劉昊,張備

(1.盤山縣疾病預(yù)防控制中心,遼寧 盤錦 124100;2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院,黑龍江 齊齊哈爾 161005)

羔羊大腸桿菌病又稱羔羊大腸桿菌性腹瀉,該病是由致病性大腸桿菌引起的一種羔羊急性、致死性傳染病[1]。該病不僅能夠感染2～8日齡的羔羊,而且還會(huì)使羔羊出現(xiàn)腹瀉和敗血癥等臨床癥狀,嚴(yán)重危害養(yǎng)羊業(yè)[2,3]。因此,尋找合適的藥物來抑制甚至殺滅引起羔羊腹瀉的致病性大腸桿菌成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。近年來,中藥抗菌藥物的研究已經(jīng)成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn),中藥及其復(fù)方制劑也作為潛在抗菌藥物廣泛應(yīng)用于畜禽的疾病防控中[4,5]。有研究結(jié)果顯示,蒲公英、黃連、山楂、石榴皮、五味子、蘆薈、白頭翁、烏梅和香薷等中藥對(duì)大腸桿菌均具有不同的抗菌活性[6-8]。因此,本試驗(yàn)以從羔羊腹瀉臨床病例中分離的O78型大腸桿菌作為研究對(duì)象,篩選對(duì)其具有抗菌作用的中藥,并分析部分中藥聯(lián)合后的抑菌效果,期望為抗大腸桿菌藥物的研發(fā)和臨床用藥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗(yàn)菌株

羔羊腹瀉大腸桿菌O78型由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院羊病研究室分離保存并饋贈(zèng)。

1.1.2主要試劑與藥品

大青葉、胖大海、夏枯草、蒲公英、金銀花、草豆蔻、板藍(lán)根、白頭翁、車前子、藏紅花、廣藿香、葛根、黃芩、黃柏、黃連、大黃、白芷、川芎、蘆根、山藥、沙參、石膏、通草、老鶴草、五味子、丁香、當(dāng)歸、秦皮、黨參、白術(shù)、干姜、蒼術(shù)、連翹、陳皮、防風(fēng)、甘草均購自遼寧成大方圓醫(yī)藥連鎖有限公司。營養(yǎng)肉湯和營養(yǎng)瓊脂均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3主要儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)為DHP-9162)購自杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司。超凈工作臺(tái)(型號(hào)為BBS-DDC)購自濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司。全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器(型號(hào)為BKQ-B100II)購自山東博科科學(xué)儀器有限公司。游標(biāo)卡尺(型號(hào)為0～150 mm)購自溫嶺市開創(chuàng)量具有限公司。中藥材粉碎機(jī)(型號(hào)為SL-200A)購自浙江省永康市松青五金廠。

1.2 方法

1.2.1中藥藥液的制備

分別稱取經(jīng)過粉碎后的36種中藥粉末50 g,加入500 mL超純水浸泡1 h后,加熱煮沸后文火煎煮至100 mL,紗布過濾,再用400 mL超純水將濾渣加熱煮沸后文火煎煮至100 mL,合并濾液并加熱濃縮至50 mL,使36種中藥藥液的生藥濃度為1 g/mL,備用。

1.2.2細(xì)菌懸液的制備

將大腸桿菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行活化,37 ℃的恒溫?fù)u床(160 r/min)中培養(yǎng)24 h。用接種環(huán)將活化后的細(xì)菌接種到營養(yǎng)瓊脂平板上進(jìn)行純培養(yǎng),37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。在營養(yǎng)瓊脂平板上挑取表面光滑、長(zhǎng)勢(shì)較好的單一菌落接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng),37 ℃的恒溫?fù)u床(160 r/min)中培養(yǎng)24 h。采用平板計(jì)數(shù)法對(duì)增菌后每毫升菌液的活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定,并使用營養(yǎng)肉湯將計(jì)數(shù)后菌液調(diào)制成菌液濃度為2.0×108CFU/mL,備用。

1.2.3抑菌試驗(yàn)

參照參考文獻(xiàn)[9]中的方法,采用平板打孔法測(cè)定單方中藥和中藥復(fù)方制劑的抑菌圈大小。取100 μL菌液濃度為1.0×108CFU/mL的大腸桿菌菌液涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,并使用直徑為4 mm的無菌打孔器在每個(gè)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行打孔后,向每個(gè)試驗(yàn)孔中加入60 μL的單方中藥和中藥復(fù)方制劑藥液,試驗(yàn)孔中的藥液應(yīng)處于滿而不溢的狀態(tài)。將經(jīng)過上述處理后的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基置于電熱恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),37 ℃培養(yǎng)24 h后,使用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小。每種單方中藥和中藥復(fù)方制劑藥液需進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

抑菌圈判定標(biāo)準(zhǔn):抑菌圈直徑>20 mm,極度敏感(++++);抑菌圈直徑15～20 mm,高度敏感(+++);抑菌圈直徑10～15 mm,中度敏感(++);抑菌圈直徑<10 mm,低度敏感(+);無抑菌圈,不敏感(-)。

1.2.4單方中藥的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)測(cè)定

取滅菌試管12支,編號(hào)依次為1—12,在每支試管中加入2 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,然后在第1支試管中加入2 mL的受試單方中藥藥液,混勻后吸取1號(hào)試管中的液體2 mL加入第2管中,以此類推,直到第10管中取出2 mL棄去,使1—10號(hào)試管的含藥濃度分別為500 mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL、15.625 mg/mL、7.813 mg/mL、3.906 mg/mL、1.953 mg/mL和0.977 mg/mL。隨后在1—11號(hào)試管中加入10 μL菌液濃度2×108CFU/mL的菌懸液,搖勻,第11號(hào)試管為陽性對(duì)照,第12號(hào)試管作為空白對(duì)照,37 ℃的恒溫?fù)u床(160 r/min)中培養(yǎng)24 h,觀察結(jié)果。以不發(fā)生渾濁變化的最小藥物濃度作為單方中藥對(duì)大腸桿菌的MIC。在測(cè)定的MIC值基礎(chǔ)上,將不發(fā)生渾濁變化試管中的液體培養(yǎng)基接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察結(jié)果。以菌落數(shù)小于5相對(duì)應(yīng)的最小藥物濃度作為單方中藥對(duì)大腸桿菌的MBC。本試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5中藥復(fù)方制劑MIC和MBC的測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)[10]中的方法,采用微量肉湯稀釋棋盤交叉法測(cè)定中藥復(fù)方制劑對(duì)大腸桿菌的MIC。使用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基將對(duì)大腸桿菌具有高度敏感和極度敏感的單方中藥分別稀釋至藥物濃度為2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC和1/64MIC,并按照微量肉湯稀釋棋盤交叉法要求將單方中藥進(jìn)行兩兩組合,每種單方中藥50 μL,配置成中藥復(fù)方制劑后,加入10 μL菌液濃度為2×108CFU/mL的菌懸液。設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察結(jié)果。以不發(fā)生渾濁變化的最小藥物濃度作為中藥復(fù)方制劑對(duì)大腸桿菌的MIC。在測(cè)定的MIC值基礎(chǔ)上,將不發(fā)生渾濁變化試管中的液體培養(yǎng)基接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察結(jié)果。以菌落數(shù)小于5相對(duì)應(yīng)的最小藥物濃度作為中藥復(fù)方制劑對(duì)大腸桿菌的MBC。本試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6雙聯(lián)中藥復(fù)方制劑分級(jí)抑菌濃度(FIC)指數(shù)的計(jì)算

依據(jù)單方中藥對(duì)大腸桿菌的體外抑菌效果,選取其中對(duì)大腸桿菌高度敏感和極度敏感的單方中藥進(jìn)行雙聯(lián)中藥復(fù)方制劑抑菌效果試驗(yàn),并根據(jù)雙聯(lián)中藥復(fù)方制劑FIC指數(shù)計(jì)算公式計(jì)算雙聯(lián)中藥復(fù)方制劑FIC指數(shù)。計(jì)算公式如下:

FIC=(甲藥聯(lián)用MIC/甲藥單用MIC)+(乙藥聯(lián)用MIC/乙藥單用MIC)

雙聯(lián)中藥復(fù)方制劑FIC指數(shù)判讀標(biāo)準(zhǔn):當(dāng)FIC指數(shù)<0.5時(shí),兩種中藥為協(xié)同作用;當(dāng)0.52.0時(shí),兩種中藥為拮抗作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 單方中藥對(duì)大腸桿菌的體外抑菌效果

由表1可知,36種單方中藥中有12種單方中藥對(duì)大腸桿菌具有抑菌效果,其中大腸桿菌對(duì)金銀花、五味子、白術(shù)和大青葉4種單方中藥高度敏感;大腸桿菌對(duì)大黃中度敏感;大腸桿菌對(duì)蒲公英、板藍(lán)根、黃芩、白頭翁、黃柏、黃連和車前子7種單方中藥低度敏感。大腸桿菌對(duì)胖大海、蒼術(shù)、夏枯草、秦皮、連翹、甘草、草豆蔻、陳皮、防風(fēng)、白芷、干姜、沙參、黨參、當(dāng)歸、廣藿香、藏紅花、川芎、丁香、蘆根、山藥、葛根、通草、老鶴草和石膏24種單方中藥不敏感。

表1 單方中藥對(duì)大腸桿菌的體外抑菌效果

2.2 單方中藥對(duì)大腸桿菌的MIC和MBC

由表2可知,蒲公英、板藍(lán)根、黃芩、白頭翁和黃柏5種單方中藥對(duì)大腸桿菌的MIC和MBC分別為250 mg/mL和500 mg/mL;黃連、大黃和車前子3種單方中藥對(duì)大腸桿菌的MIC和MBC分別為62.5 mg/mL和125 mg/mL;金銀花單方中藥對(duì)大腸桿菌的MIC和MBC均為62.5 mg/mL;五味子和白術(shù)2種單方中藥對(duì)大腸桿菌的MIC和MBC分別為31.25 mg/mL和62.5 mg/mL;大青葉單方中藥對(duì)大腸桿菌的MIC和MBC分別為15.625 mg/mL和31.25 mg/mL。

表2 單方中藥對(duì)大腸桿菌的MIC和MBC

2.3 中藥復(fù)方制劑對(duì)大腸桿菌的MIC、MBC和FIC

由表3可知,金銀花+五味子、金銀花+白術(shù)、五味子+白術(shù)、五味子+大青葉和白術(shù)+大青葉5種中藥復(fù)方制劑對(duì)大腸桿菌的FIC為1.50,主要表現(xiàn)為無關(guān)作用;金銀花+大青葉中藥復(fù)方制劑對(duì)大腸桿菌的FIC為0.75,主要表現(xiàn)為相加作用。

2.4 中藥復(fù)方制劑對(duì)大腸桿菌的體外抑菌效果

由表4可知,6種中藥復(fù)方制劑對(duì)大腸桿菌均有較強(qiáng)的抑菌效果,其中大腸桿菌對(duì)金銀花+大青葉和五味子+大青葉2種中藥復(fù)方制劑極度敏感;大腸桿菌對(duì)金銀花+五味子、金銀花+白術(shù)、五味子+白術(shù)和白術(shù)+大青葉4種中藥復(fù)方制劑高度敏感。

表4 中藥復(fù)方制劑對(duì)大腸桿菌的體外抑菌效果

3 討論

本試驗(yàn)采取傳統(tǒng)水煎煮的方法對(duì)36種中藥中的有效成分進(jìn)行提取,而后采用平板打孔法和試管二倍稀釋法對(duì)中藥抑菌活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明,36種單方中藥中的12種對(duì)大腸桿菌具有抑菌效果,其中金銀花、五味子、白術(shù)和大青葉4種單方中藥對(duì)大腸桿菌的抑菌效果最優(yōu)。本試驗(yàn)中金銀花對(duì)大腸桿菌的抑菌圈≥15 mm,MIC與MBC均為62.5 mg/mL,測(cè)定結(jié)果與郎利敏等[11]報(bào)道的金銀花對(duì)大腸桿菌的抑菌圈≥10 mm,MIC為62.5 mg/mL,MBC 62.5～125 mg/mL的結(jié)果存在差異。本試驗(yàn)中五味子對(duì)大腸桿菌的抑菌圈≥15 mm,MIC為31.25 mg/mL,MBC為62.5 mg/mL,測(cè)定結(jié)果與鹿意等[12]報(bào)道的五味子對(duì)大腸桿菌的抑菌圈≥20 mm,MIC與MBC均為7.812 mg/mL的結(jié)果存在差異。本試驗(yàn)中白術(shù)對(duì)大腸桿菌的抑菌圈≥15 mm,MIC為31.25 mg/mL,MBC為62.5 mg/mL,測(cè)定結(jié)果與王雅如等[13]報(bào)道的白術(shù)對(duì)大腸桿菌的抑菌圈為9.26 mm,MIC與MBC均為500 mg/mL的結(jié)果相接近。本試驗(yàn)中大青葉對(duì)大腸桿菌的抑菌圈≥15 mm,MIC為15.625 mg/mL,MBC為31.25 mg/mL,測(cè)定結(jié)果與張楚貞等[14]和張慧等[15]報(bào)道的大青葉對(duì)大腸桿菌的抑菌圈>10 mm,MIC為50 mg/mL,MBC>200 mg/mL的結(jié)果存在差異。究其原因:(1)金銀花中含有的綠原酸和異綠原酸等多種藥理活性成分可通過影響大腸桿菌相關(guān)代謝酶的活性來抑制大腸桿菌對(duì)糖的代謝和破壞細(xì)菌細(xì)胞壁,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抗菌作用[16];(2)五味子中含有的木脂素類和黃酮類化合物等多種藥理活性成分可通過影響大腸桿菌細(xì)胞膜的通透性,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抗菌作用[17];(3)白術(shù)中的白術(shù)多糖、揮發(fā)油和黃酮類化合物等多種藥理活性成分對(duì)大腸桿菌具有較強(qiáng)的抗菌活性,但作用機(jī)理不明確,需進(jìn)一步研究[18,19];(4)大青葉中的黃酮類化合物等藥理活性成分對(duì)大腸桿菌具有較強(qiáng)的抗菌活性,但作用機(jī)理未見報(bào)道,抗菌機(jī)理的后續(xù)研究可能參照其他的黃酮類化合物對(duì)大腸桿菌抗菌機(jī)理的研究[20];(5)菌株的動(dòng)物來源、血清型和耐藥性及中藥產(chǎn)地、質(zhì)量等不同可能造成抑菌效果的差異[21,22];(6)提取工藝相接近,但工藝參數(shù)存在差異可造成抑菌效果差異,如提取溫度、水煎液濾過方式等[23,24]。

本試驗(yàn)在進(jìn)行中藥聯(lián)用對(duì)大腸桿菌的抑菌效果研究時(shí),選取36種中藥中對(duì)大腸桿菌具有高度敏感和極度敏感的中藥進(jìn)行雙聯(lián)中藥復(fù)方制劑抑菌效果試驗(yàn)。本研究結(jié)果表明,金銀花+五味子、金銀花+白術(shù)、五味子+白術(shù)、五味子+大青葉、白術(shù)+大青葉、金銀花+大青葉6種中藥復(fù)方制劑對(duì)大腸桿菌具有較強(qiáng)的體外抑菌作用;金銀花+大青葉中藥復(fù)方制劑對(duì)大腸桿菌主要表現(xiàn)為相加作用;金銀花+五味子、金銀花+白術(shù)、五味子+白術(shù)、五味子+大青葉和白術(shù)+大青葉5種中藥復(fù)方制劑對(duì)大腸桿菌主要表現(xiàn)為無關(guān)作用。究其原因:(1)選用較強(qiáng)抑菌作用的單方中藥進(jìn)行雙聯(lián)中藥復(fù)方制劑抑菌效果試驗(yàn)時(shí),較少出現(xiàn)拮抗作用,大多數(shù)會(huì)保持無關(guān)作用[25];(2)大青葉中含有黃酮類化合物,而黃酮類化合物能使大腸桿菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的通透性增加,金銀花和大青葉中的抑菌成分更易進(jìn)入菌體,進(jìn)而發(fā)揮抑菌作用[13];(3)金銀花中含有的鞣酸可使大青葉中的抑菌成分易于進(jìn)入大腸桿菌菌體內(nèi)部,并不易被主動(dòng)排出,發(fā)揮抑菌作用;(4)金銀花中含有的鞣酸為大青葉中的抑菌成分提供適宜溶解的酸性環(huán)境,更好發(fā)揮藥效。