朱蘭,歐陽(yáng)依娜,趙小紅,王鵬,蘭蓉*

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,云南 昆明 650224; 2.云南立新羊業(yè)有限公司,云南 彌勒 652300; 3.云南省種羊繁育推廣中心,云南 尋甸 655200)

繁殖性狀關(guān)系到畜禽生產(chǎn)效率的高低,因此一直是家畜育種中重要的選育指標(biāo)。云上黑山羊作為肉用黑山羊新品種,具有優(yōu)良的繁殖性狀[1],對(duì)這一優(yōu)良性狀相關(guān)分子基礎(chǔ)的研究是云上黑山羊高繁品系培育的前提。近年來(lái)的相關(guān)研究找到一些與云上黑山羊產(chǎn)羔性狀相關(guān)的基因或變異位點(diǎn)[2],但經(jīng)過(guò)重復(fù)驗(yàn)證的位點(diǎn)或基因還較少。基于此,本研究選取前期全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)研究中與云上黑山羊產(chǎn)羔性狀存在潛在或顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn),應(yīng)用準(zhǔn)確性和經(jīng)濟(jì)性都很高的競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(KASP)檢測(cè)方法,進(jìn)行位點(diǎn)關(guān)聯(lián)性重復(fù)驗(yàn)證,以期為云上黑山羊產(chǎn)羔性狀基因組選擇提供可靠檢測(cè)位點(diǎn)或基因。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)樣本192個(gè),來(lái)自云南立新羊業(yè)有限公司和云南省種羊繁育推廣中心云上黑山羊核心群母羊。頸靜脈采血,EDTA抗凝,4 ℃保存。根據(jù)5個(gè)SNP位點(diǎn)側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物,信息見(jiàn)表1。

表1 KASP檢測(cè)引物序列

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

KASP試劑盒及引物合成均由LGC公司提供,去RNA酶水來(lái)自天根公司。實(shí)驗(yàn)在產(chǎn)自英國(guó) LGC 公司的SNPline基因分型平臺(tái)完成。

1.3 測(cè)定記錄指標(biāo)

記錄場(chǎng)號(hào)、羊號(hào)、初產(chǎn)年度、初產(chǎn)季節(jié)、初產(chǎn)產(chǎn)羔數(shù)、經(jīng)產(chǎn)胎次、經(jīng)產(chǎn)產(chǎn)羔數(shù),并計(jì)算平均產(chǎn)羔數(shù)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

KASP檢測(cè)流程如圖1所示。應(yīng)用Primer 5軟件,根據(jù)位點(diǎn)上下50 bp序列設(shè)計(jì)引物,帶有兩種通用標(biāo)簽并連接SNP位點(diǎn)的兩條正向引物和一條反向引物構(gòu)成引物混合液(Primer Mix),帶有不同熒光信號(hào)的檢測(cè)引物構(gòu)成主引物混合液(Master Mix)。PCR反應(yīng)包括三個(gè)階段,如圖2所示。每個(gè)PCR反應(yīng)包括:終濃度為5～50 ng模板2.5 μL、2×Master Mix 2.5 μL、Primer Mix 0.07 μL、2.5 μL去RNA酶水。三個(gè)階段PCR反應(yīng)程序具體如表2所示。

圖1 KASP實(shí)驗(yàn)流程圖

圖2 KASP分型PCR反應(yīng)流程圖

表2 三個(gè)階段PCR反應(yīng)程序

1.5 數(shù)據(jù)掃描

PCR結(jié)束后,取出孔板,參照《ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System 實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行數(shù)據(jù)掃描,輸出位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)圖譜。

1.6 數(shù)據(jù)分析方法

1.6.1遺傳多樣性分析

應(yīng)用GenAlEx 6.501軟件進(jìn)行等位基因頻率、遺傳多樣性參數(shù)的計(jì)算,并進(jìn)行 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。

1.6.2產(chǎn)羔性狀相關(guān)因素分析

應(yīng)用SAS 9.0的GLM過(guò)程分析5個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)初產(chǎn)產(chǎn)羔數(shù)和平均產(chǎn)羔數(shù)的影響,并對(duì)顯著相關(guān)位點(diǎn)的不同基因型進(jìn)行最小二乘分析,采用一般線性模型如下:

y=Xβ+ZKγK+e

注:y為表型向量,Xβ為固定效應(yīng),ZKγK為待檢驗(yàn)標(biāo)記效應(yīng),e為殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 遺傳多態(tài)性分析結(jié)果

KASP技術(shù)對(duì)192個(gè)樣本5個(gè)SNP位點(diǎn)平均檢出率為99.06%,多態(tài)性檢測(cè)圖譜層次清晰(圖3),5個(gè)位點(diǎn)均存在多態(tài)性,并計(jì)算各位點(diǎn)等位基因頻率(圖4);由表3可見(jiàn),位點(diǎn)rs268244272和rs642265755處于Hardy-Weinberg不平衡(P<0.01),其他3個(gè)位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05),位點(diǎn)rs268244272在云上黑山羊群體中為低度多態(tài)性(PIC<0.25),其余4個(gè)位點(diǎn)均為中度多態(tài)性(0.25

圖3 5個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)圖譜

圖4 5個(gè)位點(diǎn)等位基因頻率

表3 5個(gè)位點(diǎn)遺傳多樣性參數(shù)

2.2 產(chǎn)羔性狀影響因素分析結(jié)果

2.2.1產(chǎn)羔性狀GLM分析結(jié)果

由表4可見(jiàn),位點(diǎn)rs268244272對(duì)初產(chǎn)產(chǎn)羔數(shù)影響極顯著(P<0.01),對(duì)平均胎產(chǎn)羔數(shù)影響顯著(P<0.05),其余4個(gè)位點(diǎn)對(duì)產(chǎn)羔性狀影響不顯著(P>0.05)。

表4 5個(gè)位點(diǎn)對(duì)產(chǎn)羔性狀影響的GLM分析

2.2.2顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)產(chǎn)羔性狀最小二乘分析結(jié)果

位點(diǎn)rs268244272存在3種基因型:TT、CC和TC型。最小二乘分析表明(表5),TT型初產(chǎn)產(chǎn)羔數(shù)最小二乘均數(shù)極顯著高于TC型(P<0.01),而平均胎產(chǎn)羔數(shù)TT型也顯著高于TC型(P<0.05)。

表5 位點(diǎn)rs268244272不同基因型產(chǎn)羔性狀最小二乘均數(shù)

3 討論

KASP(競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR)技術(shù)是目前最為經(jīng)濟(jì)快速靈活的基因分型手段,全球各大種業(yè)公司均采用 KASP 技術(shù)進(jìn)行基因分析研究[3],目前已經(jīng)發(fā)表了兩千多篇文獻(xiàn),是一項(xiàng)成熟可靠的分型產(chǎn)品,對(duì)少量位點(diǎn)的檢測(cè)較其他分型技術(shù)更能顯現(xiàn)保證準(zhǔn)確率而降低成本的優(yōu)越性。本研究5個(gè)位點(diǎn)192個(gè)樣本的KASP分型成功率在99%以上,檢測(cè)圖譜堿基分層清晰(圖3),每個(gè)位點(diǎn)均檢出多態(tài)性,說(shuō)明KASP分型技術(shù)有效,所獲數(shù)據(jù)可以用于后續(xù)分析。

初產(chǎn)產(chǎn)羔數(shù)和平均胎產(chǎn)羔數(shù)是云上黑山羊繁殖性狀的主要選育指標(biāo),長(zhǎng)期以來(lái)受人工選擇的強(qiáng)度較大。而本研究位點(diǎn)多態(tài)性與產(chǎn)羔性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示,位點(diǎn)rs268244272與云上黑山羊初產(chǎn)產(chǎn)羔數(shù)和平均胎產(chǎn)羔數(shù)均存在顯著關(guān)聯(lián),并且這個(gè)位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg非平衡狀態(tài),PIC值低于0.25,有效等位基因數(shù)僅為1.3,表明這一位點(diǎn)受到較強(qiáng)的人工選擇,表現(xiàn)出較低遺傳變異。這一結(jié)果與朱蘭等的研究結(jié)果基本一致[4],一方面再次驗(yàn)證位點(diǎn)rs268244272與云上黑山羊產(chǎn)羔性狀存在顯著關(guān)聯(lián),rs268244272作為云上黑山羊繁殖性狀選擇的分子標(biāo)記較為可靠;另一方面為云上黑山羊繁殖性狀的選育成效提供了分子依據(jù),也說(shuō)明通過(guò)長(zhǎng)期的人工選育,云上黑山羊繁殖性狀關(guān)聯(lián)位點(diǎn)不斷純合。

4 結(jié)論

位點(diǎn)rs268244272與云上黑山羊初產(chǎn)產(chǎn)羔數(shù)極顯著相關(guān)(P<0.01),與平均胎產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)(P<0.05),再次驗(yàn)證與云上黑山羊產(chǎn)羔性狀關(guān)聯(lián)的有效性,該位點(diǎn)可作為云上黑山羊產(chǎn)羔性狀分子標(biāo)記。