樊 鑫，朱夢(mèng)月，李云行，楊明利，李飛飛，趙軍軍，吳 云，侍慧慧

(1 南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院藥學(xué)部，江蘇 連云港 222000；2 江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇 連云港 222000；3 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222000)

羰基活性物質(zhì)(RCS)是常見(jiàn)的氧化應(yīng)激代謝產(chǎn)物，并且該代謝產(chǎn)物已經(jīng)被證實(shí)與多種疾病相關(guān)，如癌癥、糖尿病、肝臟疾病和心血管疾病等[1-4]。甲醛(FA)是最簡(jiǎn)單的具有式H-CHO的醛類，是一種反應(yīng)性羰基化合物，一直被視為人類毒素和致癌物質(zhì)。環(huán)境中的甲醛一般分為天然來(lái)源(如生物質(zhì)燃燒、腐殖質(zhì)、植被與微生物排放等)和人為來(lái)源(車輛排放等)。甲醛是一種無(wú)色的帶有刺激性氣味的氣體，它不僅具有活潑的化學(xué)性質(zhì)，而且還具有較強(qiáng)的生物活性，被廣泛用作許多工業(yè)材料和化學(xué)品的重要前體化合物，如其40%的水溶液又稱福爾馬林溶液，在醫(yī)學(xué)上常用作消毒劑和防腐劑。但是，甲醛真正進(jìn)入我們的生活和生產(chǎn)是從大量的使用建筑材料、涂料、裝潢材料以及粘結(jié)劑的時(shí)候開(kāi)始的[5]。

甲醛是具有較高活性的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，在細(xì)胞內(nèi)生理濃度范圍約為0.1～0.4 mM[2]，內(nèi)源性甲醛可通過(guò)多種酶促反應(yīng)產(chǎn)生(如脫甲基酶或氧化酶等)。甲醛作為一種最簡(jiǎn)單的醛，在正常的情況下，我們自身體內(nèi)有完整的代謝機(jī)制，一般可以通過(guò)酶促反應(yīng)將甲醛降解轉(zhuǎn)化為甲酸、CO2以及水，因此，活生物體中甲醛的濃度一般是保持在從低到高毫摩爾的動(dòng)態(tài)平衡范圍內(nèi)。但甲醛超標(biāo)對(duì)人體是有害的，甲醛濃度異常升高會(huì)誘導(dǎo)多種疾病的產(chǎn)生，如神經(jīng)退行性疾病、慢性肝臟疾病、癌癥和心臟疾病等[2，4]。

對(duì)于生物體來(lái)說(shuō)，甲醛也被列為高毒性復(fù)合生物體，因?yàn)樗c蛋白質(zhì)，核酸的強(qiáng)相互作用或受其他生物分子影響會(huì)導(dǎo)致其生物活性失活。人體處于外源性甲醛過(guò)量的環(huán)境中將對(duì)健康造成顯著威脅。人體吸入過(guò)量的甲醛后會(huì)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損，誘發(fā)癌癥甚至死亡[6]。內(nèi)源性甲醛的異常集聚、代謝失衡會(huì)引起甲醛應(yīng)激反應(yīng)，通過(guò)引發(fā)DNA錯(cuò)誤交聯(lián)及蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊、異常修飾從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性[7]。到目前為止，研究人員已經(jīng)證實(shí)許多疾病的病理進(jìn)程和甲醛濃度變化密切相關(guān)。例如，在患阿爾茨海默癥小鼠的腦組織中，研究人員觀察到甲醛濃度異常升高，高濃度的甲醛能夠誘導(dǎo)β淀粉樣蛋白錯(cuò)誤折疊積聚并引起τ蛋白過(guò)度磷酸化，從而損傷神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，最終導(dǎo)致記憶力減退和認(rèn)知障礙[8-9]。因此，清除神經(jīng)元和大腦組織中過(guò)多的甲醛在一定程度上能防止神經(jīng)病變，治療神經(jīng)退行性疾病[10]。實(shí)現(xiàn)甲醛高效率、高靈敏度及特異性的檢測(cè)將有助于我們深入理解甲醛相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理，從而發(fā)展出新的醫(yī)學(xué)方法用于神經(jīng)退行性疾病等甲醛相關(guān)疾病的治療[11-12]。

在過(guò)去的幾十年中，研究人員已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種檢測(cè)甲醛的技術(shù)，主要包括高效液相色譜法(HPLC)[13]、紫外可見(jiàn)分光光度法(UV-vis)[14]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[15]和電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)[16]。然而，色譜所用儀器價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜，對(duì)操作人員的要求較高。分光光度法操作簡(jiǎn)單，但對(duì)樣品的要求較高。電化學(xué)檢測(cè)方法重復(fù)性差，導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏差大。

與之相對(duì)的，通過(guò)結(jié)合熒光顯微鏡技術(shù)，使用熒光成像小分子熒光探針來(lái)研究活體生物系統(tǒng)中的生物物質(zhì)的方法，由于其高時(shí)空分辨率、無(wú)創(chuàng)性、高靈敏度、強(qiáng)特異性等優(yōu)點(diǎn)[17]，可在不同的生物環(huán)境中更直接和更容易地監(jiān)測(cè)甲醛。然而，能高效且選擇性地實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)活組織中的FA活性的探針仍然較少。

由于甲醛含有高反應(yīng)活性的羰基結(jié)構(gòu)，所以氨基是最常用的熒光探針識(shí)別基團(tuán)[18-19]。目前已報(bào)道的甲醛探針根據(jù)識(shí)別基團(tuán)的不同大致可以分為以下3類[20]：(1)以氨基(-NH2)為識(shí)別基團(tuán)，與甲醛反應(yīng)后形成亞胺產(chǎn)物，導(dǎo)致熒光信號(hào)改變[21]；(2)以肼(-NH-NH2)為識(shí)別基團(tuán)，與甲醛反應(yīng)后形成亞甲基肼基團(tuán)，導(dǎo)致熒光信號(hào)改變[22]；(3)以高烯丙基胺為識(shí)別基團(tuán)，與甲醛發(fā)生Cope重排反應(yīng)生成醛或者酚產(chǎn)物，導(dǎo)致熒光信號(hào)改變[23]。

基于此，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種新型的熒光探針F-4，以期實(shí)現(xiàn)高靈敏度、高選擇性的檢測(cè)FA的目的。此探針以鄰苯二胺為識(shí)別基團(tuán)，探針?lè)肿觾?nèi)存在光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)過(guò)程，猝滅了熒光團(tuán)的熒光，故而探針自身熒光微弱，在與FA反應(yīng)后，PET機(jī)制被阻斷，恢復(fù)了熒光團(tuán)的熒光，熒光發(fā)射波長(zhǎng)紅移，且熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

圖1 探針F-4 的結(jié)構(gòu)組成及作用原理

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

400YH核磁共振波譜儀，日本JEOL；Agilent-6410 LC/MS液質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司；Delta 600/2489高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；色譜柱，5C18-AR-II(4.6 mm×250 mm)，COSMOSIL；UV-2450紫外分光光度計(jì)，Shimadzu；FL-4600熒光光度計(jì)，Hitachi；LGJ-10D冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器有限公司；AY120電子天平，日本島津公司；WH-3渦旋混合儀，上海瀘西分析儀器廠有限公司；CHA-S氣浴恒溫振蕩器，江蘇正基儀器有限公司；柱層析硅膠(200～300目)，安徽良臣硅源有限公司。

其他試劑和溶劑均為分析純或化學(xué)純，購(gòu)自實(shí)驗(yàn)谷平臺(tái)。

本文中所合成的部分中間體化合物和目標(biāo)化合物均進(jìn)行了核磁(NMR)以及質(zhì)譜(ESI-MS)表征。所有的1H NMR和13C NMR都是由JEOL 400 MHz檢測(cè)。溶解化合物所用的氘代試劑(CDCl3、DMSO-d6)均以四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)；1H NMR和13C NMR的化學(xué)位移δ單位為ppm；耦合常數(shù)單位為Hz；用不同的字母表示化合物裂分的氫譜信號(hào)峰。

1.2 探針合成

圖2 探針F-4的合成路線

(1)化合物F-1的合成

將4-氯-3-硝基肉桂酸(1.8 g，7.91 mmol)，CuCl (24 mg，0.24 mmol)和NH3·H2O(10 mL)的混合物置于壓力罐中。將其置于120 ℃的電熱鼓風(fēng)爐中20 h。 反應(yīng)完成后，將固體殘余物溶于水中，將殘余CuCl固體濾出。用3 M HCl調(diào)節(jié)pH至7，有大量固體析出，過(guò)濾，濾渣用水洗滌，干燥，將固體通過(guò)柱色譜法純化(PE∶EA=2∶3)，得磚紅色固體1.11 g，產(chǎn)率為67.5%。1H NMR (400 MHz，DMSO-d6)δ 8.20 (d，J=2.0 Hz，1H)，7.86～7.78 (m，3H)，7.52 (d，J=15.9 Hz，1H)，7.04 (d，J=8.9 Hz，1H)，6.35 (d，J=15.9 Hz，1H).13C NMR (101 MHz，DMSO-d6)δ 168.25，147.73，143.15，134.11，130.43，127.63，122.45，120.46，116.97. MS (ESI)calculated for C9H8N2O4：208.17；found：m/z207.0[M-H]+。

(2)化合物F-2的合成

將碘代二苯碘乙酸酯(837 mg，2.6 mmol)和四乙基溴化銨(546 mg，2.6 mmol)溶于無(wú)水二氯甲烷(15 mL)并在室溫下攪拌5 min。之后，加入化合物F-1(500 mg，2.4 mmol)，并在室溫下反應(yīng)4 h。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)結(jié)束時(shí)，混合物用水稀釋并依次用10% NaHSO3(3×20 mL)，10% NaHCO3(3×20 mL)，水(2×20 mL)和飽和NaCl(2×20 mL)洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥，旋干。粗產(chǎn)物通過(guò)柱色譜法純化(PE∶EA=5∶1)，得到橙色固體360 mg，產(chǎn)率為61%。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ 8.03 (d，J=2.1 Hz，1H)，7.34 (dd，J=8.7，2.1 Hz，1H)，7.02～6.93 (d，1H)，6.77 (d，J=8.7 Hz，1H)，6.66 (d，J=14.0 Hz，1H)，6.15 (s，2H)；13C NMR (101 MHz，CDCl3)δ 144.32，135.02，132.82，125.61，123.94，119.39，105.48. MS (ESI)calculated for C8H7BrN2O2：242.0；found：m/z243.0[M+H]+。

(3)化合物F-3的合成

將化合物F-2(50 mg，0.2 mmol)和4-(N，N-二甲基氨基)苯基硼酸鹽(41.4 mg，0.2 mmol)溶于無(wú)水甲苯(15 mL)。 加入四(三苯基膦)鈀(3.46 mg，1.5% mmol)，四丁基溴化銨 (64.4 mg，0.6 mmol)和3 M K2CO3(3 eq)。 將反應(yīng)混合物在氬氣保護(hù)下于80 ℃攪拌6 h。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)結(jié)束后，將溶液用2 M鹽酸中和，將反應(yīng)混合物真空濃縮，用乙酸乙酯稀釋，飽和NaCl溶液(2×20 mL)洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥，旋干。固體通過(guò)柱色譜法純化(PE∶EA=3∶1)，得到黑色固體360 mg，產(chǎn)率為61%。1H NMR (400 MHz，DMSO-d6)δ 7.96～7.91 (d，1H)，7.69～7.64 (dd，1H)，7.44 (s，2H)，7.29 (d，2H)，6.84 (m，3H)，6.65 (d，2H)，2.85 (s，6H)；13C NMR (101 MHz，DMSO-d6)δ 150.30，145.76，133.28，130.56，127.75，127.32，126.57，125.63，122.86，122.63，120.29，112.80，40.51. MS(ESI)calculated for C16H17N3O2：283.1；found：m/z284.2[M+H]+。

(4)化合物F-4的合成

將化合物F-3(500 mg，1.77 mmol)溶于乙酸(20 mL)，加入Fe(1.19 g，21.2 mmol)。反應(yīng)混合物在75℃氬氣保護(hù)下攪拌2 h。用1 M NaOH調(diào)節(jié)pH至7，用乙酸乙酯稀釋。有機(jī)層用飽和鹽水(3×20 mL)洗滌，用無(wú)水Na2SO4干燥并旋干。通過(guò)柱層析(PE∶EA=1∶1)純化固體，得到所需的黑色固體產(chǎn)物120 mg，產(chǎn)率為26.8%。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ 7.31 (d，J=8.8 Hz，2H)，6.72 (d，J=1.8 Hz，1H)，6.69 (d，J=3.3 Hz，3H)，6.68 (s，1H)，6.56 (dd，J=8.0，1.9 Hz，1H)，6.46 (d，J=7.9 Hz，1H)，4.51 (d，J=51.5 Hz，4H)，2.90 (s，6H)；13C NMR (101 MHz，DMSO-d6)δ 149.80，135.41，127.51，127.14，126.68，125.84，123.60，117.14，114.86，113.01，112.06，40.64. HRMS (ESI)calculated for C18H21N3：253.1579；found：m/z254.1664[M+H]+。

1.3 探針溶液制備

精密稱取探針F-4固體3 mg，加入1.185 mL的DMSO溶解，制成濃度為10 mM的探針溶液，放入冰箱避光冷藏待用。使用前，加入DMSO梯度稀釋，每次稀釋10倍。

1.4 FA制備

配制10 mmol/L甲醛母液：用移液槍吸取9 991.9 μL的PBS緩沖液(10 mmol/L，pH=7.4)于15 mL的離心管中，再用10 μL的微量移液槍從37%的甲醛水溶液中吸取8.1 μL加于微量離心管中配成10 mL 溶液，并用微型渦旋混合儀振蕩混勻，于冰箱中(4 ℃)密封保存。使用前用PBS溶液逐級(jí)稀釋備用(每次稀釋10倍)。

2 結(jié)果與分析

2.1 探針F-4表征及HPLC純度分析

在探針合成過(guò)程中，所有中間體均經(jīng)過(guò)核磁1H NMR、13C NMR或高分辨質(zhì)譜的驗(yàn)證，確保所合成中間體的結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確，且終產(chǎn)物通過(guò)HPLC純化。

為了使探針檢測(cè)FA達(dá)到最佳效果，需保證其純度至少達(dá)到90%，純化后探針F-4的HPLC分析結(jié)果見(jiàn)圖3。通過(guò)對(duì)峰面積積分計(jì)算，其純度超過(guò)95%，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖3 F-4 HPLC分析圖

2.2 探針F-4檢測(cè)FA前后紫外變化

為保證實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，紫外及熒光實(shí)驗(yàn)皆配制3組平行樣品，檢測(cè)條件保持一致，最終結(jié)果取均值。

(1)精密量取之前配好的F-4溶液30 μL，加DMSO逐級(jí)稀釋至10 μM的濃度，取300 μL至石英比色皿中，以DMSO溶液為參比溶液，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其紫外最大吸收波長(zhǎng)。

(2)精密量取30 μL濃度為1 mM的FA加至240 μL的PBS緩沖液中，再加入濃度為100 μM的探針F-4溶液30 μL，渦旋混勻，置于37 ℃恒溫振蕩箱中振搖30 min，以PBS溶液為參比溶液，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其紫外最大吸收波長(zhǎng)。結(jié)果見(jiàn)圖4。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：探針F-4在未加入甲醛溶液時(shí)，紫外最大吸收峰位于380 nm處；探針F-4與甲醛溶液反應(yīng)后，380 nm處吸收峰消失，在450 nm處出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰，由此說(shuō)明，甲醛將探針F-4反應(yīng)完全并生成一種新物質(zhì)。

2.3 探針F-4檢測(cè)FA前后熒光變化

本實(shí)驗(yàn)熒光檢測(cè)條件為：窄縫10，10；電壓850 V。

取上述紫外實(shí)驗(yàn)中配置好的探針F-4溶液，分別以所測(cè)得的紫外最大吸收波長(zhǎng)380 nm和450 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，使用熒光光度計(jì)測(cè)量其發(fā)射波長(zhǎng)。

取上述F-4+FA溶液，以所測(cè)得的紫外最大吸收波長(zhǎng)450 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，使用熒光光度計(jì)測(cè)量其發(fā)射波長(zhǎng)。結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 F-4 檢測(cè)FA前后熒光變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：探針F-4在未加入甲醛溶液時(shí)，熒光強(qiáng)度較低，最大發(fā)射波長(zhǎng)為510 nm；探針F-4與甲醛溶液反應(yīng)后，熒光曲線在650 nm處出現(xiàn)了新的、明顯的且很強(qiáng)的特征發(fā)射峰，說(shuō)明探針F-4能夠與甲醛反應(yīng)生成具有熒光性質(zhì)的物質(zhì)，證實(shí)此探針可以有效的檢測(cè)FA。

3 結(jié) 論

為了能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)甲醛更高效、更方便的檢測(cè)，本研究基于PET熒光機(jī)制，設(shè)計(jì)合成了以鄰苯二胺為識(shí)別基團(tuán)的新型熒光探針F-4，并通過(guò)核磁與質(zhì)譜進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，HPLC分析其純度>95%，紫外實(shí)驗(yàn)表明F-4在檢測(cè)FA前后的紫外最大吸收波長(zhǎng)變化較為明顯，說(shuō)明探針F-4被甲醛反應(yīng)并生成了一種新的物質(zhì)。而熒光實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)-4與FA反應(yīng)后光譜紅移且熒光強(qiáng)度顯著提高，證實(shí)了此探針可以有效的檢測(cè)甲醛。