高志存,石露莎,余舒寧,杞虹,高蕓,李水蘭,段文學(xué),崔惠娟*

(1.紅河州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,云南 蒙自 661199; 2.個(gè)舊市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,云南 個(gè)舊 661099; 3.建水縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,云南 建水 654399)

黃曲霉毒素(Aflatoxin,AF)主要是由黃曲霉、寄生曲霉等產(chǎn)生的一類化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的次生代謝產(chǎn)物,被世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)定為I類致癌物,是一種毒性極強(qiáng)的物質(zhì),其中,黃曲霉毒素B1(AFB1)檢出率較高、毒性最強(qiáng)、有強(qiáng)致癌性。研究發(fā)現(xiàn),玉米、豆粕等飼料原料霉菌毒素污染狀況日益嚴(yán)重,已成為飼料工業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)中不可忽視的問(wèn)題[1-3]。

目前,國(guó)內(nèi)外檢測(cè)黃曲霉毒素的方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、免疫親和熒光光度法、免疫層析法,其中,酶聯(lián)免疫吸附法與高效液相色譜法是檢測(cè)飼料中AFB1最常用的方法[4]。本文通過(guò)采用酶聯(lián)免疫吸附法與高效液相色譜法對(duì)玉米中AFB1含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較,驗(yàn)證酶聯(lián)免疫方法試劑盒的準(zhǔn)確性,以期為今后實(shí)驗(yàn)室玉米中AFB1的檢測(cè)工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米,來(lái)源于飼料生產(chǎn)企業(yè)、畜禽養(yǎng)殖場(chǎng),玉米樣品按GB/T 20195—2006《動(dòng)物飼料 試樣的制備》用四分法縮減至500 g,粉碎后過(guò)40目篩,混勻后裝入樣品瓶中備用。

1.2 儀器與試劑

Waters e2695高效液相色譜儀,配2475熒光檢測(cè)器;SpecteaMax 190酶標(biāo)儀,美谷分子儀器(上海)有限公司;HF2500光化學(xué)衍生器,北京華安麥科生物技術(shù)有限公司;AG-204電子天平,瑞士梅特勒公司;隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;漩渦振蕩器,Thermo Scientific;5804R冷凍離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司;黃曲霉毒素B1免疫親和柱,批號(hào)Q030781,規(guī)格3 mL,有效期2024-09-07,北京美正檢測(cè)技術(shù)有限公司;甲醇中黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液,100 μg/mL,批號(hào)22120720,有效期2025-01-08,壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司;黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫定量測(cè)試盒,批號(hào)H010822A,生產(chǎn)日期20230328,江蘇省蘇微微生物研究有限公司;甲醇、乙腈為色譜純,Merck公司;超純水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1酶聯(lián)免疫吸附法

1.3.1.1黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫定量測(cè)試盒組成

測(cè)試盒含包被抗體的反應(yīng)板96孔,樣品稀釋液2瓶,AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液1套(0、0.1、0.25、0.5、1、2 ng/mL),酶標(biāo)抗原4瓶,酶標(biāo)抗原稀釋液1瓶,濃縮洗滌液1瓶,顯色底物液a 1瓶,顯色底物液b 1瓶,終止液1瓶,反應(yīng)板框架1塊。

1.3.1.2試劑配制

60%甲醇-水溶液:取無(wú)水甲醇,用超純水按6∶4體積比稀釋。

酶標(biāo)抗原溶液:每瓶酶標(biāo)抗原中準(zhǔn)確加入1.5 mL酶標(biāo)抗原稀釋液,充分溶解,2～8 ℃保存。

洗滌工作液:將濃縮洗滌液用超純水按1∶19體積比進(jìn)行稀釋。

1.3.1.3樣品前處理

稱取飼料樣品5.0 g于50 mL離心管中,加入25 mL 60%甲醇-水溶液,混勻;搖床300 r/min劇烈振蕩15 min;4 000 rpm/min離心10 min;取上清液用樣品稀釋液適當(dāng)稀釋作為待測(cè)液。

1.3.1.4試劑盒檢測(cè)

取出酶聯(lián)免疫試劑盒,室溫(20～25 ℃)放置30 min以上;將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品對(duì)應(yīng)微孔編號(hào),每個(gè)做2孔平行;每孔加入250 μL洗滌工作液,放置40 s,甩掉洗滌工作液,在吸水紙上拍干;分別加入標(biāo)準(zhǔn)溶液、待測(cè)液50 μL到對(duì)應(yīng)孔中,每孔加入酶標(biāo)抗原溶液50 μL,輕輕震蕩混勻,遮蓋后37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min;小心揭開蓋板,甩掉反應(yīng)液,每孔加入洗滌工作液250 μL,充分洗滌5次,每次間隔40 s,甩掉洗滌工作液,在吸水紙上拍干;每孔加入顯色底物液a和顯色底物液b各50 μL,輕輕震蕩混勻,遮蓋后37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中顯色15 min;每孔加入終止液50 μL,輕輕震蕩混勻,于酶標(biāo)儀450 nm處讀取每孔OD值。

1.3.2高效液相色譜法

1.3.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)中間液:用單標(biāo)線吸量管精密吸取甲醇中黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)1.0 mL,用甲醇稀釋并定容至10 mL,配制成10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液,再分別用單標(biāo)線吸量管精密吸取適量10.0 μg/mL AFB1標(biāo)準(zhǔn)中間液,用甲醇稀釋并定容,配制成1.0 μg/mL、0.1 μg/mL的AFB1標(biāo)準(zhǔn)中間液。

黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液:分別精密吸取適量0.1 μg/mL的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)中間液,用流動(dòng)相稀釋并定容,配制成濃度為2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2.2樣品前處理

稱取飼料樣品5.0 g于50 mL離心管中,加入25 mL 80%乙腈-水溶液,混勻;搖床300 r/min劇烈振蕩20 min;5 000 r/min離心10 min;取上清液10 mL于100 mL燒杯中,加入70 mL水稀釋,混勻,如液體不清亮,用玻璃纖維濾紙過(guò)濾,收集濾液作為上樣液。將黃曲霉毒素B1免疫親和柱連接于10 mL注射器下,準(zhǔn)確吸取20.0 mL上樣液注入到注射器中,去掉親和柱下方堵頭,調(diào)開開關(guān),使液體以1～2滴/秒速度流出;待液體排干后,用10 mL水洗滌2次,流速2～3滴/秒,棄去全部流出液;準(zhǔn)確加入1.0 mL甲醇洗脫,流速1滴/秒,收集洗脫液于離心管中,加入水定容為2.0 mL,經(jīng) 0.45 μm濾膜過(guò)濾,上機(jī)測(cè)定[5]。

1.3.2.3高效液相色譜條件

色譜柱Luna ? C18(5 μm,250 mm×4.6 mm);流動(dòng)相為甲醇+水(45+55);光化學(xué)衍生系統(tǒng);檢測(cè)波長(zhǎng)采用激發(fā)波長(zhǎng)360 nm,發(fā)射波長(zhǎng)440 nm;柱溫35 ℃,流速為0.8 mL/min,進(jìn)樣體積為50 μL[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.1酶聯(lián)免疫法測(cè)定AFB1的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以標(biāo)準(zhǔn)液濃度的常用對(duì)數(shù)值(IgC)為橫坐標(biāo),各標(biāo)準(zhǔn)液孔吸光度值與0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)液孔吸光度值的比值(A標(biāo)準(zhǔn)液/A0)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知,在0～2 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)為0.9999。

圖1 酶聯(lián)免疫法測(cè)定AFB1的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2高效液相色譜法測(cè)定AFB1的標(biāo)準(zhǔn)曲線

將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定,以標(biāo)準(zhǔn)工作液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知,在2.0～50.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)為0.9999。

圖2 高效液相色譜法測(cè)定AFB1的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 加標(biāo)回收試驗(yàn)

在空白樣品中添加高、中、低3個(gè)水平的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)添加水平做3個(gè)平行樣,照樣品前處理方法進(jìn)行提取、凈化后,分別采用酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法進(jìn)行AFB1檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知,兩種方法3個(gè)添加水平AFB1回收率在93.5%～100.9%,滿足GB/T 27417—2017《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》規(guī)定濃度水平范圍在<0.1 mg/kg時(shí),回收率范圍在60%～120%的要求,表明兩種方法回收率良好,都能滿足實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)要求[6]。

表1 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.3 玉米中AFB1含量測(cè)定結(jié)果比較

分別取10個(gè)不同來(lái)源的玉米樣品,每個(gè)樣品2份,分別重復(fù)測(cè)定2次。GB 13078—2017《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定玉米加工產(chǎn)品等飼料原料中黃曲霉毒素B1的限量是≤50 μg/kg[7],由表2可知,采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定玉米中AFB1含量,判定結(jié)果一致,樣品中AFB1含量用ELISA檢測(cè)超過(guò)限量要求的,用HPLC檢測(cè)同樣也超出限量要求,只是所測(cè)得的AFB1含量HPLC法小于ELISA法。

表2 玉米中AFB1含量測(cè)定結(jié)果對(duì)比表

2.4 玉米中AFB1兩種檢測(cè)方法的比較

從表3可以看出,相較于高效液相色譜法而言,酶聯(lián)免疫吸附法具有檢測(cè)時(shí)間短、低成本、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),適用于大批量樣品的快速篩選。而高效液相色譜法,利用黃曲霉毒素B1免疫親和柱選擇性吸附樣品液中黃曲霉毒素B1,可有效避免樣品檢測(cè)假陽(yáng)性反應(yīng),適用于疑似樣品的確證及精確定量。

3 結(jié)論

通過(guò)采用酶聯(lián)免疫吸附法與高效液相色譜法對(duì)玉米中AFB1含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較,得出兩種方法對(duì)AFB1的判定結(jié)果一致,證明本實(shí)驗(yàn)室采用的酶聯(lián)免疫試劑盒是準(zhǔn)確的,ELISA操作簡(jiǎn)單快速,靈敏度高,適用于AFB1的快速篩選,高效液相色譜法耗時(shí)長(zhǎng)、成本高,更適用于疑似樣品的確證及精確定量。