李佳敏 ，賈 瓊 ，秦蓉芬 ，遲志端 ，王富明 ，范瑞文

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.晉中市莊子鄉(xiāng)綜合便民服務(wù)中心，山西 晉中 030600）

氧是生命活動(dòng)中所必需的物質(zhì)，且在其中起重要作用[1]。缺氧在惡性腫瘤中是較為常見的，且缺氧還是腫瘤生長環(huán)境最顯著的特征之一[2]。組織和細(xì)胞是通過缺氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia inducible factor，HIF）誘導(dǎo)相應(yīng)靶基因來適應(yīng)氧氣濃度[3]。HIF-1、HIF-2 及HIF-3 是HIF 的3 種亞型，均由氧調(diào)節(jié)型α 亞基和組成型β 亞基構(gòu)成，α 亞基是活性亞基，又分為HIF-1α，HIF-2α 和HIF-3α[4]。HIF-1α 與氧濃度的關(guān)系密切，HIF-1α 是缺氧細(xì)胞基因表達(dá)的關(guān)鍵，其穩(wěn)定性和活性受各種翻譯后修飾、羥基化、乙?；土姿峄恼{(diào)節(jié)[5]。HIF-1α 成為許多適應(yīng)低氧微環(huán)境疾病的主要參與者，如癌癥、中風(fēng)和心臟病[6]。因此，阻斷HIF-1α 的表達(dá)或阻斷其相互作用的蛋白質(zhì)會抑制腫瘤生長[7]。HIF-1α 在腫瘤組織中表達(dá)增高，一方面與腫瘤組織增生過快造成局部組織缺氧有關(guān)，另一方面，HIF-1α 是多種依賴氧張力的調(diào)節(jié)因子[8]，與某些癌基因激活或抑癌基因失活有關(guān)。因此，HIF-1α 的表達(dá)量可作為檢測惡性腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)。

黑色素瘤來源于黑色素細(xì)胞，是一種具有侵襲性的皮膚癌[9-10]。黑色素瘤雖然發(fā)病率不高，但其死亡率較高[11-12]。黑色素瘤多發(fā)于哺乳動(dòng)物皮膚和黏膜，均具有侵襲性和致死性，且預(yù)后差[13-14]。HIF-1α 的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，研究其在黑色素瘤發(fā)病和發(fā)展機(jī)制中的作用對于改善患者的臨床結(jié)果至關(guān)重要[15]。HIF-1α 介導(dǎo)不同過程的基因轉(zhuǎn)錄，包括應(yīng)激適應(yīng)、代謝、凋亡、腫瘤生長、血管生成和侵襲[16]。近年來研究還發(fā)現(xiàn)，HIF-1α 參與了PI3K/Akt/mTOR、Ras/RAF/MEK/ERK、JAK/STAT、Wnt/β-catenin、Notch 等信號通路[17-18]，這些路徑及其相關(guān)的復(fù)雜變化影響黑色素瘤的生長和發(fā)展、新陳代謝、運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞凋亡[19]。

傳統(tǒng)抗體藥物分子較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，較易失活且價(jià)格昂貴。納米抗體的優(yōu)勢在于分子小、滲透性強(qiáng)，能夠針對傳統(tǒng)單抗所不能觸及的抗原表位設(shè)計(jì)藥物，使其更好地到達(dá)腫瘤內(nèi)部以及穿透血腦屏障[20]。因此，基于HIF-1α 表達(dá)受到抑制將發(fā)揮抗腫瘤功能，結(jié)合納米抗體的優(yōu)勢，本研究以羊駝源黑色素瘤B16 噬菌體文庫制備HIF-1α 納米抗體，并驗(yàn)證其在黑素瘤的生長和發(fā)展過程中的作用，旨在為抑制腫瘤生長提供新思路。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

大腸桿菌TG1、輔助噬菌體M13K07、B16 細(xì)胞和羊駝源黑色素瘤B16 噬菌體文庫、正常小鼠腦組織切片均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)羊駝生物工程實(shí)驗(yàn)室保存提供。HIF-1α 多肽購自武漢三鷹生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 HIF-1α 納米抗體的篩選 將HIF-1α 多肽稀釋至終質(zhì)量濃度為20 μg/mL，包被免疫管，4 ℃靜置過夜，以備用。將TG1 接種于5 mL 2YT 培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 過夜振蕩培養(yǎng)以活化。

將500 μL 噬菌體文庫溶于100 mL 2YT/AG溶液培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)至D600nm值為0.4～0.6；加入100 μL 輔助噬菌體，混勻靜置30 min，再37 ℃、200 r/min 振蕩30 min，棄上清，加入100 mL 2YT/AK 液體培養(yǎng)基重懸沉淀，30 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)至過夜。次日，將TG1 接入30 mL 2YT 中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)至D600nm=0.4備用。4 ℃、11 000 r/min 離心10 min，去上清加入1/5 體積遇冷的PEG/NaCl，冰上放置70 min。離心后用2.4 mL 無菌PBS 重新懸浮菌體沉淀，再次離心，回收上清加入事先包被20 μL/mLHIF-1α 多肽的免疫包被管中。37 ℃封閉1 h 后用PBS 沖洗，并加入三乙醇胺，緩慢振蕩15 min，加入Tris-HCl中和。將其涂布于2YT/AG 平板，30 ℃培養(yǎng)過夜。次日收集菌落，作為HIF-1α 一級文庫。

按上述方法，分別以10、5、2.5 μg/mL 的HIF-1α 質(zhì)量濃度進(jìn)行第2 輪、3 輪、4 輪的淘篩。從第4 輪篩選洗脫物滴定的平板上，隨機(jī)挑取96 個(gè)單克隆接種于2YTAG 中與30 ℃振蕩培養(yǎng)8 h，加入稀釋的噬菌體，37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h 后離心，棄去上清用含有Kana 抗性的培養(yǎng)基重懸沉淀，37 ℃過夜培養(yǎng)。

將HIF-1α 蛋白和BSA 蛋白包被于96 孔板，用ELISA 法篩選陽性克隆并進(jìn)行測序，比對測序結(jié)果，在NCBI基因庫中選擇VHH序列并用DNAMAN進(jìn)行比對和ORF Finder 軟件進(jìn)行氨基酸序列分析，選取能夠完整表達(dá)蛋白質(zhì)的菌株，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 載體的構(gòu)建 按陽性克隆的DNA 序列設(shè)計(jì)引物（含BamHI、SalI 酶切位點(diǎn)）：HIF-1α-F：5'-CGGGATCCGAGTCGGGAGGAGGCTTGG-3'；HIF-1α -R：5'-GCGTCGACTGAGGAGACGGT GACTAGGG-3'。

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL：2×Es Taq Master Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，模板5 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR 產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳膠回收，將回收產(chǎn)物和PMD19-T 連接，PMD-19T 反應(yīng)體系為：PMD-19T 1 μL，回收產(chǎn)物4 μL，Solution Buffer 1 μL。之后再以BamHI、SalI 將19TNbHIF-1α 和pET-28a 進(jìn)行雙酶切并進(jìn)行T4 連接（雙酶切體系為：10×QuickCut Buffer 5 μL，BamHⅠ 1 μL，SalⅠ 1 μL，19TNbHIF-1α 質(zhì)粒8 μL，ddH2O 35 μL；T4 連接體系為：回收菌體質(zhì)粒6 μL，回收載體2 μL，T4 連接酶1 μL，T4Buffer 2 μL，ddH2O 9 μL，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，涂布于含100 μg/mL Kana 的LB 平板上37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆接種于LB-Kana 液體培養(yǎng)基搖至D600為0.4～0.6 后測序，將測序結(jié)果正確的質(zhì)粒命名為pET28a-NbHIF-1α。

1.2.3 HIF-1α 納米抗體表達(dá)與純化 將5 μL pET28a-NbHIF-1α 提取質(zhì)粒，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）中，冰浴30 min，42 ℃熱激45 s，再冰浴3 min，37 ℃、200 r/min 振蕩活化1 h，菌液接種于LBKana 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 振蕩至D600為0.6，加入0.3 mmol/L 的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），28 ℃、200 r/min 搖菌4 h 后收菌，將菌液沉淀用PBS 清洗2 次后超聲破碎，16 000 g 離心30 min。使用AKTA 層析系統(tǒng)與鎳離子金屬螯合親和層析介質(zhì)（Ni-NTA）預(yù)裝柱對帶有His 標(biāo)簽的納米抗體進(jìn)行純化，分別用不同梯度咪唑和分子篩除去雜蛋白，將蛋白用超濾管濃縮后分裝，-80 ℃保存。

1.2.4 HIF-1α 納米抗體的應(yīng)用 將6 周齡正常小鼠腦組織研磨后提取總蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，將純化的HIF-1α 納米抗體作為一抗、HRPHis-Tag 作為二抗進(jìn)行Western Blot 檢測腦組織中HIF-1α 蛋白的表達(dá)。

將制備的小鼠腦組織制備石蠟切片經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)，然后在3%雙氧水中室溫孵育30 min。用PBS 洗滌后，用5%BSA 在37 ℃封閉1 h，然后與純化的納米抗體或PBS（空白對照）孵育，之后于37 ℃在His-tag 抗體孵育1 h。DAB 顯色，隨時(shí)觀察停止顯色，然后用蘇木精復(fù)染，脫色封片，檢測小鼠腦組織中HIF-1α 表達(dá)分布。

1.2.5 HIF-1α納米抗體對黑素瘤細(xì)胞增殖的影響待B16 細(xì)胞在培養(yǎng)皿中長到80%～90%，與HIF-1α 納米抗體加入96 孔板中，并保證每孔2 000 個(gè)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中待6 h 后，在每孔中加入10 μL CCK-8 工作液，檢測0、3、6、9 h 的450 nm 波長的吸光度。

1.2.6 HIF-1α 納米抗體對黑素瘤細(xì)胞遷移的影響 將培養(yǎng)到80%～90%的B16 細(xì)胞傳代至12 孔板中，待細(xì)胞長滿12 孔板后，使用直尺與100 μL 槍頭在12 孔板劃平行線，用PBS 緩沖液洗凈殘留細(xì)胞。試驗(yàn)組加入HIF-1α 納米抗體。分別在劃痕0、12、24、36 h 后對同一位置進(jìn)行拍照，觀察細(xì)胞遷移結(jié)果。

1.2.7 HIF-1α 納米抗體對增值相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 選取培養(yǎng)狀態(tài)良好且培養(yǎng)到80%～90%的豐度，細(xì)胞傳代到6 孔板中，試驗(yàn)組和對照組各3 個(gè)孔。試驗(yàn)組中加入HIF-1α 抗體，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。用所提蛋白進(jìn)行Westen Blot 檢測，以β-actin為內(nèi)參，檢測細(xì)胞中Ras、RAF1、ERK1/2、RAC1 和VEGF 蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 HIF-1α 納米抗體的篩選及序列特征

通過對陽性克隆的序列進(jìn)行比對，篩選出6 個(gè)VHH 序列。經(jīng)過ELISA 法對6 個(gè)陽性克隆進(jìn)行抗原結(jié)合力檢測，選取1A12 作為候選克?。ū?）。1A12 的核苷酸序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的VHH 序列相似性達(dá)到78%（圖1-A），通過對1A12 克隆的氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)該序列沒有形成跨膜區(qū)（圖1-B），為親水性蛋白（圖1-C）。1A12 的氨基酸序列由88 個(gè)氨基酸構(gòu)成，含有完整的4 個(gè)框架區(qū)（FR1～FR4）和3 個(gè)高度可變抗原結(jié)合區(qū)即互補(bǔ)決定區(qū)（CDR1～CDR3），其中CDR3 是抗原特異性識別的區(qū)域，含有11 個(gè)氨基酸（圖1-D）。

表1 HIF-1α 單克隆ELISA 篩選結(jié)果Tab.1 Monoclonal screening of HIF-1α by ELISA

2.2 納米抗體表達(dá)、純化與結(jié)合性檢測

以挑選出的VHH（1A12）序列質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出大小約為400 bp 的VHH 片段（圖2-A）。將VHH 片段與PMD19-T 連接后再連接到pET-28a 表達(dá)載體上以構(gòu)建質(zhì)粒（圖2-B）。

圖2 質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.2 Construction of the plasmid

構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)原核表達(dá)和純化后，用考馬斯亮藍(lán)染色以及Western Blot 進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，考馬斯亮藍(lán)染色得到的條帶較單一（圖3-A）；Western Blot 檢測發(fā)現(xiàn)大小約為16 ku 的特異性條帶（圖3-B），說明該蛋白為表達(dá)所得的特異蛋白。

選取小鼠腦組織，免疫組織化學(xué)一抗試驗(yàn)組用HIF-1α 納米抗體，用PBS 作對照，可看出大腦組織中的免疫陽性信號（圖3-C），由此可見，HIF-1α 納米抗體可以與抗原HIF-1α 結(jié)合，用于HIF-1α 的組織定位。

Western Blot 試驗(yàn)中一抗用純化所得的HIF-1α 納米抗體，選取小鼠腦組織提取蛋白，結(jié)果顯示，HIF-1α 納米抗體作為一抗可以與抗原HIF-1α 結(jié)合，檢測到特異性的免疫陽性條帶，分子質(zhì)量約為100、120、130 ku（圖3-D），說明腦組織中表達(dá)HIF-1α。由此可知，制備的HIF-1α 納米抗體可用于Western Blot 試驗(yàn)的一抗以檢測組織中HIF-1α 抗原表達(dá)的相對定量。

2.3 HIF-1α 納米抗體對黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

將HIF-1α 納米抗體加入B16 細(xì)胞培養(yǎng)基中，用CCK-8 法檢測并觀察對B16 細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，在HIF-1α 納米抗體作用下，在3～9 h 內(nèi)，加入HIF-1α 納米抗體的B16 細(xì)胞表現(xiàn)出了抑制效果（圖4-A）。將HIF-1α納米抗體加入B16細(xì)胞培養(yǎng)基中，用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測HIF-1α 納米抗體對B16細(xì)胞遷移的影響。B16 細(xì)胞在培養(yǎng)0、12、24、36 h 檢測，在12 h 時(shí)已出現(xiàn)抑制細(xì)胞遷移現(xiàn)象（圖4-B）。

圖4 HIF-1α 納米抗體對B16 細(xì)胞增殖、遷移及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of HIF-1α nano-antibody on proliferation，migration，and expression of the related proteins in B16 cells

在CCK-8 法檢測HIF-1α 納米抗體抑制B16細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)上，提取HIF-1α 納米抗體處理15 h后的B16 細(xì)胞總蛋白，用Western Blot 檢測VEGF、RAS、ERK、RAC 和RAF 蛋白的表達(dá)量，與對照組相比，HIF-1α 納米抗體處理B16 細(xì)胞后其蛋白量均呈下降趨勢（圖4-C、D）。

3 結(jié)論與討論

HIF-1α 亞基是堿性-環(huán)-螺旋（basic-helixloop-helix, Bhlh）–PAS（per/ARNT/Sim，PAS）)超家族成員之一[21]，HIF-1α 位于多種致癌和抑癌途徑的交匯點(diǎn)，包括PI3K/AKT 和MAPK/ERK 信號通路，而這些信號通路是分子信號網(wǎng)絡(luò)的核心，控制著許多細(xì)胞的生長、增殖、分化和生存，而腫瘤組織常高表達(dá)HIF-1α[22-23]。通過多種方式抑制HIF-1α 的表達(dá)有望成為治療黑色素瘤的方法。

本研究通過已建立的羊駝源黑素瘤噬菌體文庫，以HIF-1α 多肽進(jìn)行4 輪淘篩，篩選出1 株陽性單克隆菌株，經(jīng)過原核表達(dá)載體構(gòu)建并誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，鎳柱純化得到HIF-1α 納米抗體。所得的納米抗體抗原特異性識別區(qū)域CDR3 含有11 個(gè)氨基酸殘基超過了傳統(tǒng)抗體CDR3 的平均長度（7～9 個(gè)氨基酸殘基），可增大與抗原的接觸面積，因此其與抗原具有較好的親和性。VEGF 家族是一類血管調(diào)節(jié)因子[24]，新生血管生成是腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制之一，血管參與加速腫瘤生長、促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移等過程[25]。在黑素瘤細(xì)胞中，HIF-1α 納米抗體穿過細(xì)胞膜進(jìn)入胞質(zhì)中，與HIF-1α 結(jié)合后，抑制VEGF 下游靶基因表達(dá)，并抑制Ras 信號路徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)，同時(shí)使黑素瘤細(xì)胞中ERK 和P-ERK 表達(dá)下調(diào)，ERK 是絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPK）家族成員之一，該酶被激活后，成為磷酸化的ERK（P-ERK）。p-ERK 可以介導(dǎo)信號由胞漿向胞核傳遞，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化、分裂等多種生理過程，其異常表達(dá)在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[26]。并且發(fā)現(xiàn)HIF-1α 納米抗體在黑素瘤細(xì)胞中引起RAF1 表達(dá)下調(diào)，通過PLC-γ-PKC-Raf-MEKMAPK 信號通路使細(xì)胞增殖和遷移速度下降[27]。此外，在腫瘤組織中，由于新生血管管壁僅有1 層內(nèi)皮細(xì)胞，缺乏基底膜，內(nèi)皮細(xì)胞間常有裂隙，同時(shí)VEGF 本身可提高血管通透性，并刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放膠原酶使腫瘤細(xì)胞與腫瘤組織分離脫落，為腫瘤的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件[28]。因此，HIF-1α 納米抗體在黑素瘤組織中可能會通過抑制血管形成而成為抑制腫瘤生長和發(fā)展的新材料。

本研究獲得的HIF-1α 納米抗體分子質(zhì)量約為16 ku，沒有跨膜結(jié)構(gòu)，具有親水性。HIF-1α 納米抗體在構(gòu)建原核表達(dá)載體時(shí)加入了His 標(biāo)簽，將HIF-1α 納米抗體作為Western Blot 和免疫組織化學(xué)技術(shù)中的一抗，與組織細(xì)胞中的HIF-1α 特異性結(jié)合，使用HRP-His-tag 抗體作為二抗，來檢測HIF-1α在組織中的含量及分布。將自備的HIF-1α 納米抗體作用于B16 細(xì)胞時(shí)，HIF-1α 納米抗體與HIF-1α結(jié)合，直接影響下游靶基因VEGF，并引發(fā)該信號通路的下調(diào)，抑制B16 細(xì)胞的增殖和遷移，揭示其可能在黑色素瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著較為重要的作用，可作為基因治療黑色素瘤的靶點(diǎn)。