劉芳任啟飛胡世俊馬菁華陳云飛歐明燭李海波

(1.西南林業(yè)大學林學院，云南 昆明 650224；2.貴州省植物園，貴州 貴陽 550004；3.貴州梵凈山國家級自然保護區(qū)管理局，貴州 銅仁 554400)

梵凈山石斛(Dendrobium fanjingshanense)為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)附生草本植物，是2001年發(fā)現(xiàn)的1個新種[1]，其分布區(qū)域狹窄，在中國目前發(fā)現(xiàn)有分布的只有2個地方：貴州省梵凈山黑灣河，浙江省九龍山國家級自然保護區(qū)[2]。梵凈山石斛是瀕危植物，被列入現(xiàn)已被列為國家Ⅱ級重點保護野生植物，其主要附生在喬木樹種上，分布高度為15～20m，其開花率高但結(jié)實率極低，是一種適應性較強、喜濕、喜陰涼的植物[3，4]。梵凈山石斛具有藥用價值，可入藥用于治療口干、煩渴、熱病傷津、肺熱干咳、腰膝軟弱、陰傷目暗等病癥[5]；此外，其作為石斛蘭，其花黃褐色或橙黃色，具有極高的觀賞價值和育種價值。

目前，對梵凈山石斛的研究報道不多，主要集中在親緣關系、繁殖技術(shù)和營養(yǎng)成分等方面，研究表明，梵凈山石斛與細莖石斛親緣關系較近[6]。余水生等[7]進行了梵凈山石斛種子無菌播種技術(shù)研究；楊天友等[8]測定了梵凈山石斛的營養(yǎng)成分，其含有豐富的營養(yǎng)成分，水浸出物含量最高，粗多糖含量次之，還含有粗纖維、蛋白質(zhì)、脂肪、總黃酮以及礦質(zhì)元素鉀、鈉、鈣、鎂、鐵、鋅等營養(yǎng)成分，除此之外，其還含有16種氨基酸和10種脂肪酸。梵凈山石斛與鐵皮石斛營養(yǎng)成分相比也具有一定優(yōu)勢，含有銅、鈣、鎂、鉀及硒5種礦質(zhì)元素，醇溶性浸出物，石斛堿的含量較高，但粗多糖的含量低[9]。

繁育特性是蘭科植物保育的基礎[10]，石斛蘭在自然情況下結(jié)實率低[11]，因此，在人工栽培條件下，研究其人工授粉技術(shù)，提高梵凈山石斛的結(jié)實率，對其繁殖和育種具有重要的意義。目前，對于梵凈山石斛沒有繁育生物學相關研究報道，本試驗以梵凈山石斛為研究對象，開展其開花特性觀測以及人工授粉研究，并對蒴果的發(fā)育進行了觀測，為其繁育研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為種植于貴州省植物園保育溫室內(nèi)的梵凈山石斛植株，栽培基質(zhì)為鹿沼土∶樹皮∶蛭石=2∶2∶1。選擇生長較好的植株進行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 花期各階段觀察及花部結(jié)構(gòu)測定

2023年2—4月，參考李偉倩[12]的方法，觀察花期各階段，直至花期結(jié)束。隨機抽取10朵梵凈山石斛盛開的花朵，放入保鮮袋中帶回實驗室，測量中萼片、花瓣、子房、合蕊柱的大小。

1.2.2 人工授粉

參考李桂琳等[13]方法。于盛花期的早晨進行人工授粉，設置自花授粉、同株異花、異株異花3個處理，授粉花朵數(shù)視實際情況而定，授粉時用大頭針輕輕挑開藥帽后輕沾花粉粒放到待授粉花朵的蕊腔里，輕壓使其與蕊腔緊密接觸。授粉前后1d內(nèi)不澆水。授粉7～14d后觀察授粉花朵狀態(tài)，包括花柄、花瓣、子房變化情況，統(tǒng)計結(jié)實數(shù)并計算結(jié)實率，公式：

結(jié)實率/%=(結(jié)實個數(shù)/授粉花朵數(shù))×100

1.2.3 蒴果形態(tài)特征研究

參考周慧君等[14]方法。授粉140～150d后，摘下未開裂的蒴果，帶回實驗室，隨機選取10個蒴果，測量蒴果的長、寬、果柄長和重并記錄，打開果莢取出種子混合，制片9張，每張片子隨機選取5個視野，在生物顯微鏡(4×)下觀察并記錄種子數(shù)量和有胚種子數(shù)量，計算種子有胚率。公式：

種子有胚率/%=(有胚種子個數(shù)/種子總個數(shù))×100

取部分混合后的種子放入離心管中，加入0.5%TTC染色液，28℃培養(yǎng)12h后，制片9張，每張片子隨機選取5個視野，在顯微鏡(4×)下觀察種子染色情況，紅色則為有活力種子，計算種子生活力。公式：

種子生活力/%=(有活力的種子數(shù)/觀察種子總數(shù))×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果用Excel 2019進行初步整理，用SPSS 26對試驗數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 梵凈山石斛花期各階段特性及花部結(jié)構(gòu)測定

梵凈山石斛花期可分為花芽萌動期、始蕾期、現(xiàn)蕾期、露色期、始花期、盛花期、末花期7個時期?；ㄑ棵葎悠诩s在3月初出現(xiàn)，在節(jié)間形成突起的萌動的花芽，見圖1a；3月中旬左右，綠色的花蕾開始出現(xiàn)，為始蕾期，見圖1b；花蕾出現(xiàn)約7d后，花蕾大面積露出，為現(xiàn)蕾期，見圖1c；5d左右后，花柄出現(xiàn)，花蕾顏色進一步加深，為露色期，見圖1d；露色期到始花期需要3～9d，之后很快進入盛花期，見圖1e、圖1f。據(jù)觀察，種植于貴州省植物園大棚溫室的梵凈山石斛花期比野外環(huán)境下(梵凈山)花期提前20d左右，這是由于溫度影響，溫度高花期會提前。

注：1為中萼片；2為花瓣；3為側(cè)萼片；4為唇瓣。

從表1、圖1可知，梵凈山石斛花呈橙黃色和黃褐色，萼片和花瓣顏色從里到外逐漸加深，花瓣近橢圓形，中萼片長12.8～18.0mm，寬4.0～5.5mm，花瓣長12.1～17.0mm，寬3.8～6.0mm，子房長21.4～31.0mm，唇瓣外部橙黃色或黃褐色，中部具有一條紫色斑塊，邊緣白色，合蕊柱長9.2～11.50mm，合蕊柱寬2.2～5.2mm，合蕊柱長1.8～2.9mm，藥帽乳白色，花粉塊黃色。

表1 梵凈山石斛花部結(jié)構(gòu)大小

2.2 梵凈山石斛人工授粉研究

梵凈山石斛花朵人工授粉后3～4d開始枯萎，7d左右花朵基部開始膨大形成蒴果，則表明授粉成功。由表2可知，梵凈山石斛自花授粉和同株異花授粉均不能結(jié)實，僅異株異花能成功結(jié)實，結(jié)實率為43.24%，說明梵凈山石斛異交親和，自交不親和性。

表2 梵凈山石斛人工授粉結(jié)實率

表3 蒴果形態(tài)特征及種子發(fā)育情況

2.3 蒴果形態(tài)特征研究

從圖2a可知，梵凈山石斛授粉成功后，花朵枯萎基部逐漸膨大，從而形成蒴果，膨大期為4月，隨后進入生長期，授粉140～150d后，蒴果未開裂時可采摘，此時種子呈粉塵狀且可以快速抖落，可用于無菌播種。取授粉140～150d后的蒴果進行形態(tài)觀察，見圖2b，得出蒴果綠色，紡錘形，長2.22～3.12cm，寬0.72～1.24cm，果柄長0.50～3.36cm，單粒蒴果平均重為0.90g；將蒴果切開，觀察梵凈山石斛種子，見圖2c，其為黃色，粉末狀，小，數(shù)量多。通過生物顯微鏡觀察可知，其種子呈細長船型，兩端較窄，中間較寬，胚位于種子中間較寬部分。梵凈山石斛種子大部分為有胚種子，無胚種子較少，種子有胚率在82.26%～97.35%，平均種子有胚率為91.73%，通過TTC染色法測定種子活力，得出種子生活力在73.08%～92.66%，平均種子生活力為86.92%，表明人工授粉后的梵凈山石斛種子胚發(fā)育較好，生活力較強。

注：1為無胚種子；2為有胚種子；3為未被染色的種子；4為被染色的種子。

3 討論與結(jié)論

梵凈山石斛花期3—4月，開花進程可分為花芽萌動期、始蕾期、現(xiàn)蕾期、露色期、始花期、盛花期、末花期7個時期。其花具有2種顏色，橙黃色和黃褐色，顏色從里到外逐漸加深，表明其花朵具有較高的觀賞性，觀賞價值高?；ㄆ鞴僦?，平均中萼片長15.21mm，寬4.79mm，子房長21.4～31.0mm，平均合蕊柱長10.54mm，合蕊柱寬4.10mm，合蕊柱長2.12mm。

石斛屬植物自交親和性存在差異，可表現(xiàn)為異交親和，異交和自交都親和，自交親和[10]；文獻報道，翅萼石斛、棒節(jié)石斛、玫瑰石斛、晶帽石斛、黃花石斛、金釵石斛自花授粉、同株異花以及異株異花授粉均能結(jié)實，其中玫瑰石斛自花授粉結(jié)實率最高[13，16]，表明其均存在自交和異交親和；梵凈山石斛自花授粉和同株異花授粉結(jié)實率均為0，只有異花授粉才能授粉成功獲得蒴果，表明梵凈山石斛存在自交不親和，異交親和，與束花石斛[10]、喇叭唇石斛[15]一樣。

本試驗對人工授粉的蒴果進行種實發(fā)育觀測，結(jié)果表明，梵凈山石斛蒴果平均長2.57cm，寬0.92cm，單粒平均0.90g。種子有胚率平均數(shù)可達91.73%，平均種子生活力可達86.92%，表明采用人工授粉方式獲得的種子胚發(fā)育較好，生活力較強，具有一定的萌發(fā)能力，適合于作為無菌播種的材料。

研究瀕危植物開花物候和繁育系統(tǒng)有利于了解其繁育過程的限制影響因子，從而通過人為干預，促進其保護[17]，因此，繁育特性研究是梵凈山石斛保育的重要研究內(nèi)容，本試驗對梵凈山石斛開花特性、人工授粉以及蒴果的發(fā)育進行了觀測，為其保育提供基礎資料。