謝麗君，蘇愛玲，陳佳琳，黃麗欣，劉爐英，劉青青

(廣東第二師范學(xué)院化學(xué)系，廣東 廣州 510303)

碳量子點(diǎn)(CDs)是一類尺寸小于10 nm的新型發(fā)光納米粒子，其主要由碳、氮、氧三種元素組成。碳量子點(diǎn)具有生物相容性、化學(xué)穩(wěn)定性、毒性低等特性。因此，碳量子點(diǎn)被廣泛應(yīng)用在光催化[1-2]、能源器件[3]、細(xì)胞成像[4]等領(lǐng)域。

咖啡酸是一種羥基肉桂酸的有機(jī)化合物，其能抗菌抗病毒和調(diào)節(jié)免疫等。因此，咖啡酸在臨床治療上發(fā)揮不可或缺的作用。但也有相關(guān)報(bào)道表明，過量的咖啡酸積累在人體內(nèi)會(huì)有一定的致癌風(fēng)險(xiǎn)[5]。在2017年，咖啡酸還被列為二類致癌物。因此，合理控制咖啡酸的攝入量和監(jiān)測(cè)人體內(nèi)咖啡酸含量是非常有意義的。但現(xiàn)存的一些方法或多或少存在著需要進(jìn)行一定的預(yù)處理、分析成本較高、檢測(cè)時(shí)間過長(zhǎng)等缺點(diǎn)，故需要開發(fā)一種新型的經(jīng)濟(jì)有效且簡(jiǎn)便快捷的測(cè)試方法。本文選用無水檸檬酸和N-(β-氨乙基-γ-氨丙基)甲基二甲氧基硅烷利用裂解法合成碳量子點(diǎn)(CDs)。基于咖啡酸能使該碳量子點(diǎn)發(fā)生熒光猝滅的原理，設(shè)計(jì)和開發(fā)一種基于碳量子點(diǎn)的熒光探針用于定量檢測(cè)咖啡酸。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

無水檸檬酸和N-(β-氨乙基-γ-氨丙基)甲基二甲氧基硅烷(AEAPMS)，阿拉丁試劑公司；咖啡酸(AR)，麥克林生化科技有限公司；咖啡酸片，德州徳藥有限公司。其它試劑均為分析純?cè)噭?。?shí)驗(yàn)用水均來來自超純水機(jī)純化的超純水(18.2 MΩ·cm)，上海樂楓生物科技有限公司。

F97Pro熒光分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；FEI talosf200s透射電鏡，賽默飛世爾科技有限公司；Tensor27傅立葉變換紅外光譜儀，德國(guó)布魯克公司；穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀FLS1000，美國(guó)愛丁堡；濱松量子效率測(cè)試系統(tǒng)，日本濱松光子學(xué)株式會(huì)社。

1.2 碳量子點(diǎn)的合成

在氮?dú)夥諊?，?0 mL的N-(β-氨乙基-γ-氨丙基)甲基二甲氧基硅烷(AEAPMS)放入100 mL三頸燒瓶中并開始升溫。當(dāng)三頸燒瓶?jī)?nèi)溶液達(dá)到240 ℃時(shí)，在劇烈攪拌的情況下將0.5 g的無水檸檬酸快速加入到三頸燒瓶中并保持1 min。最后，用石油醚充分洗滌3次得到最終產(chǎn)物，即可獲得碳量子點(diǎn)[6]。將制得的有機(jī)硅烷化碳量子點(diǎn)用超純水在棕色的容量瓶中配制成1 mg/mL的碳量子點(diǎn)儲(chǔ)備液并將其放在4 ℃冰箱中避光保存。

1.3 咖啡酸的測(cè)定

取2 mL的碳量子點(diǎn)儲(chǔ)備液和2 mL的不同濃度的咖啡酸溶液，混合均勻并反應(yīng)5 min。然后，測(cè)定混合溶液在激發(fā)波長(zhǎng)為380 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm，增益為600 V時(shí)的熒光值并計(jì)算F0/F-1的值，其中F0為不存在咖啡酸時(shí)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為存在咖啡酸時(shí)的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳量子點(diǎn)的表征

通過TEM、FTIR、UV-vis光譜和熒光光譜對(duì)CDs的顯著特征進(jìn)行分析和討論。如圖1a所示，CDs的透射電鏡圖顯示合成的CDs呈現(xiàn)球形，平均粒徑約為1.5nm，尺寸較為均一。如圖1b所示，CDs紅外譜圖比AEAPMS的紅外譜圖多了一處在 1 652 cm-1的特征峰，該特征峰主要是由C=ONR振動(dòng)引起的，這個(gè)典型的信號(hào)表明CDs表面成功鈍化。為了深入了解CDs的光學(xué)特性，探究了CDs的UV-vis吸收光譜與熒光光譜。如圖1c所示，合成得到的CDs在UV-Vis吸收光譜中顯示出明顯的特征吸收且集中在356 nm處，在熒光光譜中顯示激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別是380 nm和463 nm。如圖1d所示，在340～380 nm范圍內(nèi)激發(fā)時(shí)，CDs會(huì)在463 nm處顯示出強(qiáng)烈的光致發(fā)光。隨著激發(fā)波長(zhǎng)的進(jìn)一步增加，發(fā)射波長(zhǎng)開始出現(xiàn)紅移、光致發(fā)光強(qiáng)度降低和半峰全寬增寬的現(xiàn)象，這說明合成的CDs對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)具有依賴性。

圖1 CDs的透射電鏡圖(a)；CDs和AEAPMS紅外對(duì)比圖(b)；CDs的UV-Vis吸收光譜、熒光發(fā)射譜和激發(fā)譜(c)；CDs在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光光譜(d)

2.2 碳量子點(diǎn)的穩(wěn)定性

為了更好的構(gòu)建熒光探針，分析和討論了CDs的穩(wěn)定性。如圖2a所示，CDs在紫外光下連續(xù)照射12 h后熒光強(qiáng)度變化幅度很小。如圖2b所示，CDs處于較高的離子濃度下，其熒光強(qiáng)度變化幅度非常小。見圖2c和圖2d，在pH值為3～11的PBS和BR緩沖體系中，CDs的熒光強(qiáng)度均沒有發(fā)生大幅度的變化。這寫現(xiàn)象均表明CDs的熒光穩(wěn)定性較強(qiáng)。通過濱松量子效率系統(tǒng)測(cè)試得到該碳量子點(diǎn)的量子產(chǎn)率為67%。

圖2 激發(fā)時(shí)間對(duì)CDs熒光強(qiáng)度的影響(a)；n溶劑對(duì)CDs熒光強(qiáng)度的影響(b)；PBS體系中pH對(duì)CDs熒光強(qiáng)度的影響(c)；BR體系中pH對(duì)CDs熒光強(qiáng)度的影響(d)

2.3 條件優(yōu)化

為了構(gòu)建的熒光探針能更好的應(yīng)用在檢測(cè)咖啡酸當(dāng)中，研究了分散溶劑對(duì)CDs熒光強(qiáng)度的影響以及反應(yīng)時(shí)間對(duì)CDs-CA體系猝滅程度的影響。如圖3a所示，CDs分散在超純水中熒光強(qiáng)度是最大的。如圖3b所示，加入咖啡酸溶液后，CDs的熒光開始猝滅，并在5 min內(nèi)趨于平穩(wěn)狀態(tài)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇超純水作為反應(yīng)溶劑和反應(yīng)時(shí)間選為5 min。

圖3 分散溶劑對(duì)CDs熒光強(qiáng)度的影響(a)；反應(yīng)時(shí)間對(duì)CDs-CA體系熒光猝滅程度的影響(b)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

基于咖啡酸能使CDs發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象，構(gòu)建一種用于檢測(cè)咖啡酸的熒光探針。見圖4a，在咖啡酸濃度為0.5～120 μM時(shí)，隨著咖啡酸濃度的不斷增加，CDs熒光強(qiáng)度不斷下降。根據(jù)CDs的熒光猝滅強(qiáng)度和咖啡酸濃度的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖4b所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的校正方程為F0/F-1=0.007 1c+0.000 2。R2=0.999 36。方法的最低檢出限為0.051 μM。與其他檢測(cè)咖啡酸的方法相比，本研究方法有著更低的檢出限或較寬的檢測(cè)范圍，詳見表1。

表1 不同方法檢測(cè)咖啡酸的比較

圖4 咖啡酸濃度對(duì)CDs熒光強(qiáng)度的影響(a)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(b)

2.5 選擇性

為了驗(yàn)證CDs對(duì)咖啡酸具有選擇性，將咖啡酸與一些常見陽(yáng)離子(Na+、Mg2+、Ca2+)、糖類(葡萄糖、蔗糖)、氨基酸(丙氨酸、甘氨酸、胱氨酸)進(jìn)行比較。見圖5，與其他物質(zhì)相比，CDs在存在咖啡酸溶液時(shí)，熒光猝滅程度最高。這表明其他物質(zhì)不能使熒光探針發(fā)生猝滅現(xiàn)象或者猝滅程度較小。

圖5 不同物質(zhì)對(duì)CDs的熒光猝滅效果相比

2.6 熒光猝滅機(jī)理的探究

為了探究熒光猝滅機(jī)理，分析CDs在存在和不存在咖啡酸情況下的UV-vis吸收光譜圖。如圖6a所示，CDs在356 nm處有吸收峰，CA在285～320 nm范圍內(nèi)有著吸收帶。而當(dāng)CDs加入CA后，出現(xiàn)了新的吸收峰。因此，推測(cè)是有基態(tài)復(fù)合物生成而導(dǎo)致熒光猝滅，該反應(yīng)的猝滅機(jī)制可能是靜態(tài)猝滅。為了進(jìn)一步推斷該反應(yīng)的猝滅機(jī)制，故通過測(cè)定熒光壽命來判斷猝滅機(jī)制。如圖6b所示，τ0/τ≈1(τ0是CDs的熒光團(tuán)的壽命，τ是引入猝滅劑(CA)后的熒光團(tuán)的壽命)，因此，可以表明該反應(yīng)的猝滅機(jī)制是靜態(tài)猝滅。

圖6 CDs、CA和CDs加入CA后得紫外可見-吸收光譜(a)；CDs和CDs加入CA后的熒光壽命曲線(b)

2.7 實(shí)際應(yīng)用

為了驗(yàn)證構(gòu)建的基于有機(jī)硅烷化碳量子點(diǎn)的熒光探針是否能進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用，本研究將該熒光探針應(yīng)用在檢測(cè)市售咖啡酸片的咖啡酸含量當(dāng)中。見表2，計(jì)算所得的回收率為99.66%～103.47%，RSD為2.12%～3.24%。

表2 基于CDs的熒光探針用于檢測(cè)咖啡酸片中咖啡酸的結(jié)果(n=3)

3 結(jié) 論

本研究構(gòu)建一種用于檢測(cè)咖啡酸的碳量子點(diǎn)熒光探針，其合成方法簡(jiǎn)單、生物相容性好、熒光強(qiáng)度穩(wěn)定且高。該熒光探針與已經(jīng)報(bào)道的咖啡酸檢測(cè)方法相比，其有著更低的檢出限和更寬的檢測(cè)范圍。相信在以后更加深入的研究中，該熒光探針能廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等檢測(cè)領(lǐng)域中。