孫 兵,岳世國

孫兵,岳世國,金華市中醫(yī)醫(yī)院外二科 浙江省金華市 321017

0 引言

結腸癌為臨床常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,近年來,受人口老齡化趨勢、國民飲食習慣及結構改變等影響,其發(fā)病率不斷攀高,且以每年4.2%速率遞增[1-3].結腸癌惡性程度較高,病理特征是影響其治療決策及預后的重要因素[4,5],因此,探究影響結腸癌病理特征的分子標志物尤為關鍵.微小RNA(miRNA)作為一類內源性非編碼小分子RNA,不僅在正常細胞生物學行為中發(fā)揮重要作用,還參與調控腫瘤細胞增殖、分化及凋亡等過程[6-8].相關研究指出,miR-302b-3p在結腸癌中表達過低,可能扮演抑癌基因角色[9],但關于其與病理特征及預后關系的研究并不常見.長鏈非編碼RNA(LncRNA)是近年來發(fā)現的一類RNA分子,可作為分子海綿體與染色質修飾因子或miRNA相結合,調控靶基因表達[10,11].研究指出,LncRNA母系印記基因3(MEG3)在卵巢癌、胰腺癌及腎上腺癌等多種腫瘤細胞中表達缺失,可能發(fā)揮抑癌基因功能[12,13].LncRNA MEG3、miR-302b-3p均為抑癌基因,關于二者在惡性腫瘤中是否存在協(xié)同效應尚無研究.基于此,本研究觀察結腸癌組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達,探究其與臨床分期的關系及對預后的指導價值,并分析其交互作用對結腸癌復發(fā)的影響,旨在為結腸癌治療提供參考.

1 材料和方法

1.1 材料 選取2017-01/2022-03金華市中醫(yī)醫(yī)院97例結腸癌患者,其中男55例,女42例,年齡43-77(62.87±5.25)歲.入組標準: 納入標準: 均符合結腸癌診斷標準[14],并經術后病理學證實;年齡＞18歲,既往無腫瘤相關治療史;知情、同意本研究.排除標準: 合并其他惡性腫瘤者;轉移性結腸癌者;結腸多原發(fā)癌或息肉、結腸轉移癌、腺瘤樣結腸癌者;伴有心、腎或肝等重要器官功能障礙者;合并免疫或血液系統(tǒng)疾病者;伴有潰瘍性結腸炎、克羅恩病等結腸疾病者;合并新冠肺炎者;因疫情封控或其他原因中斷隨訪者.

1.2 方法 LncRNA MEG3、miR-302b-3p檢測: 取術中切除結腸癌組織及癌旁組織標本,以熒光定量PCR法檢測,Trizol法提取細胞總RNA,反轉獲取cDNA,上機進行PCR檢測,反應條件設置為: 預變性95 ℃、2 min,變性95℃、30 s,退火60 ℃、30 s,延伸72 ℃、30 s,循環(huán)40次.比較閾值法定量分析數據,LncRNA MEG3、miR-302b-3p分別以GAPDH、U6為內參基因,檢測基因相對表達量=2-ΔΔCt.

結腸癌治療及預后: 97例結腸癌患者均接受根治性手術治療,并進行為期1年隨訪,隨訪方式為門診復查,3個月/次,隨訪終點為腫瘤復發(fā),針對疑似復發(fā)腫瘤進行穿刺活檢,確認是否復發(fā).根據結腸癌患者1年內復發(fā)情況判定預后.1.3 觀察指標 觀察比較不同組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達,分析LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達與臨床病理特征的相關性;比較不同LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達患者復發(fā)情況,分析結腸癌術后復發(fā)影響因素,評價LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達對結腸癌術后復發(fā)的預測價值.

統(tǒng)計學處理SPSS 23.0分析,計量資料用(mean±SD)表示,t檢驗,多組間比較用單因素方差分析,兩兩比較用LSD-t檢驗,計數資料用n(%)表示,卡方檢驗,卡普蘭-邁耶曲線(K-M)比較不同LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達患者復發(fā)情況,采用Cox回歸模型分析復發(fā)影響因素,相乘、相加模型分析LncRNA MEG3、miR-302b-3p交互作用對結腸癌復發(fā)的影響,繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達對結腸癌術后復發(fā)的預測價值.P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達 結腸癌組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達均低于癌旁組織(P＜0.05).表1.

表1 不同組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達比較(mean±SD)

2.2 LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達與臨床病理特征的相關性 對LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達與臨床病理特征進行相關性分析顯示,結腸癌組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達與性別、年齡、腫瘤大小無關(P＞0.05),與分化程度、臨床分期及淋巴結轉移有關(P＜0.05).表2.

表2 LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達與臨床病理特征的相關性

2.3 復發(fā)情況 結腸癌患者以中位值為界,分為高表達組與低表達組,結腸癌組織中LncRNA MEG3、miR-302b-3p高表達組1年內復發(fā)率分別為2.70%(1/37)、5.00%(2/40),分別低于LncRNA MEG3、miR-302b-3p低表達組20.00%(12/60)、19.30%(11/57),差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05).圖1.

圖1 無復發(fā)K-M曲線.K-M曲線: 卡普蘭-梅爾曲線.

2.4 復發(fā)相關因素的Cox分析 以結腸癌患者1年內復發(fā)為因變量,分化程度、臨床分期、淋巴結轉移及癌組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達為自變量,賦值(表3),進行Cox回歸分析,結果顯示,分化程度、臨床分期、淋巴結轉移均為結腸癌復發(fā)危險因素,癌組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達均為結腸癌復發(fā)保護因素(P＜0.05).表4.

表3 賦值量表

表4 復發(fā)相關因素的Cox分析

2.5 LncRNA MEG3、miR-302b-3p交互作用對結腸癌復發(fā)的影響

2.5.1 LncRNA MEG3、miR-302b-3p交互作用對結腸癌復發(fā)的影響: 以結腸癌復發(fā)為因變量,將LncRNA MEG3、miR-302b-3p及二者乘積作為自變量納入回歸方程,構建模型1、模型2.校正混雜因素后發(fā)現,LncRNA MEG3、miR-302b-3p均對結腸癌復發(fā)有影響(P＜0.05);LncRNA MEG3與miR-302b-3p間并無相乘交互效應,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05).表5.

表5 相乘交互作用

2.5.2 LncRNA MEG3、miR-302b-3p交互作用對結腸癌復發(fā)的影響: 以LncRNA MEG3＜中位值、miR-302b-3p＜中位值為暴露,否則為非暴露.LncRNA MEG3、miR-302b-3p同時暴露的協(xié)同效應是LncRNA MEG3或miR-302b-3p單純暴露產生效應的15.888倍,且二者同時暴露時,結腸癌復發(fā)風險中有56.98%歸因于二者協(xié)同作用.表6.

2.6 LncRNA MEG3、miR-302b-3p對結腸癌復發(fā)的預測價值 以癌組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達為源數據,結腸癌患者術后1年內復發(fā)為陽性,未復發(fā)為陰性,繪制ROC曲線,結果顯示,LncRNA MEG3、m i R-302b-3p預測結腸癌患者復發(fā)的曲線下面積(area under the curve,AUC)(95%CI)分別為0.720(0.620-0.807)、0.767(0.670-0.847),二者聯(lián)合預測AUC(95%CI)為0.892(0.813-0.946),明顯高于LncRNA MEG3、miR-302b-3p單獨預測,最佳敏感度及特異度分別為92.31%、83.33%.圖2.

圖2 LncRNA MEG3、miR-302b-3p預測結腸癌復發(fā)的ROC曲線. ROC曲線: 受試者工作特征曲線.

3 討論

miRNA表達異常可誘發(fā)腫瘤等多種疾病,隨著生物信息技術不斷優(yōu)化,miRNA成為腫瘤治療靶點.迄今為止,已發(fā)現500多個人類基因組中的miRNA廣泛參與惡性腫瘤發(fā)生、腫瘤細胞增殖及凋亡等病理生理過程[15,16].研究顯示,部分miRNA發(fā)揮抑癌基因作用,其在腫瘤細胞或組織中表達缺失或低表達,調控miRNA表達為腫瘤治療新方向[17,18].本研究中結腸癌組織miR-302b-3p表達低于癌旁組織,提示miR-302b-3p可能為結腸癌抑癌基因.相關功能學分析指出,miR-302b-3p可通過與ERBB4的3’-非編碼區(qū)域結合,致使ERBB4表達下調,從而影響細胞增殖、侵襲,并加速凋亡進程,發(fā)揮抑癌基因作用[19,20].在一項miR-302b在結腸癌組織的研究中顯示,miR-302b在低分化、有淋巴結轉移及遠處轉移的結腸癌患者中表達顯著低于分化較好、無淋巴結轉移及遠處轉移患者[21].進一步研究顯示,miR-302b-3p表達與分化程度、臨床分期及淋巴結轉移有關(P＜0.05),提示結腸癌患者癌組織miR-302b-3p表達與病理特征有關,miR-302b-3p表達下調預示著更強的腫瘤侵襲性,推測可作為結腸癌預后預測指標.

LncRNA作為繼miRNA后發(fā)現的非編碼RNA,同樣在人類疾病中發(fā)揮至關重要作用,尤其是在腫瘤發(fā)生、演變過程中扮演重要角色[22].LncRNA調控基因表達涉及表觀遺傳、轉錄及轉錄后三個層面,主要通過轉錄激活、染色體修飾及干擾等方式調控[23,24].作為首個被發(fā)現具有腫瘤抑制作用的LncRNA,MEG3在人體正常組織中表達較高,特別是在腦垂體中表達最高,但在多種腫瘤細胞系中表達較少或缺乏[25].既往文獻表明,LncRNA MEG3可促使細胞循環(huán)停滯,對腫瘤細胞增殖及侵襲行為發(fā)揮抑制作用,并可促進腫瘤細胞凋亡,阻礙腫瘤的發(fā)生[26].現階段,臨床認為LncRNA MEG3發(fā)揮抑癌作用的途徑較多,其中DNA甲基化、影響血管新生、p53途徑及Rb途徑等已經研究證實,致使LncRNA MEG3基因沉默或表達下調,造成正常細胞增殖異常發(fā)生癌變[27,28].有學者指出,結腸癌患者癌組織LncRNA MEG3表達明顯下調[29,30],與本研究結果一致,充分說明其在結腸癌中發(fā)揮抑癌基因作用,且本研究中LncRNA MEG3表達與分化程度、臨床分期及淋巴結轉移有關(P＜0.05),提示LncRNA MEG3表達與結腸癌患者病理特征有關,而病理特征是影響患者預后的重要因素,因此,本研究認為LncRNA MEG3表達可能與結腸癌患者預后有關.

本研究中結腸癌組織中LncRNA MEG3、miR-302b-3p高表達組1年內復發(fā)率分別低于LncRNA MEG3、miR-302b-3p低表達組,且Cox回歸分析顯示,癌組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達均為結腸癌復發(fā)保護因素,提示LncRNA MEG3、miR-302b-3p可能是結腸癌復發(fā)的重要預測指標.此外,本研究還顯示,LncRNA MEG3與miR-302b-3p存在交互作用,可增加結腸癌術后復發(fā)風險,推測LncRNA MEG3可通過miR-302b-3p促進結腸癌增殖、侵襲和遷移,從而參與結腸癌發(fā)生發(fā)展過程,但其具體機制不明,有待臨床進一步研究證實.基于LncRNA MEG3、miR-302b-3p對結腸癌預后的交互作用,以癌組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達為源數據,結腸癌患者術后1年內復發(fā)為陽性,未復發(fā)為陰性,繪制ROC曲線,結果顯示二者聯(lián)合預測AUC最大,為0.892,最佳敏感度及特異度分別為92.31%、83.33%,具有良好預測效能.

4 結論

綜上所述,結腸癌患者癌組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達下調,與臨床分期有關,臨床檢測其表達可用于明確腫瘤惡性程度、預測手術治療預后,為臨床后續(xù)治療方案調整提供參考依據.但本研究尚存在一定不足,受限于科研經費等問題,未進行長期隨訪,且缺乏細胞實驗、動物實驗,有待臨床日后延長隨訪時間,增設細胞實驗及動物實驗,進一步證實二者協(xié)同效應對預后的影響.

文章亮點

實驗背景

結直腸癌發(fā)病率高,病程惡化快,僅通過常規(guī)篩查較難早發(fā)現早治療,長非編碼RNA與微小RNA在腫瘤的不同時期都會發(fā)生表達變化,適宜早發(fā)現,對患者的治療和預后均有一定影響.

實驗動機

在結腸癌中miR-302b-3p表達較低,LncRNA母系印記基因3(MEG3)在卵巢癌、胰腺癌及腎上腺癌等多種腫瘤細胞中表達缺失,表明這兩種RNA與癌癥的發(fā)生與發(fā)展有著一定的聯(lián)系.

實驗目標

miR-302b-3p與LncRNA MEG3均與癌癥的抑制有較大的關系,但是在結直腸癌的不同臨床分期以及手術預后中是否存在差異性,且二者是否在結直腸癌中表現出協(xié)同效應,對結直腸癌患者的診斷具有重要意義.

實驗方法

通過經典的分子檢測方法對癌癥患者的組織樣本進行核酸提取和檢測,分析表達的差異性,并對術后患者進行定期隨訪,了解預后情況.

實驗結果

結腸癌組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達均低于癌旁組織,結腸癌組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達與分化程度、臨床分期及淋巴結轉移有關,二者聯(lián)合預測曲線下面積(95%CI)明顯高于LncRNA MEG3、miR-302b-3p單獨預測.

實驗結論

結腸癌患者癌的LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達,與臨床分期有一定的關系,可作為判斷癌癥惡性進展和預測手術治療預后的檢測標志物,為臨床的治療提供參考.

展望前景

LncRNA MEG3、miR-302b-3p在結直腸癌患者中同時檢測可以更靈敏發(fā)現臨床分期.但是本研究仍存在一定的缺陷,如長期隨訪時間較短,缺少臨床前實驗的支持等.接下來重點補充臨床前實驗的事實和數據,以期更好地驗證說明LncRNA MEG3、miR-302b-3p在結直腸癌分期檢測中的重要性.