朱思明,李 標(biāo)

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院胸外科一區(qū),海南 海口 570311)

肺癌作為一種發(fā)病率及病死率都比較高的惡性腫瘤,起源于肺部的支氣管黏膜或腺體。肺癌在男女患者所患惡性腫瘤中,發(fā)病率占11.4%,肺癌一直是導(dǎo)致癌癥患者死亡的首要原因,占所有癌癥死亡的18%[1]。肺癌的發(fā)病率與吸煙、職業(yè)暴露(石、硅、鎳、煤煙等)、慢性阻塞性肺疾病、遺傳等因素有較明顯的關(guān)系[2]。由于肺癌早期缺乏較特異性的臨床表現(xiàn),因此臨床確診時(shí),患者大多已經(jīng)處于肺癌的中期或晚期[3]。雖然近些年隨著醫(yī)學(xué)水平的進(jìn)步,肺癌的治療得到了有效的改進(jìn),但是當(dāng)下患者的5年生存率還需進(jìn)一步提升[4]。因此,科研工作者們對(duì)肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的探索研究,力圖尋找新的、有潛力的、有效果的分子治療靶點(diǎn)。

Anillin肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(ANLN)最先是從果蠅的胚胎組織中提取到的一種蛋白質(zhì),研究者們發(fā)現(xiàn)其能夠與F-肌動(dòng)蛋白特異性地結(jié)合,因此將其命名為F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白[5]。在人類基因組中,ANLN基因(NM_018685)位于7p14.2,其含有24個(gè)外顯子,編碼相對(duì)分子質(zhì)量為123×103的1 125個(gè)氨基酸殘基[6-8]。在眾多的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白中,ANLN 作為細(xì)胞骨架中重要的組成成分,參與細(xì)胞的多種病理生理過程[9]。ANLN表達(dá)異常在多種癌癥中起到重要的作用,但是在肺癌中的作用研究較少,因此本研究采用在A549細(xì)胞中敲除ANLN基因,探討ANLN基因在肺腺癌細(xì)胞中增殖、遷移過程中的作用及部分機(jī)制,從而為尋找肺腺癌的治療靶點(diǎn)提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料 A549肺癌細(xì)胞(上海市干細(xì)胞技術(shù)有限公司)。經(jīng)由靶向ANLN-siRNA基因敲除技術(shù)得到的實(shí)驗(yàn)組(ANLN-A549組)及對(duì)照組(Ctrl-A549組)細(xì)胞均由廣州源井生物科技有限公司制備。磷酸鹽緩沖液(PBS)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA,0.25%),含酚紅、DMEM高糖培養(yǎng)基、FBS胎牛血清均購于美國Gibco公司。CCK-8試劑盒購于Biosharp生物科技有限公司。Transwell 試劑盒購于美國Corning 公司。結(jié)晶紫染液購于生工生物工程股份有限公司。4%多聚甲醛購于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞(屬于貼壁細(xì)胞)培養(yǎng)條件:首先配制含有 89%DMEM高糖培養(yǎng)基+10% FBS胎牛血清+1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的完全培養(yǎng)基,然后配制A549細(xì)胞懸液,后移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,最后放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)箱條件設(shè)定為溫度37 ℃、5%二氧化碳(CO2)、飽和濕度。每天使用顯微鏡仔細(xì)觀察所培養(yǎng)的細(xì)胞,并對(duì)細(xì)胞的生長狀態(tài)作出分析判斷,選擇每2～3天更換 1 次完全培養(yǎng)基。當(dāng)觀察到細(xì)胞生長融合度占80%左右時(shí),可以進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。

1.2.2CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分組為ANLN-A549組、Ctrl-A549組及空白組。將ANLN-A549組及Ctrl-A549組細(xì)胞消化離心后加入新鮮的完全培養(yǎng)基,制成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度為2×104個(gè)/mL。鋪4張96孔板,分別將已經(jīng)制備好的ANLN-A549組及Ctrl-A549組細(xì)胞懸液接種到96孔板中,空白組接種新鮮的完全培養(yǎng)基,每孔接種100 μL細(xì)胞懸液,每組5個(gè)復(fù)孔。同時(shí)在剩余空白孔加入PBS,防止液體蒸發(fā)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在5%CO2、37 ℃恒溫條件下繼續(xù)培養(yǎng)1 d。測(cè)定前,用10 μL移液槍在ANLN-A549組、Ctrl-A549組及空白組孔加入10 μL的CCK-8試劑,注意在加樣過程中避免在孔中產(chǎn)生氣泡,以免光密度(OD)值受到影響,混勻試劑后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱,恒溫孵育2 h。酶標(biāo)儀測(cè)量每組細(xì)胞在波長450 nm 處的OD值,并連續(xù)測(cè)量3 d,計(jì)算細(xì)胞的增殖倍數(shù)。

1.2.3細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分組為ANLN-A549組、Ctrl-A549組。將ANLN-A549組及Ctrl-A549組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度為1×105個(gè)/mL。接種于6孔板上,調(diào)整每孔細(xì)胞數(shù)量800個(gè)左右,將6孔板置于培養(yǎng)箱中,37 ℃恒溫培養(yǎng)14 d,每3天采用顯微鏡觀察1次,并更換完全培養(yǎng)基。當(dāng)6孔板中出現(xiàn)集落,且每個(gè)集落的細(xì)胞數(shù)超過50個(gè),吸棄完全培養(yǎng)基,PBS沖洗,4%多聚甲醛固定30 min,然后PBS緩慢沖洗2～3次,后加入適量結(jié)晶紫染液,染色20 min,最后PBS洗滌2～3次,將6孔板倒扣在網(wǎng)格紙上室溫晾干,用數(shù)碼相機(jī)拍照記錄細(xì)胞的克隆數(shù)量。細(xì)胞集落形成率=(集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.4Transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分組為ANLN-A549組、Ctrl-A549組。將ANLN-A549組及Ctrl-A549組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度為5×105個(gè)/mL。ANLN-A549組和Ctrl-A549組每組各3個(gè)Transwell小室,分組置于新的 24 孔板中,移液槍取100 μL無血清細(xì)胞懸液加入各個(gè)小室的上室,然后在各個(gè)下室內(nèi)添加 500 μL含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)1 d后去除24孔板,用鑷子夾住Transwell小室,棄去孔中培養(yǎng)液,PBS沖洗,4%多聚甲醛固定30 min,PBS緩慢沖洗2～3次,后加入適量結(jié)晶紫染液,染色20 min,PBS洗滌2～3次,擦去小室上層未轉(zhuǎn)移的細(xì)胞,用鑷子小心將每個(gè)Transwell小室膜取下,移至載玻片中央并用中性樹膠封片。封片后,在顯微鏡下拍照觀察,隨機(jī)選取視野拍100×照片3 張,計(jì)數(shù)后分析。

1.2.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分組為ANLN-A549組、Ctrl-A549組。將ANLN-A549組及Ctrl-A549組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度為1×105個(gè)/mL。培養(yǎng)24 h后,吸棄6孔板中完全培養(yǎng)基,然后加入不含血清的培養(yǎng)基,用200 μL的槍頭比著直尺,垂直于記號(hào)標(biāo)線進(jìn)行劃痕,槍頭始終保持垂直,盡量減少誤差。劃痕后使用PBS洗滌2～3次,除去劃下的細(xì)胞,然后加入無血清培養(yǎng)基,將6孔板置于培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。選擇0、12、24、48 h在熒光顯微鏡下進(jìn)行拍照,根據(jù)所拍攝的照片,使用Image J軟件打開圖片后,計(jì)算細(xì)胞劃痕面積均值,分析各組細(xì)胞遷移率,取 3 次的平均值。細(xì)胞遷移率(傷口愈合率)=(初始劃痕面積-t時(shí)刻劃痕面積)/初始劃痕面積。

2 結(jié) 果

2.1CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果 培養(yǎng)12、24、48、72 h時(shí),ANLN-A549組OD450值分別為0.727±0.038、0.820±0.020、1.293±0.025、1.638±0.029,Ctrl-A549組分別為0.794±0.014、0.923±0.024、1.793±0.020、2.592±0.026,空白組為0.342±0.003、0.369±0.005、0.318±0.005、0.308±0.004。ANLN-A549組細(xì)胞相比Ctrl-A549組,增殖明顯減緩,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注:與Ctrl-A549組比較,aP<0.000 1。

2.2細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果 分別將ANLN-A549組、Ctrl-A549組細(xì)胞接種于6孔板,培養(yǎng)14 d后,Ctrl-A549組與ANLN-A549組細(xì)胞的集落數(shù)分別為(157±14)、(55±9)個(gè)。2組細(xì)胞集落數(shù)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.3Transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ANLN-A549組、Ctrl-A549組遷移細(xì)胞數(shù)量分別為(109±8)、(322±17)個(gè)。ANLN-A549組較Ctrl-A549組的遷移數(shù)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

2.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移情況 Ctrl-A549 組與ANLN-A549組細(xì)胞培養(yǎng)24 h時(shí),細(xì)胞遷移率分別為(0.33±0.04)%、(0.11±0.01)%,48 h 時(shí)為(0.39±0.01)%、(0.16±0.02)%。ANLN-A549組相比 Ctrl-A549組,在24、48 h時(shí)細(xì)胞遷移率有較明顯的降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注:與Ctrl-A549組比較,aP<0.000 1。ANLN-A549組和Ctrl-A549組細(xì)胞遷移圖(左)及統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果(右)。

3 討 論

肺癌是對(duì)人類危害最嚴(yán)重的疾病之一,在世界范圍內(nèi),肺癌的發(fā)病率及病死率均在各惡性腫瘤中處于高位,近年來呈持續(xù)上升的一種態(tài)勢(shì),且趨于年輕化。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多程序、多基因共同作用的結(jié)果,早期臨床癥狀特異性差,診斷困難,大多數(shù)患者就診時(shí)已處于腫瘤進(jìn)展的中晚期。近些年來,隨著科技水平的逐漸升高,分子生物學(xué)的發(fā)展迎來了較為明顯的上升期,人們對(duì)肺癌的認(rèn)識(shí)尤其是肺腺癌基因?qū)哟蔚陌l(fā)病機(jī)制愈發(fā)全面深刻,如調(diào)控腫瘤生長的原癌基因及調(diào)控抑制生長的抑癌基因,無論是原癌基因突變或是抑癌基因缺失,它們之間的協(xié)調(diào)失衡是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因。

ANLN是一種為細(xì)胞分裂所必需的保守的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白,參與細(xì)胞的遷移和增殖[10]。ZHANG等[11]使用微陣列芯片技術(shù)對(duì)肝癌組織標(biāo)本進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),ANLN的CpG位點(diǎn)甲基化程度與Ctrl-A549組相比降低,而與此相反組蛋白中甲基化程度升高,敲除SMMC-7721肝腫瘤細(xì)胞中的ANLN基因,肝腫瘤細(xì)胞停留在G2/M期,從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的。此外,在肝臟腫瘤組織標(biāo)本中,ANLN大量表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi),且癌組織表達(dá)量相比癌旁組織明顯升高,與原發(fā)性肝癌相比轉(zhuǎn)移灶中ANLN表達(dá)水平明顯升高。ZENG等[12]敲除J82和5637膀胱癌細(xì)胞的ANLN基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞周期蛋白B1和D1的表達(dá)量明顯減少,腫瘤細(xì)胞停留在G2/M期,從而使腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力下降。WANG等[13]在胰腺癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)LASP1的上調(diào),而LASP1的上調(diào)可導(dǎo)致腫瘤的增殖、遷移、侵襲能力增加。與此相反,ANLN下調(diào)可以拮抗LASP1的作用,誘導(dǎo)miR-218-5p表達(dá),而miR-218-5p與 LASP1的 3′非編碼區(qū)(3′UTR)相結(jié)合。LI等[14]在生物信息學(xué)的研究中發(fā)現(xiàn),ANLN、SCN11A、LY6D、ZNF488、MYEOV 等基因的表達(dá)量在胰腺癌患者預(yù)后中扮演重要的角色,隨后研究發(fā)現(xiàn),ANLN的表達(dá)與T淋巴細(xì)胞的浸潤存在一定的關(guān)系,在T淋巴細(xì)胞減少的亞群中,ANLN表達(dá)量高的胰腺癌患者的預(yù)后相比于ANLN表達(dá)量低的患者預(yù)后更差,表明ANLN在胰腺癌患者的免疫治療中存在一定的應(yīng)用價(jià)值。ZHOU等[15]對(duì)71份乳腺癌腫瘤標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析,結(jié)果顯示ANLN在癌組織中的表達(dá)較癌旁組織升高。隨后通過基因敲除技術(shù)抑制ANLN基因在ZR-75-30和MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá),結(jié)果驗(yàn)證了敲除后的腫瘤細(xì)胞較未敲除的腫瘤細(xì)胞在增殖、侵襲及遷移等能力下降。上述結(jié)果表明,ANLN在腫瘤細(xì)胞中的上調(diào)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力增加,下調(diào)ANLN的表達(dá)可以拮抗這種作用。

本細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn),加入CCK-8試劑后ANLN-A549組的OD450值較Ctrl-A549組低,且隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長,差距變大,因此本實(shí)驗(yàn)證明,敲除ANLN基因后的A549細(xì)胞增殖能力減弱。同樣細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,培養(yǎng)一定時(shí)間后,ANLN-A549組細(xì)胞在形成集落的數(shù)量上低于Ctrl-A549組細(xì)胞,印證了敲除ANLN基因可以有效抑制A549細(xì)胞的增殖能力。在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中,ANLN-A549組細(xì)胞劃痕操作后的24、48 h,細(xì)胞遷移率相比Ctrl-A549組細(xì)胞均表現(xiàn)出較為明顯的降低,因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,敲除ANLN基因后的A549細(xì)胞遷移能力明顯下降。同時(shí)采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)對(duì)敲除ANLN基因的A549細(xì)胞的遷移率進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)一定時(shí)間后,ANLN-A549組遷移至小室膜另一側(cè)的細(xì)胞數(shù)量明顯少于Ctrl-A549組,再次證明敲除ANLN基因后可以有效抑制A549細(xì)胞的遷移能力。在DENG等[16]通過生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn),ANLN在肺腺癌中的表達(dá)升高,通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)和蛋白質(zhì)印跡法證實(shí)高表達(dá)的ANLN與腫瘤的預(yù)后不良、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和惡性程度呈正相關(guān)。本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了其部分結(jié)果,顯示ANLN的表達(dá)導(dǎo)致肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移能力增加。

本實(shí)驗(yàn)通過降低ANLN在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá),結(jié)果顯示肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移能力下降。因此,ANLN有望成為一個(gè)有效的分子治療靶點(diǎn),參與臨床上對(duì)肺腺癌患者的治療。未來仍需要進(jìn)一步的研究來闡明ANLN分子的作用機(jī)制,為發(fā)展治療肺癌的有效靶向藥物提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。