許永偉，范瑩瑩，曹燁，陸支越，金建秋*

1北京大學人民醫(yī)院口腔科，北京 100044；2北京醫(yī)院口腔科/國家老年醫(yī)學中心/中國醫(yī)學科學院老年醫(yī)學研究院，北京 100730；3北京大學口腔醫(yī)學院口腔醫(yī)院修復科/口頜功能診療研究中心/國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心/口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實驗室/口腔數(shù)字醫(yī)學北京市重點實驗室，北京 100081

機體疼痛下行調(diào)制(descending pain modulation)系統(tǒng)的下行易化(促進疼痛感受)和下行抑制(抑制疼痛感受)作用是協(xié)調(diào)工作的，當這種平衡被打破時，則出現(xiàn)下行調(diào)制的失衡：如果下行易化處于優(yōu)勢，則表現(xiàn)為疼痛感受加重；如果下行抑制占主導，則表現(xiàn)為疼痛感受遲鈍或缺失[1-3]。疼痛下行調(diào)制系統(tǒng)的主要組成部分包括延髓頭端腹內(nèi)側(cè)區(qū)(rostral ventromedial medulla，RVM)、延髓尾端腹外側(cè)區(qū)(caudal ventrolateral medulla，VLM)和延髓網(wǎng)狀背側(cè)亞核(dorsal reticular nucleus，DRt)等[1-3]。RVM-VLM-DRt之間存在緊密的環(huán)路聯(lián)系，在下行調(diào)制機制中具有重要作用。RVM的雙向調(diào)節(jié)機制是下行調(diào)制的中繼站，已有較多深入的研究[1-3]。而目前關(guān)于DRt 的研究較少，少量研究傾向于認為DRt 主要參與下行易化調(diào)制[4]。目前的研究主要針對DRt神經(jīng)元機制，尚未見關(guān)于膠質(zhì)細胞在DRt參與的下行調(diào)制中的作用。本研究將利用課題組成熟的對咬合干擾致口頜面痛覺敏感模型[5-6]，對DRt 膠質(zhì)細胞參與咬合干擾所致口頜面疼痛的機制進行初步探討，旨在為口頜面疼痛的治療提供新的靶向腦區(qū)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD 大鼠33 只，體重180～200 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。24 h 晝夜交替，室溫25 ℃。自我賞罰實驗大鼠測試日預(yù)先禁食不禁水，其余時間自由飲食飲水；其余實驗大鼠自由飲食飲水。所有動物實驗均獲北京大學醫(yī)學部倫理委員會審批(LA2019353、LA2019354)。

1.2 大鼠自我賞罰行為學實驗 將24 只SD 大鼠隨機均分為假手術(shù)組、痛覺敏感維持組、痛覺敏感維持+DRt 損毀組，每組8 只。其中，假手術(shù)組大鼠于1%戊巴比妥鈉全麻下保持開口5 min，但不粘固牙冠；痛覺敏感維持組參考課題組既往的實驗方法[5]建立實驗性咬合干擾(experimental occlusal interference，EOI)模型，EOI后8 d在1%戊巴比妥鈉全麻下，用尖探針去除金屬冠；痛覺敏感維持+DRt 損毀組于DRt損毀后1 周建立EOI 模型8 d 后去除金屬冠，損毀藥物使用1 g/μl 鵝膏簟氨酸(ibotenic acid，IBO，MCE公司，中國)。實驗大鼠在1%戊巴比妥鈉麻醉下，將頭部固定在腦立體定位儀上，根據(jù)大鼠腦圖譜確定DRt坐標為前囟點后15 mm，左右旁開1.4 mm，從小腦表面進入，深度為6.5 mm。IBO 用生理鹽水稀釋至1 μg/μl。使用前1 d配制。將1 μl的尖頭微量注射器連接于微量注射泵上，雙側(cè)DRt給予0.3 μl IBO，持續(xù)5 min，注射后繼續(xù)留針3 min以防止藥物反溢。注射后縫合大鼠頭部傷口，實驗大鼠術(shù)后恢復1 周后EOI，EOI 后8 d 去除咬合干擾。大鼠自我賞罰行為學實驗采用Ugo Basile 面部疼痛測試儀(Ugo Basile Orofacial Stimulation Test System，ComerioVA，意大利)，具體測試方法參考文獻[7]。實驗流程見圖1。

圖1 行為學實驗流程圖Fig.1 The flowchart of experimental design

采用盲法(測試者不知道動物分組情況)進行行為學測試，記錄各組大鼠EOI，以及EOI 7、10、14 d 的自我賞罰實驗結(jié)果及體重。

1.3 DRt 免疫熒光染色實驗 將9 只SD 大鼠隨機均分為假手術(shù)組(n=3，處理同1.2)、痛覺敏感維持組(n=3，EOI 8 d 去除EOI 前)及痛覺敏感維持組6 d(n=3，EOI 8 d 去除EOI 后6 d)。用1%戊巴比妥鈉過量麻醉大鼠后行左心室灌注。先用250 ml 溫熱生理鹽水快速灌注，約300 ml 4%多聚甲醛灌流，然后取腦干及延髓以閂為中心頭向4 mm，尾向1 mm 組織塊，放入4%多聚甲醛中固定、OCT 包埋，冰凍切片，厚度為20 μm，每隔3片取出一片置于0.01 mol/L PBS溶液多孔皿中。取出4 ℃冰箱保存的組織漂片以0.01 mol/L PBS 浸泡，10%驢血清封閉液室溫封閉60 min，加入小膠質(zhì)細胞特異性標志物(OX-42)(1∶200，Abcam，美國)或膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)(1∶400，CST，美國)，4 ℃孵育過夜；0.01 mol/L PBS 浸泡，驢抗小鼠IgG 1∶200 室溫孵育90 min；0.01 mol/L PBS 浸泡、貼片、自然風干；防淬滅熒光封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察、拍片。熒光照片規(guī)格為512×512 像素，保證相同增益及曝光條件下進行半定量分析。使用ImageJ 軟件對GFAP、OX-42 的熒光面積及熒光強度進行半自動分析，每只大鼠選擇5 張腦切片進行分析。參考Colburn 的膠質(zhì)細胞活化分級標準[8]對大鼠DRt 水平膠質(zhì)細胞活化程度進行評價?；A(chǔ)染色：膠質(zhì)細胞體積正常，均勻散在分布，伸出廣泛細長的分支；輕度活化：膠質(zhì)細胞染色微增強，呈分支狀均勻分布；中度活化：膠質(zhì)細胞胞體增大，染色增強，突起變短增粗，部分細胞之間有交疊；重度活化：膠質(zhì)細胞胞體肥大，染色強陽性，突起短且粗，細胞相互之間重疊分布呈團塊狀。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料行正態(tài)性檢驗，呈正態(tài)分布者以x±s表示，各組不同時間點的自我賞罰行為學結(jié)果采用重復測量的方差分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗；各組相同時間點的機械刺激反應(yīng)閾值與自我賞罰行為學結(jié)果采用多因素方差分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗；對膠質(zhì)細胞染色結(jié)果進行多因素方差分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況 假手術(shù)組、痛覺敏感維持組及痛覺敏感維持+DRt損毀組大鼠在測試期間體重均出現(xiàn)緩慢增加，但各時間點差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖2A)。

圖2 不同組實驗大鼠體重情況與自我賞罰實驗行為學表現(xiàn)Fig.2 Time course of body weight and orofacial operant test in different groups of rats

2.2 DRt 損毀對大鼠自我賞罰痛覺敏感維持的影響 與假手術(shù)組比較，痛覺敏感維持組大鼠在8 d去除咬合干擾后總攝食時間縮短，在10、14 d 時差異有統(tǒng)計學意義[10 d：(190.8±28.6) svs.(293.3±31.4) s；14 d：(179.6±34.4) svs.(309.2±19.2) s；P<0.05]。而痛覺敏感維持+DRt損毀組大鼠在8 d去除咬合干擾后，總攝食時間延長，在14 d 時總攝食時間明顯長于痛覺敏感維持組，差異有統(tǒng)計學意義[(286.1±17.1) svs.(179.6±34.4) s，P<0.05]；在10、14 d時與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計學意義[10 d：(241.6±20.4) svs.(293.3±31.4) s；14 d：(286.1±17.1) svs.(309.2±19.2) s；P<0.05，圖2B]。

2.3 痛覺敏感維持模型中去除咬合干擾對DRt 星形膠質(zhì)細胞活化的影響 免疫染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組GFAP 陽性染色位于星形膠質(zhì)細胞的胞質(zhì)和突起，從較小的胞體向周圍發(fā)出細絲狀分支，呈現(xiàn)為基礎(chǔ)染色；痛覺敏感維持組星形膠質(zhì)細胞與假手術(shù)組比較無明顯變化；痛覺敏感維持組6 d星形膠質(zhì)細胞胞體增大，分支變粗增多，染色增強，部分分支偶有交疊，呈現(xiàn)為中度活化(圖3A)。半定量分析顯示，與假手術(shù)組比較，痛覺敏感維持組星形膠質(zhì)細胞的GFAP 熒光強度及熒光面積變化差異均無統(tǒng)計學意義，而痛覺敏感維持組6 d 星形膠質(zhì)細胞的GFAP 熒光強度及熒光面積均明顯增高(P<0.05)，且痛覺敏感維持組6 d 與痛覺敏感維持組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖3B)。

圖3 各組大鼠GFAP免疫熒光染色變化(A)及半定量分析(B)Fig.3 Expression of GFAP immunofluorescence staining (A) and semiquantitative analysis (B) in the rats of each group

2.4 痛覺敏感維持模型中去除咬合干擾對DRt 小膠質(zhì)細胞活化的影響 免疫染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組OX-42 染色陽性表達于小膠質(zhì)細胞的胞質(zhì)和突起，從較小的胞體向周圍發(fā)出爪狀分支，呈現(xiàn)為基礎(chǔ)染色；痛覺敏感維持組小膠質(zhì)細胞與假手術(shù)組比較無明顯變化；痛覺敏感維持組6 d 小膠質(zhì)細胞胞體增大，分支變粗增多，染色增強，部分聚集成團狀，呈現(xiàn)為中度活化(圖4A)。半定量分析顯示，與假手術(shù)組比較，痛覺敏感維持組6 d 小膠質(zhì)細胞的OX-42熒光強度差異無統(tǒng)計學意義，但熒光面積較假手術(shù)組明顯增大(P<0.05)，而痛覺敏感維持組OX-42熒光強度及熒光面積與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計學意義，且痛覺敏感維持組6 d與痛覺敏感維持組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖4B)。

圖4 各組大鼠OX-42免疫熒光染色變化(A)以及半定量分析(B)Fig.4 Expression of OX-42 immunofluorescence staining (A) and semiquantitative analysis (B) in the rats of each group

3 討 論

慢性口頜面疼痛是臨床治療的困境，臨床上可觀察到咬合因素相關(guān)的口頜面疼痛患者在咬合因素去除后的轉(zhuǎn)歸不同，部分患者早期去除咬合因素后疼痛可緩解，而另一部分患者即使咬合因素去除后疼痛仍然存在。本課題組前期建立了一個接近臨床、刺激可隨時去除、可模擬不同痛覺敏感狀態(tài)的咬合干擾相關(guān)的口頜面疼痛動物模型，證實在大鼠咬合干擾后8 d去除咬合干擾，大鼠的頜面部痛覺敏感仍持續(xù)存在，這與臨床上患者長時間存在咬合相關(guān)頜面部疼痛時對因治療(去除咬合)無效的情況相符[9-10]。因此，研究者對口頜面疼痛的下行調(diào)制機制進行了系列研究，揭示了不同痛覺敏感轉(zhuǎn)歸狀態(tài)的下行調(diào)制機制動態(tài)變化[5-6]，且發(fā)現(xiàn)了RVM內(nèi)介導下行易化調(diào)制的ON-神經(jīng)元和下行抑制調(diào)制的OFF-神經(jīng)元的可塑性變化及二者的功能失衡在不同痛覺敏感轉(zhuǎn)歸狀態(tài)下的作用，且RVM星形膠質(zhì)細胞也參與了口頜面痛覺敏感維持的下行調(diào)制[5-6]。而DRt 是參與下行易化機制的重要腦區(qū)，其能夠接受來自RVM以及更高級中樞的調(diào)控信息，最終將下行調(diào)控信號投射至脊髓，這是本研究實驗設(shè)計的重要基礎(chǔ)[4]。

本研究中，損毀DRt 痛覺敏感維持模型去干擾前疼痛表現(xiàn)與未損毀時差異無統(tǒng)計學意義，而在去干擾后疼痛逆轉(zhuǎn)，提示DRt 在該模型去干擾后的痛覺敏感維持期起下行易化作用。在外界刺激存在時，DRt 膠質(zhì)細胞無明顯活化，而當去除外界刺激后，疼痛上行傳遞通路作用減弱，但疼痛仍未恢復，此時膠質(zhì)細胞活化，提示DRt 的膠質(zhì)細胞是痛覺敏感維持期下行易化的相關(guān)機制之一。

DRt 中的膠質(zhì)細胞參與下行易化的具體機制尚不明確，但下行易化的信號最終需要通過神經(jīng)纖維傳遞，而神經(jīng)元作為神經(jīng)纖維疼痛信號傳遞的基礎(chǔ)在疼痛的產(chǎn)生與傳遞中發(fā)揮著重要作用。有關(guān)上行傳遞通路的研究已發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元細胞間存在著密切的相互作用。以脊髓為例，外周炎癥或損傷后初級傳入神經(jīng)末梢會釋放趨化因子、炎性介質(zhì)等作用于膠質(zhì)細胞受體，刺激膠質(zhì)細胞活化。膠質(zhì)細胞中絲裂原活化蛋白激酶磷酸化導致促炎細胞因子[如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-6等]的產(chǎn)生及釋放，這些促炎細胞因子一方面通過自分泌或旁分泌的方式形成自反饋作用，另一方面能夠與神經(jīng)元受體結(jié)合，增強神經(jīng)元活性。有研究顯示，IL-1β、TNF-α能夠促進突觸后N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的突觸傳遞并增加這類受體在神經(jīng)元細胞膜上的表達；膠質(zhì)細胞的活化與神經(jīng)元細胞的敏化之間相互促進，形成了慢性疼痛機制中脊髓背角的一個正反饋循環(huán)[11-12]。在下行調(diào)制研究中，部分研究也指出下行調(diào)制系統(tǒng)中神經(jīng)元與膠質(zhì)細胞間可能存在類似的作用機制[13-14]。Wei等[13]發(fā)現(xiàn)，在三叉神經(jīng)病理性疼痛大鼠中，RVM的小膠質(zhì)細胞在建模后1～3 d 出現(xiàn)早期活化，隨后在RVM 還出現(xiàn)了持續(xù)至少28 d 的星形膠質(zhì)細胞活化，并在14 d 出現(xiàn)峰值；RVM注射膠質(zhì)細胞抑制劑可明顯減弱手術(shù)誘導的機械痛覺敏感。該研究進一步發(fā)現(xiàn)，RVM的星形膠質(zhì)細胞通過細胞因子TNF-α及IL-1β作用于神經(jīng)元的NMDA受體，使NMDA受體磷酸化，提示RVM星形膠質(zhì)細胞活化分泌的TNF-α和IL-1β參與了維持神經(jīng)病理性疼痛的脊髓上機制。Ni 等[14]發(fā)現(xiàn)，在骨癌疼痛模型中趨化因子CXC配體-受體趨化因子CXC受體2 信號通路參與了中腦導水管周圍灰質(zhì)的膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元相互作用下的下行易化。一項關(guān)于脊髓注射5-羥色胺3(5-HT3)受體激動劑誘發(fā)機械痛覺敏感的研究發(fā)現(xiàn)，注射后出現(xiàn)神經(jīng)元細胞敏化、細胞因子IL-18 表達上調(diào)、膠質(zhì)細胞活化，神經(jīng)元-細胞因子-膠質(zhì)細胞間的級聯(lián)反應(yīng)可能與5-HT3受體介導的下行易化相關(guān)[12]。上述研究提示，膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元之間的相互作用可能是本研究中膠質(zhì)細胞參與咬合干擾致口頜面痛覺敏感維持的具體機制。

本研究采用自我賞罰實驗進行痛覺敏感測試。自我賞罰實驗允許動物在接受獎賞或逃避傷害性刺激間做出選擇，與反射行為測試方法相比更客觀，更能反映動物高級中樞對傷害性刺激加工后的表現(xiàn)[15-16]。臨床上亦可觀察到咬合干擾相關(guān)口頜面疼痛患者，其焦慮、抑郁等評分較高[17-18]。前期研究還發(fā)現(xiàn)，海馬、前扣帶回等均參與了咬合干擾致口頜面痛覺敏感的中樞機制[19-20]，提示該咬合干擾模型的疼痛特點與情緒認知高級中樞功能活動等相關(guān)。因此，使用自我賞罰實驗方法結(jié)合反射行為實驗結(jié)果可更全面地反映該模型的行為學特點。該方法能夠反映高級中樞對疼痛的整合，且在實驗過程中操作方便，實驗大鼠適應(yīng)期訓練結(jié)束后，實驗人員每次測試僅需安裝操作儀器，并不需要對實驗大鼠反復操作，可減輕實驗動物的恐懼、緊張等心理，實驗結(jié)果穩(wěn)定，大鼠攝食水平穩(wěn)定。但該方法也存在一些缺點：如實驗周期長，適應(yīng)期訓練即需要2～3周，實驗動物存在訓練失敗的可能；實驗前還需對大鼠禁食。綜上，自我賞罰實驗是頜面部痛覺敏感測定的一種可靠、易行的行為學方法。

綜上所述，本研究探索了大鼠咬合干擾去除后痛覺敏感維持模型中DRt 膠質(zhì)細胞活化參與口頜面痛覺敏感的中樞機制，對臨床問題有一定提示意義。但本研究也存在一些局限：雖然發(fā)現(xiàn)咬合干擾后痛覺敏感維持與DRt 膠質(zhì)細胞活化相關(guān)，且膠質(zhì)細胞可能起下行易化作用，但并未進一步探索膠質(zhì)細胞下行易化的深入機制。因此，未來可進一步關(guān)注下行調(diào)制機制中膠質(zhì)細胞的具體作用機制、神經(jīng)元的作用及神經(jīng)元-膠質(zhì)細胞的相互作用等，以研究更高級中樞在頜面部疼痛中的復雜調(diào)控機制，助力于減少頜面部慢性疼痛的發(fā)生，緩解疼痛患者的癥狀，促進其身心健康。