常子惠，尼瑪央宗，黃海皎，拉巴扎西，高小麗，田朋佳，尹中江

（西藏自治區(qū)農牧科學院農業(yè)研究所，西藏 拉薩 850000）

苦蕎麥Fagopyrum tataricum（L.） Gaertn.為1年生草本植物，隸屬于蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum），原產于中國西南地區(qū)高寒地帶，現(xiàn)我國西北、西南、東北、華北都有種植?？嗍w是藥食同源的小宗雜糧作物，富含黃酮類物質，其中蘆丁含量占黃酮含量的80%～90%［1］，而黃酮類物質因其廣泛的降糖、降壓、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等生物活性一直是研究的熱點［2］，蘆丁更是被廣泛報道其抗腫瘤活性，具有廣闊的抗腫瘤前景［3］。胰腺癌（Pancreatic cancer，PC）作為消化系統(tǒng)中的惡性腫瘤之一，一經發(fā)現(xiàn)往往就已是晚期，只能采用化學療法和放射療法進行治療，不僅完全治愈的可能不大，而且還有極大的副作用，因此，胰腺癌的早期篩查和預防就顯得十分重要。目前有不少與苦蕎抗腫瘤相關的報道，夏翱文［4］就報道過miRNA-877-3p 介導苦蕎黃酮抗胰腺癌的活性作用研究，可見苦蕎對抗擊胰腺癌有一定的效果。

利用網絡藥理學方法可以將藥物潛在靶點與疾病靶點相互聯(lián)系起來，從而揭示藥物活性成分、疾病及相關信號通路之間的互作關系。分子對接以受體特性以及受體與藥物分子之間相互作用方式為依據，通過計算機技術進行模擬對接，可以展現(xiàn)配體和受體分子在結合過程中的構象變化。由于在線的TCMSP 數據庫中未包括苦蕎的化學成分信息，因此，利用文獻檢索方法確定苦蕎化學成分，通過化合物CAS 號在TCMSP 數據庫查詢潛在的藥物作用靶點，實施網絡藥理學分析與分子對接，預測苦蕎對胰腺癌的作用機制。

結合西藏蕎麥目前的研究及育種工作，根據國內研究發(fā)展趨勢，立足自身條件，針對當前存在的許多基礎薄弱環(huán)節(jié)、研究不足等問題，從當前不同需求出發(fā)，制訂初、中、高級目標，解決制約產量穩(wěn)定提升的問題，并選育出高黃酮含量的品種（系），以滿足不同使用需求，加快符合西藏農業(yè)發(fā)展新需求，及時解決新問題。

1 資料與方法

1.1 數據庫平臺

本研究采用的數據庫平臺見表1。

表1 數據庫平臺

1.2 方法

1.2.1 檢索化合物潛在的靶點與胰腺癌相關靶點

利用文獻查找到苦蕎化合物的成分信息，通過化合物的CAS 號可在TCMSP 中獲得化合物的MOLID、潛在的作用靶點及相關基因名［5］，再將得到的靶點與Uniport 數據庫比對進行gene 名稱標準化。在GeneCards數據庫可獲得胰腺癌相關靶點的gene 名稱［6］，將化合物靶點和疾病相關靶點取交集分析，得到的交集靶點信息可分析苦蕎對胰腺癌的拮抗機制。

1.2.2 靶標蛋白互相作用核心網絡的構建

將所得的公共靶基因在STRING 數據庫進行PPI 網絡分析，隱藏游離靶點，蛋白互作分值設為0.4，導出TSV 格式文件，導入Cytoscape 3.7.1 軟件構建蛋白互作網絡［7］。

1.2.3 化合物-靶點-通路網絡

利用Cytoscape 3.7.1軟件對化合物、靶點、通路信息進行化合物-靶點-通路網絡的構建。

1.2.4 靶點通路分析

運用R 語言ClusterProfiler 包對交集靶點進行GO 功能富集分析，可獲得交集靶點生物過程（Biological process，BP）、細胞組成（Cell composition，CC）、分子功能（Molecular function，MF）信息，以p＜0.05 加以篩選，繪制各類別排名前10 的GO 條目柱狀圖及KEGG前20條信號通路氣泡圖。

1.2.5 分子對接

使用Cytoscape 3.7.1軟件對構建的蛋白互作網絡和化合物-靶點-通路網絡進行分析，根據蛋白互作網絡分析結果選擇degree 值靠前的靶點蛋白和化合物-靶點-通路網絡中degree 值靠前的化合物為分子對接對象。分別從PDB 數據庫和Pub-Chem 數據庫下載上述篩選出的靶點蛋白及關鍵化合物的蛋白質晶體結構和化合物結構文件，利用CB-Dock網絡平臺對靶點與化合物進行對接［8］。

2 結果與分析

2.1 苦蕎的活性成分

以1.2.1 方法搜集苦蕎的活性成分，主要活性化合物為黃酮類物質，基本信息見表2。

表2 苦蕎活性成分的基本信息

2.2 苦蕎與胰腺癌的相關靶點

在TCMSP 數據庫對篩選的8 個活性成分進行靶點預測，共得到319 個靶點，去除重復值后共得到162 個靶點。此外，在GeneCards 數據庫檢索得到14403 個PC 靶點。在Venny 2.1 在線工具平臺繪制162 個苦蕎靶點和14403 個PC 靶點韋恩圖，共得到156個共同靶點（圖1）。

圖1 苦蕎與胰腺癌靶點韋恩圖

2.3 靶標蛋白互相作用核心網絡

將苦蕎與PC 的156 個公共靶點導入STRING數據庫進行PPI 網絡分析，獲得化合物靶標蛋白互作核心網絡數據。為了更直觀表示蛋白互作核心網絡關系，該數據用Cytoscape 3.7.1 軟件構建蛋白互作網絡圖（圖2）。去除游離靶點后該網絡共有153 個節(jié)點，2648 條邊，其中，節(jié)點大小、顏色深淺代表degree 的大小。結果表明，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT1（degree=104）、腫瘤壞死因子TNF（degree=100）、細胞腫瘤抗原p53（TP53，degree= 99）、白細胞介素-6（IL6，degree= 96）、血管內皮生長因子VEGFA（degree= 91）、白細胞介素-1（IL-1B，degree= 89）、胱天蛋白酶3（CASP3，degree= 87）、表皮生長因子受體EGFR（degree= 85）這8 個靶點可能是苦蕎活性物質與PC相互作用的關鍵靶點。

圖2 苦蕎與胰腺癌交集基因PPI網絡

2.4 GO分析和KEGG通路分析

用1.2.4方法對苦蕎與PC 的156個交集靶點做GO 和KEGG 富集分析。GO 富集分析結果發(fā)現(xiàn)，有1685個生物過程（BP）、71個細胞組成（CC）、176個分子功能（MF）條目（圖3）。156個靶點主要富集在脂多糖的響應、細菌源分子的響應、活性氧代謝過程、細胞對化學壓力的反應等生物過程；在細胞組成方面，主要富集在膜筏、膜微域、膜區(qū)域、等離子膜筏等；在分子功能方面體現(xiàn)在DNA 結合型轉錄因子的結合、RNA 聚合酶II 特異性DNA 結合轉錄因子、核受體活性、配體激活的轉錄因子活性等。

圖3 GO功能富集

KEGG 富集分析結果得到198 個通路，對其中前20 條通路（p＜0.05）做可視化分析，結果顯示，苦蕎與PC 的交集靶點主要富集在脂質和動脈硬化、乙型肝炎、人類巨細胞病毒感染、PI3K-Akt 信號通路等（圖4）。

圖4 KEGG通路

2.5 化合物-靶點-通路網絡

156 個公共靶點、苦蕎8 個化合物、KEGG 前20條通路用Cytoscape 軟件進行Network Analyze 分析，獲得化合物-靶點-通路網絡關系圖。結果表明，共有184 個節(jié)點，746 條邊（圖5）?？嗍w中MOL000098 槲皮素（degree=119）、MOL000422 山奈酚（degree=45）、MOL000472 大黃素（degree=27）、MOL006505 表兒茶素（degree=23）、MOL000415 蘆丁（degree=16）、MOL000558 傘形花內酯（degree=9）等成分與交集靶點間有較高的關聯(lián)度。

圖5 化合物-靶點-通路網絡

2.6 分子對接分析

選取2.3 分析結果中的8 個靶點蛋白（AKT1、TNF、TP53、IL6、VEGFA、IL1B、CASP3、EGFR）和2.5 分析結果中的5 個化合物（槲皮素、山奈酚、大黃素、表兒茶素、蘆?。┻M行分子對接。靶點與配體之間的結合用Vina分值評價，得分小于0說明蛋白和化合物可以結合，得分越低靶點與配體之間結合越容易。對接結果顯示，苦蕎化學成分與上述靶點蛋白都具有良好的結合作用（圖6），效果最好的是蘆丁與IL6之間的分子對接（圖7）。

圖6 核心靶點與化合物的對接數值

圖7 蘆丁與IL6分子對接示例

3 討論

胰腺癌也稱“萬癌之王”，發(fā)現(xiàn)時多半已發(fā)展為晚期，病程進展快，治療效果差，預后差，總的5年生存率僅5%～9%。胰腺癌在病理上具有普遍異質性，針對這一復雜疾病的精準診療手段目前仍不足，這是導致其預后不良的主要原因［9］。因此，早期的疾病精準診療和日常預防就顯得尤為重要。而苦蕎中含有豐富的黃酮類成分，并且是天然蘆丁的重要來源，在蘆丁的多種活性功能中，其抗腫瘤活性作用被廣泛研究。已有研究報道蘆丁能促進癌細胞的凋亡，從而抑制癌細胞的生長［10］。此外，苦蕎中的槲皮素、山奈酚、大黃素、表兒茶素等也具有多種生物活性。槲皮素被報道具有較強的抗氧化、抗炎和抗增殖性質，且與雷公藤甲素的配伍對肺癌和食管癌細胞均有抗癌增效作用，并均呈現(xiàn)出良好的量效關系，具有良好的抗腫瘤前景［11］；山奈酚具有抗癌、抗氧化、抗骨質疏松、降血糖、免疫調節(jié)、疾病預防、抗炎等活性，對預防心血管疾病和損傷組織保護等有良好的藥理活性［12］；大黃素已被證明具有抗腫瘤作用，有研究表明大黃素主要通過促進細胞凋亡、抑制細胞增殖、抑制血管生成、抑制腫瘤轉移等起到抑制胰腺癌的作用［13］；表兒茶素也具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等活性，且槲皮素和表兒茶素聯(lián)用對炎癥相關性結腸癌、大腸腺癌等具有協(xié)同作用，可以起到良好的抑制效果［14-15］。本研究采用網絡藥理學和分子對接方法對苦蕎抑制胰腺癌的機制做了預測，得出苦蕎活性成分對胰腺癌的抑制主要與其活性成分影響AKT1、TNF、TP53、IL6、VEGFA、IL1B、CASP3、EGFR等介質的表達有關。

通過分析交集靶點PPI 網絡發(fā)現(xiàn)，AKT1、TNF、TP53、IL6、VEGFA、IL1B、CASP3、EGFR 等關鍵靶點，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT1被確定在胰腺癌等多種腫瘤中發(fā)揮致癌基因作用［16］；TNF為重要的炎癥細胞因子，可以激活巨噬細胞、間質細胞及編碼炎癥相關細胞因子基因的啟動子，誘發(fā)炎癥反應［17］；其中TP53基因編碼包含轉錄激活、DNA結合和寡聚結構域的蛋白，該蛋白參與多種細胞應激反應，調節(jié)靶基因的表達，從而誘導細胞周期阻滯、凋亡、衰老、DNA 修復或代謝改變，并根據生理環(huán)境和細胞類型誘導生長停滯或凋亡［18］；IL-6 是一種功能廣泛的多效性細胞因子，可調節(jié)多種細胞的生長與分化，具有調節(jié)免疫應答、急性期反應及造血功能，并在機體的抗感染免疫反應中起重要作用［19］；VEGFA 可促進新生血管形成和使血管通透性增加，具有促進血管通透性增加、細胞外基質變性、血管內皮細胞遷移、增殖和血管形成等作用［20］；IL-1B 作為一個重要的炎癥介質，能夠參與多種細胞活動，包括細胞增殖、分化和凋亡，有研究報道IL-1B 可以促進移植小鼠和人腫瘤的生長和轉移，包括肉瘤、黑色素瘤、胰腺導管腺癌、骨髓瘤和乳腺癌。最重要的是，IL-1B 及其受體也已被證明是間充質和上皮細胞原發(fā)性癌變和轉移的重要驅動因素。在胰腺癌模型中發(fā)現(xiàn)IL-1B 是結締組織增生反應的重要驅動因素。腫瘤產生的IL-1B 激活了TME 中的星狀細胞，并誘導TAM 介導的免疫抑制、Th17 侵襲和結締組織增生。阻斷IL-1B 可增強抗PD-1 免疫治療的抗腫瘤活性。因此，在胰腺癌模型中，IL-1B 在結締組織反應和免疫逃避的協(xié)調中是至關重要的［21］。CASP3 為細胞凋亡途徑中最為關鍵的酶類之一，是細胞凋亡檢測的重要指標，參與執(zhí)行細胞凋亡的caspase的激活［22］。

本研究基于網絡藥理學及分子模擬對接的方法，以苦蕎活性成分為研究對象，綜合分析其干預胰腺癌的生物學途徑及通路，并用反向分子對接進行驗證，得出苦蕎主要活性成分槲皮素、山奈酚、大黃素、表兒茶素、蘆丁可能通過作用于AKT1、TNF、TP53、IL6、VEGFA、IL1B、CASP3、EGFR 等靶點調控脂質和動脈硬化、乙型肝炎、人類巨細胞病毒感染、PI3K-Akt 信號通路，從而抑制促炎因子的釋放以減輕機體炎癥反應，同時調控細胞凋亡程序，抑制癌細胞擴散，從而起到對胰腺癌的防治作用。該機制主要呈現(xiàn)多分子、多靶點、多通路的特點，各成分間存在協(xié)同效應。

本研究結果僅是一種理論上的作用機制的探討，且數據挖掘主要依靠網絡數據庫，主要對苦蕎的黃酮類成分做了分析，其他化學成分是否也有活性未嘗得知，預測結論可能有一定偏差，后續(xù)還需進一步驗證苦蕎活性成分對胰腺癌的作用機制。

苦蕎作為藥食同源作物，在食品方面形式多樣，口味豐富，苦蕎食品、飲品的開發(fā)十分廣泛，藥品開發(fā)只注重其單一提取物的運用，如生物類黃酮散、生物類黃酮軟膏等產品，這顯得苦蕎藥用產品的開發(fā)比較局限，未能使其藥用價值完全發(fā)揮。因此，在利用苦蕎進行產品開發(fā)時應注重其各成分間協(xié)同增效的相互作用，才能發(fā)揮其最大價值。目前西藏蕎麥育種工作中苦蕎麥的培育主要以總黃酮含量穩(wěn)定>2%的品種（系）為主，在此標準下蘆丁含量能達到總黃酮的80%～90%，也為苦蕎麥的開發(fā)利用提供了支持保障。該研究以文獻分析為導向，旨在提升與促進西藏蕎麥綜合研究與實際應用工作。