李玉靜，馮雨晴，趙園園，馬雁軍，劉德水,3，史宏志*

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院/煙草農(nóng)業(yè)減害研究中心，鄭州 450046；

2 上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠(chǎng)有限公司，北京 100024；

3 北京生命科技研究院有限公司，北京 102211

植株對(duì)氮素的利用包括吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、還原、同化等環(huán)節(jié)，NO3-被植物吸收后通過(guò)硝酸還原酶（nitrate reductase, NR）和亞硝酸還原酶（nitrite reductase, NiR）轉(zhuǎn)化為NH4+，NH4+可直接經(jīng)GS-GOGAT 循環(huán)（谷氨酰胺合成酶與谷氨酸合成酶循環(huán)）合成氨基酸，從而被植物吸收利用[1-2]。與烤煙相比，白肋煙色素含量低，光合產(chǎn)物合成和積累受限，為氮代謝提供的能量和碳骨架較少，氮素利用率低，易造成硝酸鹽的大量積累[3-4]。白肋煙葉片對(duì)氮素的還原同化能力低已有較多研究，而根系作為植株吸收氮素的關(guān)鍵部位，對(duì)NO3-和NH4+的吸收動(dòng)力學(xué)值得深入研究。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的眾多學(xué)者在水稻[5]、小麥[6]、玉米[7]、枳橙[8]、香蕉[9]等作物上開(kāi)展了不同形態(tài)氮素及各種離子的吸收動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)作物對(duì)硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的吸收存在差異，且最大吸收速率受最大閾值的限制，如枳橙對(duì)NO3-的吸收速率在0.05～2.0 mmol·L-1范圍內(nèi)持續(xù)增加，而對(duì)NH4+的吸收速率在0.1～1.0 mmol·L-1之間持續(xù)增加，在1.0～2.0 mmol·L-1之間趨于飽和[8]。此外，硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的比例不同會(huì)影響到作物對(duì)二者的吸收速率[9-11]。在硝態(tài)氮的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，NRT1 和NRT2 家族基因分別編碼低親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[12]，不同作物間的NRT 家族受外界條件的影響不一致，如茶樹(shù)和木薯中NRT2.5基因均表現(xiàn)為在低濃度硝態(tài)氮條件下表達(dá)量較高[13-14]，擬南芥中AtNRT2.1受NO3-強(qiáng)烈誘導(dǎo)，AtNRT2.4受NO3-中度誘導(dǎo)，而AtNRT2.5受NO3-抑制[15]，煙草中的研究發(fā)現(xiàn)，缺氮處理會(huì)使NRT2.1、NRT2.2的表達(dá)量顯著提高[16]，NpNRT1.2僅在根系中表達(dá)且嚴(yán)格依賴(lài)高濃度的NO3-[17]。

烤煙和白肋煙兩品種間的氮效率存在顯著差異，已有研究表明，不同形態(tài)氮素及比例對(duì)烤煙和白肋煙生長(zhǎng)的作用效果不同，高比例的硝態(tài)氮有效促進(jìn)烤煙生長(zhǎng)，高比例的銨態(tài)氮有效提高白肋煙的氮代謝能力[18]。前人開(kāi)展了烤煙根系對(duì)K+[19]、Se（Ⅵ）[20]等養(yǎng)分離子的吸收動(dòng)力學(xué)研究，但關(guān)于烤煙和白肋煙兩品種根系對(duì)硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的吸收特性還未見(jiàn)報(bào)道。本研究以烤煙品種K326 和白肋煙品種TN90 為研究對(duì)象，探究其對(duì)不同形態(tài)氮素的吸收動(dòng)力學(xué)特征及不同硝銨配比處理下二者氮代謝相關(guān)基因的響應(yīng)差別，從生理及分子水平綜合分析，為煙草對(duì)氮素的高效利用和合理施肥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與培育條件

供試材料為烤煙品種K326，白肋煙品種TN90。試驗(yàn)于2021 年10—12 月于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家煙草栽培生理生化研究基地進(jìn)行，氣候室光照時(shí)間設(shè)置為白天9:00—18:30，光量子強(qiáng)度400 μmol·m-2·s-1（換算光照強(qiáng)度4938 Lx[21]），相對(duì)濕度約為70%，溫度控制在（26±2）℃。煙草種子用2%的次氯酸鈉溶液消毒滅菌2 次，每次5 min，隨后將其播撒在育苗棉上，經(jīng)水培長(zhǎng)至五葉一心，進(jìn)行不同形態(tài)氮比例的吸收動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。前期用清水培養(yǎng)，待子葉完全展開(kāi)后改為霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，其中NO3-：NH4+=1:1，每3 d 更換一次營(yíng)養(yǎng)液。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在總N 濃度為2 mmol·L-1的前提下，共設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)處理，T1：NO3-: NH4+=100:0、T2：NO3-:NH4+=50:50、T3：NO3-: NH4+=0:100，NO3-由KNO3提供，NH4+由(NH4)2SO4提供，除此外溶液中不再提供其他營(yíng)養(yǎng)離子。試驗(yàn)全程將煙苗根系沒(méi)入小黑瓶中，密度為1 株/瓶。采用常規(guī)耗竭法，選取長(zhǎng)勢(shì)大小基本一致的煙苗，將根系沖洗干凈后置于去離子水中，預(yù)培養(yǎng)48 h，以消除煙苗體內(nèi)殘留氮素的影響。隨后將煙苗移入不同處理的小黑瓶中，進(jìn)行吸收動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。下文中，以字母“Z”表示試驗(yàn)開(kāi)始0 h（即饑餓2 d）時(shí)，“F”表示試驗(yàn)開(kāi)始4 h 時(shí)，“K”表示烤煙品種K326，“N”表示白肋煙品種TN90，“K1、K2、K3”和“N1、N2、N3”分別表示烤煙品種K326 和白肋煙品種TN90處于T1、T2、T3 處理之下。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目

1.3.1 根系吸收動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)測(cè)定

試驗(yàn)過(guò)程全程光照，分別于0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、14、24、28、30 h 從各處理的小黑瓶中取0.1 mL溶液樣于離心管中保存，用于測(cè)定NO3-和NH4+含量，同時(shí)向吸收液中補(bǔ)充0.1 mL 去離子水。每個(gè)處理進(jìn)行3 次平行重復(fù)試驗(yàn)。

1.3.2 氮代謝相關(guān)酶活性測(cè)定

在1、2、4、8 h 幾個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)取根系鮮樣備用，取樣時(shí)每?jī)芍隉煘橐粋€(gè)混合樣，每個(gè)處理取3 次重復(fù)，用錫紙包好后放入液氮中冷凍30 min，而后放入超低溫冰箱（-80℃）保存。根據(jù)吸收曲線(xiàn)發(fā)現(xiàn)，4 h 左右兩煙草品種根系對(duì)硝態(tài)氮及銨態(tài)氮的吸收速率差異較大，因此測(cè)定4 h 時(shí)各處理的根系酶活性，送至蘇州科銘生物技術(shù)有限公司測(cè)定NR 和谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase, GS）活性，測(cè)定方法為BCA蛋白法。

1.3.3 根系轉(zhuǎn)錄組測(cè)定

取樣方法同1.3.2，取預(yù)培養(yǎng)48 h 后（即0 h，作為對(duì)照）、處理4 h 時(shí)根系樣品，送至廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3.4 硝酸鹽含量測(cè)定

在試驗(yàn)結(jié)束后，擦干煙苗表面水分，將根系和地上部分離，稱(chēng)取根系鮮重，而后將各部分在烘箱中105℃殺青15 min，60℃烘干至恒重。殺青后的樣品用碾子碾碎，過(guò)60 目篩，于密封袋中保存，用于硝酸鹽含量的測(cè)定，測(cè)定方法為水楊酸-濃硫酸比色法。

1.4 吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算方法

以吸收時(shí)間為橫坐標(biāo)，溶液中離子濃度為縱坐標(biāo)做圖，計(jì)算烤煙和白肋煙對(duì)NO3-和NH4+的吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)。利用最小二乘法，擬定一元二次多項(xiàng)式回歸方程，建立曲線(xiàn)消耗方程Y=aX2+bX+c，式中：Y表示溶液中離子濃度，X表示根系吸收時(shí)間，根據(jù)公式Vmax=b×V/m（V：溶液原體積；m：根鮮質(zhì)量）、Km=c-3b2/16a、Cmin=c-b2/4a 求得相關(guān)參數(shù)[22-24]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2016 和Origin 8.5 對(duì)吸收動(dòng)力、酶活性及硝酸鹽含量3 項(xiàng)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算和作圖，不同處理間的顯著性差異采用Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行檢驗(yàn)。根系轉(zhuǎn)錄組結(jié)果在Omicsmart 平臺(tái)上進(jìn)行后續(xù)分析，利用統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)FDR 值與差異倍數(shù)log2FC 篩選差異基因，滿(mǎn)足FDR＜0.05，|log2FC|＞1 的標(biāo)記為差異基因（Differential expression gene, DEGs）。

不同氮素處理下，烤煙和白肋煙以各自品種饑餓48 h 為對(duì)照，再將相同氮素處理下的烤煙和白肋煙作為一個(gè)分組，繪制差異表達(dá)韋恩圖。分別挑選Z-K_vs_F-K1 和Z-N_vs_F-N1、Z-K_vs_F-K2 和Z-N_vs_F-N2、Z-K_vs_F-K3 和Z-N_vs_F-N3 的共差異表達(dá)基因，繪制目標(biāo)KEGG 富集條形圖，根據(jù)FDR 值顯示前30 個(gè)富集通路?；贙EGG 結(jié)果，挑選氮代謝通路差異基因，根據(jù)其在樣本中的表達(dá)量繪制熱圖，以展示基因在樣本中的變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 烤煙和白肋煙對(duì)NO3-的吸收差異

2.1.1 烤煙和白肋煙對(duì)NO3-的吸收動(dòng)力學(xué)特征差異

根據(jù)溶液中NO3-濃度隨時(shí)間變化的關(guān)系得出T1和T2 處理下K326 和TN90 對(duì)NO3-的吸收動(dòng)力學(xué)方程（表1），再根據(jù)相關(guān)公式求得根系對(duì)NO3-的吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)（表2）。由表2 可知，T1 和T2 處理下，K326和TN90 關(guān)于NO3-的吸收動(dòng)力學(xué)相關(guān)參數(shù)均差異顯著，T1 和T2 處理下，TN90 的Vmax和Vmax/Km均顯著低于K326，Km和Cmin均顯著高于K326，說(shuō)明K326對(duì)NO3-的親和力和吸收潛力均高于TN90，K326 更能在低濃度下吸收硝酸根離子。

表1 不同硝態(tài)銨態(tài)氮配比條件下烤煙和白肋煙根系對(duì)NO3-的吸收動(dòng)力學(xué)方程Tab.1 Kinetic equation of NO3- absorbed by flue-cured tobacco and burley tobacco roots under different nitrate and ammonia nitrogen ratios

表2 不同硝態(tài)銨態(tài)氮配比條件下烤煙和白肋煙根系對(duì)NO3-的吸收動(dòng)力參數(shù)Tab.2 Absorption kinetic parameters of NO3- in the roots of flue-cured and burley tobacco under different nitrate-ammonium nitrogen ratio conditions

2.1.2 烤煙和白肋煙對(duì)NO3-的吸收速率差異

由圖1 可知，T1 和T2 處理下，K326 和TN90 對(duì)NO3-的吸收速率表現(xiàn)規(guī)律一致，均為先上升后下降，K326 對(duì)NO3-的吸收速率均高于TN90，且T2 處理下TN90 對(duì)的NO3-吸收速率相對(duì)于K326 的降低程度大于T1 處理。由于煙苗在試驗(yàn)前經(jīng)過(guò)了饑餓處理，在各處理下，K326 和TN90 分別于1.5 h、2 h 表現(xiàn)出最大吸收速率，而后下降并于12 h 后趨于平穩(wěn)。

圖1 不同硝態(tài)銨態(tài)氮配比條件下烤煙和白肋煙根系對(duì)NO3-的吸收速率曲線(xiàn)差異Fig.1 Differences of NO3-absorption rate curves between flue-cured tobacco and burley tobacco roots under different nitrate and ammonia nitrogen ratios

2.2 烤煙和白肋煙對(duì)NH4+的吸收差異

2.2.1 烤煙和白肋煙對(duì)NH4+的吸收動(dòng)力學(xué)特征差異

根據(jù)溶液中NH4+濃度隨時(shí)間變化的關(guān)系得出T3處理和T2 處理下K326 和TN90 對(duì)NH4+的吸收動(dòng)力學(xué)方程（表3），再根據(jù)相關(guān)公式求得根系對(duì)NH4+的吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)（表4）。由表4 可知，T2 處理下，K326和TN90 關(guān)于NH4+的吸收動(dòng)力學(xué)相關(guān)參數(shù)中，TN90的Vmax、Km和Cmin值均顯著低于K326，二者間的Vmax/Km值未出現(xiàn)顯著差異；T3 處理下，K326 和TN90關(guān)于NH4+的吸收動(dòng)力學(xué)相關(guān)參數(shù)結(jié)果無(wú)顯著差異。說(shuō)明硝態(tài)氮和銨態(tài)氮均存在時(shí)，TN90 對(duì)NH4+的親和力高于K326。

表3 不同硝態(tài)銨態(tài)氮配比條件下烤煙和白肋煙根系對(duì)NH4+的吸收動(dòng)力學(xué)方程Tab.3 Absorption kinetics equations of NH4+ in the roots of flue-cured and burley tobacco under different nitrate-ammonium nitrogen ratio conditions

表4 不同硝態(tài)銨態(tài)氮配比條件下烤煙和白肋煙根系對(duì)NH4+的吸收動(dòng)力參數(shù)Tab.4 Absorption kinetics parameters of NH4+ in flue-cured tobacco and burley tobacco roots under different nitrate and ammonia nitrogen ratios

2.2.2 烤煙和白肋煙對(duì)NH4+的吸收速率差異

由圖2 可知，K326 和TN90 對(duì)NH4+的吸收速率表現(xiàn)規(guī)律均為先上升后下降。T3 處理下K326 和TN90對(duì)NH4+的吸收速率曲線(xiàn)幾乎一致，K326 和TN90 分別于1.5 h 和2 h 表現(xiàn)出最大吸收速率，而后下降并在12 h 后趨于平穩(wěn)。T2 處理下，前4 h 中TN90 對(duì)NH4+的吸收速率均大于K326，這可能是因?yàn)閷?duì)氮饑餓后的K326 和TN90 同時(shí)供給硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，TN90 優(yōu)先吸收NH4+而K326 優(yōu)先吸收NO3-，4 h 后K326和TN90對(duì)NH4+的吸收速率曲線(xiàn)逐漸重合，于12 h 后趨于平穩(wěn)。

2.3 烤煙和白肋煙氮代謝關(guān)鍵酶活性的差異

在試驗(yàn)開(kāi)始后4 h 時(shí)各處理根系的NR 和GS 活性如圖3 所示，在各處理下TN90 的NR 和GS 活性均顯著低于K326，T1～T3 處理下，TN90 的NR 活性分別較K326 降低14.04%、24.78%、13.30%；TN90 的GS活性分別較K326 降低13.36%、12.57%、15.26%。K326的NR 活性表現(xiàn)為T(mén)1＞T2＞T3，且T1 處理和其他處理間表現(xiàn)出顯著差異，TN90 的NR 活性表現(xiàn)規(guī)律為T(mén)1＞T3＞T2，各處理間均表現(xiàn)出顯著差異。K326 和TN90 根系的GS 活性均表現(xiàn)為T(mén)2＞T1＞T3，但K326在各處理間未表現(xiàn)出顯著差異，TN90 的T2 處理和T3處理間表現(xiàn)出顯著差異。

圖3 不同硝態(tài)銨態(tài)氮配比條件下烤煙和白肋煙根系NR 和GS 活性的差異Fig.3 Differences in NR and GS activities in the roots of flue-cured and burley tobacco under different nitrate-ammonium nitrogen ratio conditions

2.4 烤煙和白肋煙NO3-含量差異

由圖4 可知，在各處理下，TN90 根系和地上部的硝酸鹽含量均顯著高于K326。K326 和TN90 根系中的硝酸鹽含量均表現(xiàn)為隨處理中硝態(tài)氮含量的降低而降低，T1～T3 處理下，TN90 根系中的硝酸鹽含量分別較K326 增加111.86%、101.06%、19.02%。但K326 和TN90 地上部的硝酸鹽含量表現(xiàn)出不同的規(guī)律，K326 在T1 和T2 處理下地上部的硝酸鹽含量未表現(xiàn)出顯著差異，T3 處理下地上部的硝酸鹽含量相比于T1 和T2 處理顯著降低；TN90 地上部硝酸鹽含量表現(xiàn)出先降低再升高的趨勢(shì)，且各處理間均表現(xiàn)出顯著差異，T1～T3 處理下，TN90 地上部的硝酸鹽含量分別較K326 增加55.09%、22.75%、67.96%。

圖4 不同硝態(tài)銨態(tài)氮配比條件下烤煙和白肋煙根系及葉片的硝酸鹽含量差異Fig.4 Differences in nitrate content in the roots and leaves of flue-cured and burley tobacco under different nitrate-ammonium nitrogen ratio conditions

2.5 烤煙和白肋煙根系轉(zhuǎn)錄組分析

2.5.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量分析

各樣本的過(guò)濾后reads 均在99%以上，過(guò)濾后測(cè)序堿基質(zhì)量值達(dá)到Q20 以上水平的堿基數(shù)目占比均在97%以上，過(guò)濾后測(cè)序堿基質(zhì)量值達(dá)到Q30 以上水平的堿基數(shù)目占比均在92%以上，GC 含量較為一致，均在42%左右，這些結(jié)果表明測(cè)序結(jié)果較為可靠，可繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)分析。

2.5.2 烤煙和白肋煙根系中差異表達(dá)基因

差異表達(dá)基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖5 所示。與饑餓處理48 h 時(shí)相比，不同氮供應(yīng)處理4 h 時(shí)，T1～T3處理下K326 根系中分別有3304、2577、2404 個(gè)DEGs上調(diào)，4102、2994、2662 個(gè)DEGs 下調(diào)；T1～T3 處理下TN90 根系中分別有2113、2044、1787 個(gè)DEGs上調(diào)，2425、2499、2217 個(gè)DEGs 下調(diào)?？梢?jiàn)在不同的氮素供應(yīng)條件下，TN90 根系中的差異表達(dá)基因數(shù)目均低于K326，尤其是在硝態(tài)氮占比100%供應(yīng)條件下。

圖5 不同硝態(tài)銨態(tài)氮配比條件下烤煙和白肋煙差異表達(dá)基因數(shù)目Fig.5 Number of differentially expressed genes in flue-cured tobacco and burley tobacco under different nitrate and ammonia nitrogen ratios

2.5.3 共差異表達(dá)基因及KEGG 富集

由圖6 和圖7 可知，各分組下的差異表達(dá)基因富集在代謝途徑（Metabolic pathways）中，Z-K_vs_F-K1和Z-N_vs_F-N1 中有3349 個(gè)共差異表達(dá)基因，其中氮代謝通路包含 40 個(gè)基因；Z-K_vs_F-K2 和Z-N_vs_F-N2 中有3076 個(gè)共差異表達(dá)基因，其中氮代謝通路包含34 個(gè)基因；Z-K_vs_F-K3 和Z-N_vs_F-N3中有2745 個(gè)共差異表達(dá)基因，其中氮代謝通路包含29 個(gè)基因。

圖6 不同硝態(tài)銨態(tài)氮配比條件下烤煙和白肋煙基因表達(dá)數(shù)目Fig.6 Number of gene expressionsin flue-cured tobacco and burley tobacco under different nitrate and ammonia nitrogen ratios

圖7 不同硝態(tài)銨態(tài)氮配比條件下烤煙和白肋煙共差異表達(dá)基因顯著富集的通路Fig.7 KEGG pathway with significant enrichment of co-differentially expressed genes influe-cured tobacco and burley tobacco under different nitrate and ammonia nitrogen ratios

KEGG 富集結(jié)果顯示，在代謝途徑之下的各通路中，T1 處理下顯著富集（FDR＜0.05）的通路有30 條；T2 處理下顯著富集（FDR＜0.05）的通路有25 條；T3處理下顯著富集（FDR＜0.05）的通路有24 條。不同處理下的前10 條代謝途徑中，除氮代謝通路外，剩余的代謝通路及排列順序也略有不同，T1 處理下依次為次生代謝物生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）、谷胱甘肽代謝（Glutathione metabolism）、苯丙素生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）、類(lèi)胡蘿卜素生物合成（Carotenoid biosynthesis）、托烷、哌啶和吡啶生物堿生物合成（Tropane, piperidine and pyridine alkaloid biosynthesis）、碳代謝（Carbon metabolism ）、 苯 丙 氨 酸 代 謝（ Phenylalanine metabolism）和異喹啉生物堿生物合成（Isoquinoline alkaloid biosynthesis ）、 乙 醛 酸 和 二 羧 酸 代 謝（Glyoxylate and dicarboxylate metabolism）；T2 處理下依次為次生代謝物生物合成、谷胱甘肽代謝、類(lèi)胡蘿卜素生物合成、托烷、哌啶和吡啶生物堿生物合成、精氨酸生物合成（Arginine biosynthesis）、氨基酸生物合成（Biosynthesis of amino acids）、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸生物代謝（Alanine, aspartate and glutamate metabolism）、戊糖和葡萄糖醛酸脂相互轉(zhuǎn)化（Pentose and glucuronate interconversions）、異喹啉生物堿生物合成；T3 處理下依次為次生代謝物生物合成、谷胱甘肽代謝、托烷、哌啶和吡啶生物堿生物合成、類(lèi)胡蘿卜素生物合成、異喹啉生物堿生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸生物代謝、精氨酸生物合成、酪氨酸代謝（Tyrosine metabolism）、氨基酸生物合成。

2.5.4 氮代謝通路基因熱圖

在 KEGG 富集結(jié)果中選擇氮代謝（Nitrogen metabolism）通路基因繪制熱圖，結(jié)果如圖8 所示。

T1 處理下，編碼NR 的基因NIA1、NIA2及NiR的基因NIR1在白肋煙中的表達(dá)量高于烤煙，GS 基因GLN1-1在白肋煙中的表達(dá)量低于烤煙，GS1-2、GLN1、GLN2的表達(dá)量在白肋煙中較高。負(fù)責(zé)硝酸鹽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的基因NRT2.6（MSTRG.43059）、NRT2.4（MSTRG.43058）在烤煙中的表達(dá)量較高；NRT2.4（MSTRG.12854、MSTRG.12856、MSTRG.13677、MSTRG.47049）在白肋煙中的表達(dá)量較高。

T2 處理下，編碼NR 的基因NIA1、NIA2以及NiR的基因NIR1在白肋煙中的表達(dá)量低于烤煙，GS 基因GLN1-1、GLN2、GS1-2在白肋煙中的表達(dá)量低于烤煙，GLN1的表達(dá)量在白肋煙中較高。負(fù)責(zé)硝酸鹽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的基因NRT2.1（gene_2749）、NRT2.4（MSTRG.43058、MSTRG.12856、MSTRG12854）、NRT2.6（MSTRG.43059）在烤煙中的表達(dá)量較高；NRT2.4（MSTRG.13678、MSTRG.13677、MSTRG.47049）、NRT2.5（gene_15182、gene_21595）在白肋煙中的表達(dá)量較高。

T3 處理下，編碼NiR 的基因NIR1在白肋煙中的表達(dá)量低于烤煙，GS 基因GLN1-1在白肋煙中的表達(dá)量低于烤煙，GS1-2、GLN1在白肋煙中的表達(dá)量較高。負(fù)責(zé)硝酸鹽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的基因NRT2.1（MSTRG.56221、gene_2749、MSTRG.43057）、NRT2.4（MSTRG.12856、MSTRG.12854、MSTRG.47050、MSTRG.47058、MSTRG.13678）在烤煙中的表達(dá)量較高；NRT2.5（gene_15182）、NRT2.4（MSTRG.13677、MSTRG.47049）在白肋煙中的表達(dá)量較高。

3 討論

3.1 烤煙和白肋煙對(duì)硝態(tài)氮和銨態(tài)氮吸收的差異

從吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果可以看出，T1 和T2 處理下，K326 對(duì)硝態(tài)氮的吸收潛力和親和力表現(xiàn)均高于TN90，說(shuō)明烤煙更偏好于硝態(tài)氮，這與張夢(mèng)等[25]的研究結(jié)果一致；T2 處理下，NH4+的相關(guān)參數(shù)表現(xiàn)為Km(TN90)＜Km(K326)，Cmin(TN90)＜Cmin(K326)，說(shuō)明TN90 更偏好銨態(tài)氮。在硝態(tài)氮與銨態(tài)氮均存在的情況下（T2 處理），K326 的Km值和Cmin值表現(xiàn)為Km(NO3-)＜Km(NH4+)，Cmin(NO3-)＜Cmin(NH4+)；TN90 關(guān)于NO3-和NH4+的Km值和Cmin值差異較小，說(shuō)明氮饑餓后對(duì)烤煙品種K326和白肋煙品種TN90同時(shí)供應(yīng)硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，K326 在硝態(tài)氮和銨態(tài)氮之間表現(xiàn)出明顯的硝態(tài)氮選擇傾向，而TN90 未表現(xiàn)出這種特性。此外，T1 和T2 處理下，K326 對(duì)NO3-和NH4+的最大吸收速率（Vmax）均顯著高于TN90，說(shuō)明K326 對(duì)氮素的吸收能力高于TN90。

3.2 烤煙和白肋煙硝酸鹽含量和氮代謝關(guān)鍵酶活性的差異

NR 和GS 是煙株氮代謝過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶[26]，NR 活性高低會(huì)影響植株體內(nèi)的硝酸鹽含量[3]，但與酶活性相比，氮高效基因型的硝酸鹽含量顯著低于氮低效基因型的硝酸鹽含量[27]，可見(jiàn)品種是硝酸鹽含量的決定性因素。本試驗(yàn)表明，在各處理下，白肋煙品種TN90 的NR 和GS 活性均低于烤煙品種K326，根系及地上部分的硝酸鹽含量均顯著高于烤煙品種K326，這與Li[4]的研究結(jié)果較為一致?？緹熎贩NK326 全株和白肋煙品種TN90 根系中的硝酸鹽含量變化表現(xiàn)均隨處理中硝態(tài)氮含量的減少而減少，而白肋煙品種TN90地上部硝酸鹽含量表現(xiàn)為降低后又略有升高，這可能是因?yàn)橄蹁@配比供應(yīng)時(shí)可以加速原先累積的硝態(tài)氮還原，而單一銨態(tài)氮源處理下，原先累積在液泡內(nèi)的硝態(tài)氮不易被還原[28]，從而造成硝酸鹽含量略有提升。

3.3 烤煙和白肋煙差異表達(dá)基因數(shù)目的差異

根系是氮素的吸收的關(guān)鍵部位，白肋煙對(duì)氮素的利用能力低于烤煙已有研究[3-4]，本試驗(yàn)選取烤煙中具有代表性的品種K326 和白肋煙中具有代表性的品種TN90 互相作為對(duì)照，最大限度地比較了二者在不同氮處理下的吸收差異。差異表達(dá)基因數(shù)目結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，K326 在3 種氮供應(yīng)處理下的上下調(diào)基因數(shù)目均高于TN90，這說(shuō)明在饑餓后再次供氮，K326比TN90 更為敏感。不同供氮處理下，K326 表現(xiàn)為T(mén)1 處理下差異表達(dá)基因數(shù)目最多，T2 和T3 處理下差異表達(dá)基因數(shù)目相近，但TN90 表現(xiàn)為在T1 和T2 處理下差異表達(dá)基因數(shù)目相似，T3 處理下差異表達(dá)基因數(shù)目較少，這說(shuō)明不同形態(tài)氮素對(duì)K326 和TN90 的刺激效果不同，K326 對(duì)硝態(tài)氮的反應(yīng)更為強(qiáng)烈。此外，NO3-/NH4+比例高時(shí)，K326 和TN90 之間的共表達(dá)差異基因數(shù)目會(huì)增加，氮代謝通路相關(guān)基因數(shù)目也增加。

3.4 烤煙和白肋煙NR 和GS 相關(guān)基因表達(dá)的差異

氮代謝基因通路熱圖顯示，T1 處理下，編碼NR和NiR 的基因在K326 中的表達(dá)量低于TN90，但T2和T3 處理下，編碼NR 和NiR 的基因在K326 中的表達(dá)量均高于TN90，酶活性結(jié)果表明TN90 的NR 活性在各處理?xiàng)l件下均低于烤煙，這可能是因?yàn)镹R 活性還與植株體內(nèi)糖含量等因素相關(guān)[29]。在玉米[30]、水稻[31]等眾多植株上研究表明，GS 與氮素利用效率直接相關(guān)，控制植株生長(zhǎng)。編碼GS 的基因有細(xì)胞質(zhì)中的Gln1和葉綠體中的Gln2兩種基因，Gln1主要在根部表達(dá)[32-33]，植株通過(guò)根系吸收的銨離子主要通過(guò)GS 的同工酶之一GS1 被同化[34]，Gln1-1在根系的皮層細(xì)胞中表達(dá)，合成谷氨酸用于根系生長(zhǎng)[35]，在煙草中過(guò)表達(dá)擬南芥的AtGLN1;4基因可以提高煙草在低氮條件下的GS 活性[36]。本研究結(jié)果表明，在各處理?xiàng)l件下，GLN1-1在TN90 中的表達(dá)量均低于K326，酶活性結(jié)果也表明TN90 的GS 活性在各處理下均低于K326。因此，轉(zhuǎn)錄組結(jié)果從基因?qū)用孀C實(shí)了酶活性弱是白肋煙氮素利用效率低的一個(gè)重要原因。碳氮代謝密不可分，白肋煙碳代謝能力弱也是造成其氮代謝能力弱的一大重要原因，今后應(yīng)加強(qiáng)氮代謝與碳代謝之間的關(guān)聯(lián)研究，以期挖掘出更多的調(diào)控機(jī)制，從而為煙葉品質(zhì)的提升提供更多理論支撐。

3.5 烤煙和白肋煙硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)的差異

黃化剛等[37]研究發(fā)現(xiàn)煙草NtNRT2.4基因在根部的表達(dá)量較高，負(fù)責(zé)硝酸鹽吸收，硝態(tài)氮會(huì)誘導(dǎo)NtNRT2.4表達(dá)而銨態(tài)氮抑制其表達(dá)。氮代謝基因熱圖顯示烤煙品種K326和白肋煙品種TN90根系的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白差異基因均為NRT2家族，在各處理下，NRT2.6、NRT2.1在K326 根系中表達(dá)量較高，NRT2.5在TN90 根系中表達(dá)量較高，而NRT2.4在K326 和TN90 根系中均有表達(dá)。不同硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在K326 和TN90 中的表達(dá)情況不一致，這也說(shuō)明了K326和TN90 對(duì)氮素的吸收利用存在著顯著差異。本試驗(yàn)中NRT2.5在TN90 根系中的表達(dá)量高，與NRT2.5在TN90 葉片中的表達(dá)量低[4]研究結(jié)果不一致，可能是因?yàn)镹RT2.5在煙株的不同器官中表達(dá)情況不一致，TN90 根系對(duì)硝態(tài)氮的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)能力可能大于葉片。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，烤煙品種K326 對(duì)氮素的吸收能力高于白肋煙品種TN90，在硝態(tài)氮和銨態(tài)氮均存在的情況下，K326 對(duì)硝態(tài)氮的親和力高于TN90，TN90 對(duì)銨態(tài)氮的親和力高于K326。TN90 根系的NR和GS 活性在各處理?xiàng)l件下均低于K326，GLN1-1在TN90 中的表達(dá)量也均低于K326，可見(jiàn)氮代謝相關(guān)酶活性低是造成白肋煙品種TN90 硝酸鹽含量高于烤煙品種K326 的一個(gè)重要原因。氮饑餓后再次供應(yīng)硝態(tài)氮與銨態(tài)氮，烤煙品種K326 優(yōu)先吸收NO3-而白肋煙品種TN90 優(yōu)先吸收NH4+。