溫才潔，張志舟，蔡建華，梁柳泳，林 揚，潘燦盛，張 飛

(廣東省科學院測試分析研究所(中國廣州分析測試中心)，廣東省化學測量與應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣東省保健食品功效成分檢測與風險物質(zhì)快速篩查工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070)

冬蟲夏草真菌屬于子囊菌綱，麥角菌科，蟲草屬[1-2]。它主要分布在我國西藏、青海、甘肅、貴州、四川、云南等高寒地帶，是我國特有的名貴滋補強壯的藥用類真菌[3-4]，其氣微腥、味稍苦，性甘平，且具有增強免疫力、化痰止咳、保護肝臟及腎臟、抗腫瘤、降低血糖、調(diào)節(jié)心血管、促進造血、抗菌、抗病毒抗驚厥和對神經(jīng)系統(tǒng)的鎮(zhèn)靜等作用[5-6]，在醫(yī)生上主要是用于治療虛弱咳嗽、氣喘咯血、腰酸背痛、急性腎功能衰退、慢性腎炎及支氣管炎、高血脂、腫瘤和心率失常等多種臨床疾病[7-9]。

近年來由于野生蟲草過度采摘導致蟲草數(shù)量急劇下降，為了彌補天然蟲草資源的不足，人工培育蟲草的研究逐漸興起[10]。蟲草頭孢菌粉先由北冬蟲夏草中分離得到蟲草菌和蝙蝠蛾擬青霉菌種，再經(jīng)過人工發(fā)酵培養(yǎng)后過濾、干燥獲得的子實體[11-12]。蟲草頭孢菌粉含有豐富的蟲草酸、氨基酸、蟲草素、蟲草多糖和微量元素等活性物質(zhì)，其中蟲草酸是其主要活性成分之一[13]。蟲草酸又稱D-甘露醇，具有增強機體免疫力，提高血漿滲透壓，利尿和減輕局部組織水腫等作用[14]。目前，測定D-甘露醇的方法有液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、離子色譜法、氣相色譜法和分光光度法等[15-20]。其中分光光度法和離子色譜法干擾比較大，操作過程比較繁瑣，靈敏度不高等缺點，無法準確測定樣品中的甘露醇，測定的結(jié)果往往比真實值偏高；液質(zhì)聯(lián)用法雖然定性比較準確，但是測定實際樣品的含量準確性不高；氣相色譜法可以測定甘露醇的含量，但是由于甘露醇揮發(fā)性比較低，難以氣化，因此必須要對甘露醇樣品進行酯化或者硅烷化等處理，才能進一步檢測，在此過程中容易改變被測樣品的組分性質(zhì)。本實驗采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射測定蟲草頭孢菌粉中甘露醇的含量，針對蟲草頭孢菌粉中D-甘露醇的檢測并沒有現(xiàn)行有效的標準方法，而且蟲草頭孢菌粉基質(zhì)復雜，容易干擾D-甘露醇的測定。針對上述問題，本研究選用糖分析柱，優(yōu)化流動相的梯度洗脫程序，建立了高效液相色譜-蒸發(fā)光散射測定蟲草頭孢菌粉中D-甘露醇的分析方法。該方法可有效降低樣品基質(zhì)的干擾，準確度高，能為相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量控制提供方法參考。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀-蒸發(fā)光散射檢測器，美國安捷倫科技有限公司；JYL-C022E料理機，九陽股份有限公司；BSA224S電子天平，北京賽多利斯科學儀器公司；FB15067型超聲波清洗器，美國 Fisherbrand公司。

D-甘露醇(99.7%)，上海詩丹德標準技術(shù)服務(wù)有限公司；乙腈(色譜純)，美國 Honeywell公司；蟲草頭孢菌粉，市場；一級水，自制。

1.2 標準溶液配制

標準儲備液：稱取適量D-甘露醇于25 mL容量瓶中，加一級水超聲溶解后定容至刻度，配得質(zhì)量濃度為4.00 g/L的儲備液。系列標準工作液：用一級水將標準儲備液逐級稀釋成質(zhì)量濃度為2.00，1.00，0.400，0.200和0.100 g/L的系列標準工作液。

1.3 樣品前處理

將蟲草頭孢菌粉混合均勻后，準確稱取適量樣品(約含D-甘露醇25 mg)于50 mL容量瓶中，加入45 mL一級水，搖勻超聲40 min，冷卻至室溫后定容至50 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾上機。

1.4 色譜條件

色譜柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A相)-水(B相)，梯度洗脫：0～1 min，A為80%；1～16 min，A由80%降至55%；16～16.1 min，A由55%升至88%；16.1～20 min，A為80%；流速1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。蒸發(fā)光散射檢測器條件：漂移管溫度35 ℃；氮氣(N2)流速1.60 SLM。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取方法

目前甘露醇的提取方法有加熱回流、超聲提取、渦旋震蕩等方法，由于加熱回流操作比較繁瑣、對溫度的要求相對較高，實驗耗時比較長，提取效果受環(huán)境溫度等多個因素的影響，其中溫度影響比較大，溫度控制不好，提取效果就不太理想，渦旋震蕩很難對蟲草孢子粉里面的細胞進行破碎提取，因此提取效果一般。使用超聲提取法提取甘露醇時，相對其他方法提取效果最好，且超聲提取法最為簡便快捷、準確度相對比較高，易操作，自動化程度比較高，受外界的環(huán)境以及溫度的影響比較小。由于甘露醇易溶于水，微溶于醇，不溶于醚，水能快速地滲透到蟲草頭孢菌粉中的細胞內(nèi)，因此選用水進行超聲提取樣品中的甘露醇，就能夠?qū)崿F(xiàn)理想的提取效果。

2.2 色譜行為

精密移取供試樣液10 μL，按照1.4儀器工作條件進行測定D-甘露醇標準溶液和蟲草頭孢菌粉供試液，所得色譜圖見圖1，D-甘露醇出峰時間為10.0 min。由圖1可知D-甘露醇色譜峰形良好且無雜質(zhì)干擾。

圖1 標準和樣品色譜圖

2.3 檢測器的選擇及優(yōu)化

D-甘露醇紫外吸收較弱，需選用通用型檢測器[21]，一般首選蒸發(fā)光散射檢測器或示差折光檢測器。由于示差折光檢測器受外界壞境影響比較大(如壓力、溫度等)，靈敏度不高，系統(tǒng)平衡時間比較長，基線波動較大而且不適用于梯度洗脫，蒸發(fā)光檢測器受上述因素影響較小而且適用于梯度洗脫。因此選定蒸發(fā)光散射檢測器，蒸發(fā)光散射檢測器主要要考慮漂移管溫度和載氣流速兩大重要因素，漂移管的溫度會影響檢測器的響應(yīng)，溫度升高，流動相的蒸發(fā)慢慢趨于完全，儀器信噪比升高，但是過高的溫度會導致某些組分局部氣化，儀器信號響應(yīng)變差。霧化器的液滴形成會受霧化器載氣的流速影響，液滴形成的大小從而會影響檢測器的響應(yīng)，儀器的信噪比會隨著載氣的流速的增加而升高，當選擇漂移管溫度35 ℃；氮氣(N2)流速1.60 SLM時基線噪音最低，儀器的基線相對平緩。

2.4 色譜柱的選擇

D-甘露醇是屬于極性化合物，使用C18來分離時，甘露醇在色譜柱上幾乎未能被保留，所以常見的反相色譜C18不適合用來測定甘露醇含量，在色譜柱選擇上應(yīng)該選擇極性較為中等的柱子，由于氨基柱極性相對C18色譜柱來說比較弱，其固定相上的氨基可與甘露醇選擇性作用，從而達到其他雜質(zhì)完全分離的效果，減少干擾，因此本文選用氨基柱進行分析測定蟲草頭孢菌粉中甘露醇的含量，結(jié)果表明甘露醇在1.4的色譜條件下，分離效果比較好。

2.5 流動相的選擇及優(yōu)化

蒸發(fā)光檢測器使用時，為了延長檢測器以及色譜柱的壽命，盡量避免選用含有鹽的流動相，因此選用乙腈和水作為流動相，在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，流動相的乙腈的比例會直接影響色譜上的保留時間和分離效果，當采用等度洗脫時，分析耗時過長，難以在短時間內(nèi)對甘露醇進行更好的分離，因此在實驗過程中采取梯度洗脫，經(jīng)過多次試驗證明梯度洗脫條件為：0～1 min，A為80%；1～16 min，A由80%降至55%；16～16.1 min，A由55%升至88%；16.1～20 min時，可以有效地在20 min以內(nèi)達到比較好的分離度，并且樣品在此梯度洗脫條件下可以得到較好的分離度和測定效果。

2.6 柱溫優(yōu)化

甘露醇在室溫18～28 ℃條件下組分不能得到更好的分離，色譜峰峰型比較差，經(jīng)過多次試驗驗證，當柱溫在35 ℃時，對甘露醇的分離效果最好。

2.7 方法考察

2.7.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

分別取標準溶液、供試品溶液和空白溶液10 μL，在1.4的色譜條件進行測定，實驗結(jié)果表明，甘露醇在此條件下與其他組分干擾峰能達到基線分離，分離效果良好。

2.7.2 線性關(guān)系

以D-甘露醇系列標準工作液質(zhì)量濃度的自然對數(shù)為橫坐標(X)，對應(yīng)色譜峰面積的自然對數(shù)為縱坐標(Y)繪制標準曲線，求得線性回歸方程為：Y=1.72X+4.81，相關(guān)系數(shù)為0.999 5，可知D-甘露醇在0.100～2.00 g/L范圍內(nèi)線性良好。當稱樣量為2.0 g，定容體積50 mL時，以信噪比為3時，求得檢出限為1.0 g/kg。

2.7.3 精密度試驗

取D-甘露醇0.400 g/L的標準溶液上機測定，重復進樣6次，測得峰面積的RSD為3.6%，表明儀器精密度良好。

2.7.4 重復性試驗

稱取同一批樣品，平行制備6份供試液進行測定，求得D-甘露醇測定值RSD為5.8%，表明該方法重復性良好。

2.7.5 加標回收試驗

稱取蟲草頭孢菌粉6份平行樣，分別加入低、中和高3個質(zhì)量濃度的標液，n=2，求得加標回收率和相對標準偏差RSD見表1。由表1可知，D-甘露醇的回收率為93.5%～97.5%。

表1 加標回收試驗

2.8 實際樣品

采用本方法對8種實際樣品進行分析測定，測定結(jié)果見表2。

表2 實際樣品檢測結(jié)果

3 結(jié) 論

本試驗建立了蟲草頭孢菌粉中D-甘露醇的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射分析方法。本方法對檢測器、色譜柱、流動相、柱溫等條件進行優(yōu)化考察，最終結(jié)果表明采用Shodex Asahipak NH2P-50 4E色譜柱進行分離，以乙腈/水為流動相，進行梯度洗脫，柱溫為35 ℃的條件下測定蟲草頭孢菌粉中甘露醇的含量可有效減少樣品基質(zhì)干擾，確保結(jié)果準確可靠和高靈敏度。本試驗方法可為甘露醇質(zhì)量的控制提供科學的檢測依據(jù)，從而為規(guī)范人工冬草夏草的種植及加工工藝的選擇提供依據(jù)，同時也可為其他糖類化合物的測定提供技術(shù)借鑒。