曾毅文，龔放*

重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院兒科，重慶 402160

新生兒急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是威脅新生兒生命健康的主要疾病之一[1]。在新生兒重癥監(jiān)護室(neonatal intensive care unit，NICU)住院治療的患兒中，新生兒ARDS 發(fā)病率為10%，病死率高達35%～46%[2]。ARDS臨床表現(xiàn)為氣促、呼吸窘迫、低氧血癥、雙肺透光度降低甚至白肺等[3]。維生素A(VA)作為人體代謝必需的微量營養(yǎng)素，可參與胎兒肺部早期的發(fā)育并影響肺部的免疫功能[4]。不同地區(qū)新生兒中維生素A缺乏(vitamin A deficiency，VAD)的發(fā)生率雖然不同，但總體均較高[5]。目前，有研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生ARDS的早產(chǎn)兒血清VA 水平較同胎齡未發(fā)生ARDS 的早產(chǎn)兒更低，且VAD早產(chǎn)兒更容易發(fā)生ARDS[6]；Elfarargy等[7]發(fā)現(xiàn)，VAD 可加重ARDS 的嚴重程度，并可作為新生兒ARDS 發(fā)展和嚴重程度的預(yù)測指標。以上研究結(jié)果均提示VAD 與新生兒ARDS 的嚴重程度密切相關(guān)，但其機制尚未闡明。本課題組前期建立VAD新生大鼠ARDS 模型，檢測肺泡灌洗液(BALF)時發(fā)現(xiàn)肺泡巨噬細胞為主要的差異細胞[8]。本研究擬檢測肺泡巨噬細胞M1及M2型的極化情況，探討VAD調(diào)節(jié)ARDS的作用及其機制，旨在改善新生兒ARDS的預(yù)后，為臨床防治該疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 54 只180～220 g SPF 級SD 大鼠，其中雌鼠36只，雄鼠18只，購自重慶醫(yī)科大學動物中心。RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；CD206、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)及誘導型一氧化氮合酶(iNOS)等ELISA試劑盒(美國Abcam 公司)；丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成科技有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)及TUNEL 檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；F4/80 抗體(美國CST 公司)；CD86 抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；VAD 飼料及VA 正常(VAN)飼料(常州鼠一鼠二生物科技有限公司)，脂多糖(LPS，美國Sigma-Aldrich公司)；RNA引物(上海生物生工有限公司)。本研究已通過動物倫理委員會審查(AMUWEC20219010)，并嚴格按照動物倫理委員會要求完成實驗。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備及分組 24只SD雌鼠在孕前2周給予VAD 飼料(400 U VA/kg)喂養(yǎng)，12只SD 雌鼠則予以VAN飼料(2300 U VA/kg)喂養(yǎng)；雄鼠均給予普通常規(guī)飼料。將SD 大鼠按照雌∶雄=2∶1 的比例合籠交配12 h 后取出雌鼠，隨后繼續(xù)分別給予VAD 及VAN 飼料喂養(yǎng)至新生大鼠生后7 d，分別獲得VAD(n=40)及VAN(n=20)新生大鼠模型[8]。從VAD新生大鼠中選取20 只，于生后第2 天一次性給予腹腔注射VA(25 μg VA/只，相當于人體內(nèi)1個月1000 U/d的劑量)，獲得VAD 挽救(VAD recover，VADR)新生大鼠模型。將VAD 新生大鼠分為VAD ctrl 組(n=10)與VAD組(n=10)，VAN新生大鼠分為VAN ctrl組(n=10)與VAN 組(n=10)，VADR 新生大鼠分為VADR ctrl 組(n=10)與VADR 組(n=10)，其中，VAD ctrl 組、VAN ctrl組及VADR ctrl組新生大鼠于生后第7天給予氣管內(nèi)灌注磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)；VAD 組、VAN 組及VADR 組新生大鼠于生后第7 天給予氣管內(nèi)灌注LPS(5 mg/kg)4 h，分別構(gòu)建各組新生大鼠ARDS模型[9]。

1.2.2 新生大鼠一般情況、BALF中細胞計數(shù)檢測及病理學形態(tài)觀察 記錄各組新生大鼠一般情況。建模后4 h斷頸處死各組新生大鼠，并以無菌PBS灌洗并收集BALF，予以過濾器過濾除去BALF 中的黏液后，在4 ℃條件下、500 r/min 離心5 min，涂片后用May-Grunwald-Giemsa 染色，用于細胞分類計數(shù)。建模后4 h取肺組織標本，觀察各組新生大鼠肺組織出血、水腫等情況。取肺組織樣本固定、包埋、切片、染色、封片后，在顯微鏡下觀察肺組織病理損傷情況。肺組織濕干比(W/D)檢測：取新生大鼠右上肺葉稱重；隨后將樣本置于60 ℃烘箱中72 h烘干，取出后再次稱重；肺葉濕重與烘干后重量的比值即為W/D[10]。

1.2.3 ELISA 檢測血清中的VA 含量及肺組織中炎性因子的表達情況 收集各組大鼠的血液，在4 ℃條件下，3000 r/min 離心10 min，取上清液，用PBS 稀釋后檢測各組大鼠的VA含量。取出凍存的新生大鼠肺組織標本，按比例(1 mg組織：5 μl裂解液)加入組織裂解液，加入蛋白酶抑制劑，勻漿后于4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清液，各炎性因子指標檢測嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 比色法檢測各組氧化應(yīng)激情況 在100 mg 肺組織中加入PBS勻漿，樣本于4 ℃條件下、1000 r/min離心10 min，取上清。(1)SOD 活性檢測：各組樣本分別取20 μl 上清液后加入200 μl 工作液；繼續(xù)加入20 μl稀釋緩沖液及20 μl酶工作液，充分混合；混合后樣本于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min；用酶標儀在450 nm 處讀數(shù)[11]。(2)MDA 含量檢測：酶標儀預(yù)熱30 min 以上，將各組待測標本分別加入MDA 檢測工作液、樣本、蒸餾水，立即混勻；混合液在100 ℃水浴中保溫60 min 后，置于冰浴中冷卻，常溫10 000×g離心10 min。吸取200 μl 上清液于微量玻璃比色皿中，測定各樣本在532 nm處的吸光度[12]。

1.2.5 qRT-PCR 檢測肺部炎性因子水平 將肺組織樣本按說明書步驟提取RNA后測定其濃度；將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA 為模板進行擴增。以GAPDH為內(nèi)參照，計算目的基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequence

1.2.6 TUNEL 檢測各組細胞凋亡情況 肺組織標本進行包埋、切片及脫蠟后，用蛋白酶K工作液修復(fù)，破膜工作液破膜；按試劑說明書步驟加入相應(yīng)試劑后將樣本置于37 ℃濕盒內(nèi)孵育2 h；BSA 封閉后加入TDT酶，再給予dUTP于37 ℃下避光孵育50 min；滴加DAPI 染液，避光孵育10 min，PBS洗3次；封片后置于Eclipse Ci正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像[13]。

1.2.7 免疫熒光染色檢測肺泡巨噬細胞極化情況取肺組織樣本包埋后行冷凍組織切片，冷丙酮固定10 min后，再用10%山羊血清封閉1 h；加入F4/80抗體(1：50)孵育2 h后加入CD86抗體(1：200)，4 ℃孵育過夜。同時設(shè)置Isotype 組，加入抗體同種屬、同來源、同型的免疫球蛋白作為對照，以排除假陽性。4 ℃孵育過夜后，加入羊抗兔二抗(1：100，F(xiàn)ITC 標記)孵育1 h，DAPI染色后PBS洗3次，封片后置于熒光顯微鏡下觀察[14]。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均為計量資料，符合正態(tài)分布且方差齊時以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；方差不齊時以M(Q1，Q3)表示，組間比較采用Kruskal-Wallis 非參數(shù)檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組新生大鼠一般情況、血清VA 含量及肺組織損傷情況比較 取生后7 d的新生大鼠建模。建模前，VAD 新生大鼠體重較VAN 新生大鼠體重減輕、體格偏小、毛發(fā)稀疏；而VADR 組新生大鼠一般情況較好，毛發(fā)光滑，發(fā)育良好。與VAN 組比較，VAD新生大鼠血清VA含量明顯降低(P<0.05)(圖1A)，而VADR 組無明顯差異；與VAD 組比較，VADR 組血清VA含量明顯增高(P<0.05)(圖1A)。與VAN組比較，VAD 組新生大鼠表現(xiàn)為更為嚴重的氣促、呼吸窘迫，肺部組織水腫、充血情況更為明顯，W/D明顯增高(P<0.05)，而VADR組無明顯差異；與VAD組比較，VADR 組新生大鼠肺組織水腫、充血情況明顯減輕，W/D 明顯降低(P<0.05)(圖1B)。HE 染色結(jié)果顯示，VAN ctrl組、VAD ctrl組及VADR ctrl 組肺組織屏障完整，炎性細胞浸潤較少；與VAN 組比較，VAD 組新生大鼠肺組織炎性細胞浸潤更嚴重，屏障損傷更明顯；與VAD 組比較，VADR 組新生大鼠肺組織炎性細胞浸潤減少，肺損傷減輕(圖1C)。

圖1 各組新生大鼠VA含量及肺組織損傷情況比較Fig.1 Comparison of VA content and lung tissue damage in neonatal rats in each group

2.2 各組新生大鼠BALF中主要細胞數(shù)量比較 BALF中，肺泡巨噬細胞含量最高，且為主要的差異細胞。與VAN 組比較，VAD 組BALF 中細胞總數(shù)、中性粒細胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)均明顯增多(P<0.05)，而VADR 組細胞總數(shù)、中性粒細胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義；與VAD 組比較，VADR 組細胞總數(shù)、中性粒細胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)均明顯減少(P<0.05)。進一步檢測BALF 中肺泡巨噬細胞數(shù)量發(fā)現(xiàn)，與VAN 組比較，VAD 組BALF 中巨噬細胞數(shù)增多(P<0.05)，而VADR組中巨噬細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義；與VAD 組比較，VADR 組中肺泡巨噬細胞數(shù)明顯減少(P<0.05)。而VAN ctrl 組、VAD ctrl 組及VADR ctrl 組所有指標差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖2)。

圖2 各組新生大鼠BALF中細胞數(shù)量檢測情況Fig.2 Detection of cells count in the bronchoalveolar lavage fluid of neonatal rats in each group

2.3 各組新生大鼠肺泡巨噬細胞極化及炎性因子表達情況比較 免疫熒光染色檢測顯示，與VAN組比較，VAD組肺泡巨噬細胞M1標志物CD86表達水平明顯升高(P<0.05)，而VADR 組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與VAD 組比較，VADR 組肺泡巨噬細胞M1標志物CD86表達水平明顯降低(P<0.05)。與VAN組比較，VAD組巨噬細胞M1極化免疫熒光強度增強(P<0.05)，而VADR 組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖3)。三組間M2極化下游標志物IL-10、Arg-1mRNA水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖4A)。與VAN組比較，VAD組巨噬細胞M1型分泌的炎性因子iNOS、IL-6、TNF-αmRNA 及蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05)，而VADR 組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與VAD 組比較，VADR 組新生大鼠iNOS、IL-6、TNF-αmRNA 及蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)(圖4B、C)。而VAN ctrl 組、VAD ctrl 組及VADR ctrl組所有指標差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖3－4)。

圖3 免疫熒光染色檢測各組新生大鼠M1型肺泡巨噬細胞標志物CD86的表達情況(×400)Fig.3 Immunofluorescence detection of M1 marker CD86 expression in four groups of rats (×400)

圖4 VAD對肺泡巨噬細胞M1、M2極化標志物及炎性因子的影響Fig.4 Effect of VAD on M1 and M2 polarization markers and inflammatory factors in alveolar macrophages

2.4 各組新生大鼠肺組織細胞凋亡及氧化應(yīng)激標志物比較 與VAN組比較，VAD組新生大鼠肺部組織細胞凋亡指數(shù)明顯增高(P<0.05)，而VADR組差異無統(tǒng)計學意義；與VAD 組比較，VADR 組新生大鼠肺部組織細胞凋亡指數(shù)明顯降低(P<0.05)(圖5A、B)。與VAN組比較，VAD組新生大鼠肺組織SOD活性降低、MDA 含量增高(P<0.05)，而VADR 組差異無統(tǒng)計學意義；與VAD 組比較，VADR 組新生大鼠肺組織SOD 活性增強、MDA 含量降低(P<0.05)(圖5C)。而VAN ctrl組、VAD ctrl組及VADR ctrl組所有指標差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖5)。

圖5 各組新生大鼠肺組織細胞凋亡及氧化應(yīng)激的比較Fig.5 Comparison of oxidative stress and apoptosis of lung tissue in neonatal rats in various groups

3 討 論

ARDS是新生兒常見的臨床危重癥之一，早期防治對改善新生兒ARDS 預(yù)后具有重要意義[15]。因此，本研究建立VAD 及VADR 新生大鼠ARDS 模型，檢測BALF中的主要細胞時發(fā)現(xiàn)，肺泡巨噬細胞含量最高，且為主要的差異細胞。肺泡巨噬細胞M1極化在ARDS的啟動過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]，其極化可促進下游標志物iNOS、TNF-α、IL-6等炎性因子的表達，誘導ARDS 肺部損傷[17]。Deng 等[18]發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞可通過增加肺泡巨噬細胞M2極化，增強肺泡巨噬細胞的吞噬能力，促進ARDS肺損傷的修復(fù)。

VA是維持人體代謝的必需營養(yǎng)素，但由于其難以通過胎盤進入胎兒體內(nèi)，因此新生兒血清和肝臟中的VA 含量明顯低于母體。圍產(chǎn)期發(fā)生的VAD 不僅可影響胎兒免疫器官的發(fā)育，還可增加肺部疾病的感染風險[19]。本研究采用Antoine 等[8]的方法建立VAD 大鼠模型，并參考Zhen 等[9]的方法建立VADR新生大鼠模型，結(jié)果顯示，與VAN組比較，VAD組新生大鼠血清VA 含量明顯降低，且一般情況較差，毛發(fā)稀疏，體格偏小，反應(yīng)欠佳；與VAD 組比較，VADR 組新生大鼠血清VA 含量增加，一般情況改善，毛發(fā)光亮，反應(yīng)尚可。提示VAD 及VADR 新生大鼠模型建立成功，符合現(xiàn)有的研究結(jié)果，且VAD可影響新生兒的生長發(fā)育及免疫功能。

VA參與了早期的肺發(fā)育、肺泡屏障形成及組織再生，在感染誘導的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。視黃酸是VA 的主要活性形式，在調(diào)節(jié)早期的肺發(fā)育、促進肺泡的形成及分支形態(tài)發(fā)生、維持細胞增殖及合成肺表面活性物質(zhì)中具有重要價值，還可促進肺表面活性物質(zhì)蛋白C 的表達，并預(yù)防ARDS 的發(fā)生。與健康兒童比較，VAD 患兒的呼吸道感染發(fā)病率約高2 倍；反復(fù)感染的患兒VA 水平降低，補充VA 則可緩解新生兒肺炎鏈球菌誘導的肺損傷[20]。程晨等[21]發(fā)現(xiàn)，發(fā)生ARDS 的早產(chǎn)兒血清VA水平較同胎齡未發(fā)生ARDS 的早產(chǎn)兒低。Elfarargy 等[7]發(fā)現(xiàn)，VAD 可加重ARDS 的嚴重程度，并可作為新生兒ARDS發(fā)展和嚴重程度的預(yù)測指標。本研究發(fā)現(xiàn)，與VAN 組比較，VAD 組新生大鼠表現(xiàn)為更為嚴重的肺部損傷，組織水腫、壞死、炎性細胞及免疫細胞聚集、屏障破壞，而補充VA 則可減輕VAD 新生大鼠的肺部損傷、組織水腫及炎性細胞聚集，提示VAD與兒童尤其是新生兒ARDS 的嚴重程度密切相關(guān)。但顧志勇[22]發(fā)現(xiàn)，血漿VA 濃度與ARDS 疾病的發(fā)生無明顯關(guān)系，研究結(jié)果出現(xiàn)爭議可能與ARDS 的嚴重程度有關(guān)，即機體存在輕度ARDS 時具有自我免疫調(diào)節(jié)功能，VAD 對ARDS 的影響較小，而存在中重度ARDS時，VAD則可誘導免疫失衡，加重ARDS肺損傷。

此外，本研究建立VAD及VADR新生大鼠ARDS模型，檢測BALF中主要細胞時發(fā)現(xiàn)肺泡巨噬細胞為主要的差異細胞。而Zhen 等[9]發(fā)現(xiàn)，VAD 可通過調(diào)節(jié)巨噬細胞M1與M2的平衡來參與新生兒的肺部慢性炎癥，調(diào)控支氣管肺部發(fā)育不良。為進一步探討在ARDS 中VAD 對肺泡巨噬細胞極化的影響，本研究檢測了各組大鼠M1 及M2 型標志物的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與VAN組比較，VAD組新生大鼠肺泡巨噬細胞M1 型極化增加，炎性因子TNF-α、IL-6 及iNOS 的表達水平明顯升高，而VADR 組新生大鼠補充VA 后其肺部巨噬細胞M1 型極化減輕，炎性因子表達水平明顯降低。與VAN組比較，VAD組新生大鼠肺泡M2 型極化及其下游標志物IL-10、Arg-1 表達水平差異均無統(tǒng)計學意義，提示VAD主要是通過誘導巨噬細胞M1 型極化來加重ARDS 的肺部損傷。Gundra 等[23]發(fā)現(xiàn)，VAD 可調(diào)節(jié)單核細胞衍生巨噬細胞在替代激活過程中轉(zhuǎn)化為組織駐留巨噬細胞的過程。Erkelens 等[24]發(fā)現(xiàn)，腸道巨噬細胞通過VA 和β葡聚糖受體抗體(Dectin-1)介導的信號轉(zhuǎn)導來平衡炎癥表達譜，調(diào)節(jié)腸道的炎癥反應(yīng)。Esteban-Pretel等[25]則認為，VA可影響肺泡上皮細胞和內(nèi)皮細胞的發(fā)育，甚至通過調(diào)控免疫細胞來抑制炎癥對內(nèi)皮屏障造成的損害。從以上研究結(jié)果推測，VAD 可能通過調(diào)節(jié)肺部免疫微環(huán)境，誘導巨噬細胞M1 型極化，從而加重新生兒ARDS 的肺部損傷。但VAD 對肺泡巨噬細胞M2型極化雖有下調(diào)趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，可能與LPS在誘導ARDS模型時的作用時間較短、對肺泡巨噬細胞M2極化作用影響較小有關(guān)。

視黃酸可通過增強細胞活力、促進更多細胞從G1期進入S 期、抑制細胞凋亡來促進細胞增殖。在ARDS 中，肺泡巨噬細胞M1 極化可激活下游的炎癥反應(yīng)，并誘導氧化應(yīng)激及細胞凋亡。Petiz等[26]發(fā)現(xiàn)，VA能夠減輕氧化鋅誘導的肝臟氧化應(yīng)激，從而減輕肝臟損傷。本研究進一步檢測各組新生大鼠肺組織的氧化應(yīng)激及細胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)，與VAN 組比較，VAD 組新生大鼠肺部損傷標志物MDA 含量增多、SOD 活性降低，且細胞凋亡增加；而VADR 組新生大鼠補充VA 后其肺部損傷標志物MDA 含量降低、SOD活性增強，細胞凋亡減少，提示VAD可增加肺部氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及細胞凋亡，從而加重新生大鼠ARDS肺部損傷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，VAD與新生大鼠ARDS的嚴重程度有關(guān)，并可調(diào)節(jié)肺泡巨噬細胞M1型極化及其標志物iNOS、CD86 的表達，增加肺部MDA 含量，并下調(diào)SOD 活性，上調(diào)炎性因子IL-6、TNF-α的表達及細胞凋亡，最終加重新生大鼠ARDS 的肺部損傷。因此，在新生兒尤其是早產(chǎn)兒中，早期VA干預(yù)可改善新生兒ARDS 的肺損傷嚴重程度及預(yù)后。但在復(fù)雜的機體免疫微環(huán)境中，VAD 如何調(diào)節(jié)巨噬細胞M1 型極化及具體分子信號通路仍有待進一步闡明。