，至熒光顯微鏡下觀察，放大20倍后制圖。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因驗證MAP1B是miR-223-3p 的靶基因 采用microT-CDS、miRDB 和TargetScan三個在線軟件預測miR-223-3p 的靶基因，選取交叉部分有146 個潛在靶基因，在146 個潛在靶基因與活化的HSC中表達上調的基因中取交集，得到15個潛在靶基因，MAP1B 在其中表達水平最高。在Sac1 與Xho1酶切位點之間將MAP1B 3′UTR 與miR-223-3p 的相互作用序列連接至pGL3載體，作為MAP1B-WT質粒；將MAP1B 3′UTR 片段點突變后同樣按照以上方式連接至pGL3 載體，作為MAP1B-Mutant 質粒。將MAP1BWT 載體或MAP1B-Mutant 載體、pRL-TK 內參質粒與miR-223-3p或mimic NC 共轉染，轉染24 h后按照雙熒光素酶試劑盒說明書測細胞的熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計分析，兩組間比較采用成組t檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 活化的HSC中miR-223-3p表達下調 對GEO數(shù)據(jù)庫中GSE67664 數(shù)據(jù)集進行分析，篩選在HSC 活化前后差異明顯的miRNA，結果發(fā)現(xiàn)，miR-223-3p 在HSC 活化后表達量明顯下降（圖1a）；通過10 ng/mL 的TGF-β 刺激肝星狀細胞系LX2，Western Blot 結果顯示，TGF-β能夠上調HSC活化標志物α-SMA（t=35.25，P<0.001）、COLIA1（t=8.64，P<0.01）的蛋白表達，證實TGF-β 能夠誘導HSC 活化（圖1b）；實時熒光定量PCR結果顯示，與靜息狀態(tài)相比，活化狀態(tài)的HSC 內miR-223-3p表達量顯著下降（t=9.12，P<0.001）（圖1c）。

圖1 miR-223-3p在HSC活化后表達下降Figure 1 miR-223-3p expression decreased during HSC activation

2.2 過表達miR-223-3p 能夠抑制HSC 活化 使用TGF-β 刺激LX2 細胞8 h 后，將miR-223-3p mimic 及mimic NC 轉染至LX2 細胞，72 h 后提取細胞蛋白及RNA 或24 h 后轉鋪至12 孔板做免疫熒光實驗。實時熒光定量PCR 結果顯示，與對照組相比，上調miR-223-3p 表達后，HSC 活化標志物α-SMA（t=8.35，P<0.01）、COLIA1（t=12.23，P<0.01）的mRNA 水平明顯下降（圖2a、b）；Western Blot 及免疫熒光檢測結果顯示，與對照組相比，HSC 活化標志物α-SMA（t=16.24，P<0.001）、COLIA1（t=20.90，P<0.001）蛋白表達水平明顯降低（圖2c、3）。

圖2 miR-223-3p對 HSC活化的影響Figure 2 Effect of miR-223-3p on the activation of HSC

圖3 細胞免疫熒光驗證過表達miR-223-3p對HSC活化標志物的影響Figure 3 Effect of overexpression of miR-223-3p on hepatic stellate activation markers verified by cellular immunofluorescence

2.3 驗證MAP1B 是miR-223-3p的靶基因 通過在線軟件預測miR-223-3p 的靶基因，結果顯示，miR-223-3p與MAP1B 3′UTR存在互補位點（圖4a）；雙熒光素酶報告基因實驗表明，與對照組相比，過表達miR-223-3p使得轉染MAP1B-WT 質粒細胞的熒光素酶活性明顯下降（t=9.52，P<0.001），但對轉染MAP1B-Mutant質粒細胞的熒光素酶活性無明顯影響（P>0.05）（圖4b）。將siMAP1B 及siNC 轉染至LX2 細胞，提取細胞蛋白，Western Blot 檢測結果顯示，與對照組相比，轉染siMAP1B能成功抑制LX2細胞MAP1B的表達（t=6.28，P<0.001），HSC 活化標志物α-SMA（t=7.23，P<0.001）、COLIA（t=4.00，P<0.01）蛋白表達水平明顯降低（圖5a）；TGF-β 刺激LX2 細胞8 h 后，將miR-223-3p mimic及mimic NC 轉染至LX2細胞，提取細胞RNA及蛋白，實時熒光定量PCR和Western Blot檢測結果顯示，與對照組相比，過表達miR-223-3p 的LX2 上MAP1B的mRNA表達（t=5.95，P<0.01）及蛋白表達（t=11.12，P<0.001）水平均顯著降低（圖5b、c）。

圖5 抑制MAP1B對HSC活化的影響Figure 5 Effect of MAP1B inhibition on HSC activation

3 討論

HSC 的活化是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。既往研究［4］報道了自噬、內質網(wǎng)應激、氧化應激、膽固醇代謝及表觀遺傳學等多種途徑和介質調控HSC的激活。損傷的上皮細胞、纖維化的組織微環(huán)境、免疫和系統(tǒng)代謝失調、腸道生物失調和肝炎病毒產(chǎn)物的旁分泌信號也可以直接或間接地誘導HSC的激活［5］。

近年來，許多研究［6］表明miRNA 在肝纖維化的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，miRNA 可影響肝纖維化形成的不同階段，包括HSC 的激活、增殖、遷移和細胞外基質沉積。本課題組發(fā)現(xiàn)miR-29抑制HSC激活，被鑒定為抗纖維化miRNA［7］。與miR-29 類似，miR-19b 在激活的HSC 中顯著下調，通過抑制TGF-βRⅡ的表達，影響HSC 活化［8-9］；miR-21 通過激活PTEN/Akt 信號通路增強HSC 活性［10］；TGF-β 誘導miR-199 表達上調［11］。miR-223-3p的表達與肝纖維化的發(fā)展有關［12］，在乙型肝炎相關肝纖維化中，血清miRNA 從早期肝纖維化（S0～S2）至晚期肝纖維化（S3～S4）呈逐漸下降的趨勢［2］。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-223-3p 在活化的HSC 內表達下降，并確定過表達miR-223-3p可抑制HSC活化標志物α-SMA和COLIA1的表達。為了進一步研究miR-223-3p調控HSC 活化的機制，通過生物信息學預測MAP1B為miR-223-3p 的靶基因。過表達miR-223-3p 可降低MAP1B的mRNA及蛋白表達，雙熒光素酶報告基因實驗進一步證實，miR-223-3p 能夠與MAP1B mRNA 靶向結合。進一步發(fā)現(xiàn)，抑制MAP1B 的表達可以抑制HSC 活化標志物α-SMA 和COLIA1 的表達。MAP1B是一種微管相關蛋白，是一種主要的細胞骨架蛋白，參與多種細胞活動，包括基于肌動蛋白的細胞運動、分子運輸、自噬和癌癥［13-14］。已有研究報道了自噬對HSC 激活的重要作用，HSC 內脂滴耗竭是HSC 活化的重要特征［5］，而自噬驅動HSC 內的脂質在溶酶體內降解［15-16］，通過Atg7 敲除鼠，證明了抑制自噬減少纖維化的形成和細胞外基質產(chǎn)生［15］。自噬也被報道調節(jié)胚胎、肺和腎成纖維細胞纖維化基因的表達［15］。MAP1B 對HSC 活化的影響可能與自噬相關，后續(xù)需實驗對此進行深入探究。

總之，miR-223-3p 可明顯抑制TGF-β 誘導的HSC活化，這一作用可能通過靶向抑制MAP1B 實現(xiàn)，但MAP1B如何調控HSC活化，仍需進一步探究。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：謝文濤負責實驗操作，撰寫論文；魚康康負責課題設計，指導并修改論文；程琦負責指導實驗，修改論文；李寧負責課題設計，指導撰寫論文并定稿。