姚琳 顧斌斌 嚴(yán)瑾瑜 唐佩軍 沈興華 張建平 吳妹英

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)感染導(dǎo)致的慢性傳染病,雖然初治肺結(jié)核治療效果顯著,但藥物不良反應(yīng)卻導(dǎo)致了治療有效性及依從性的降低[1],其中以抗結(jié)核藥物性肝損害(anti-tuberculosis drug-induced liver injury,ATLI)最常見[2]。腸道菌群對維系宿主健康起著重要作用,它除了與疾病發(fā)生有關(guān),還能改變藥物的代謝、療效和毒性[3]。從生理學(xué)角度看,腸道菌群和腸道外器官間最重要的聯(lián)系之一是“腸-肝軸”[4]。腸道菌群失調(diào)會引起腸道屏障完整性的喪失,加速肝臟損傷[5]。本研究旨在通過高通量測序及生物學(xué)分析技術(shù),比較初治肺結(jié)核患者抗結(jié)核治療前后腸道菌群的差異,研究藥物治療對初治肺結(jié)核患者腸道菌群的影響,以期識別出與ATLI可能相關(guān)的菌群標(biāo)志物,為干預(yù)ATLI的發(fā)生開拓新思路。

資料與方法

一、資料收集

1 研究對象:收集2020年1月1日至2021年1月31日期間就診于蘇州市第五人民醫(yī)院的25名初治肺結(jié)核患者的外周血和糞便標(biāo)本。

2 診斷標(biāo)準(zhǔn):初治肺結(jié)核的判定標(biāo)準(zhǔn):依據(jù)《肺結(jié)核診斷》(WS 288—2017)[6],具有肺結(jié)核相關(guān)的臨床表現(xiàn)與體征,影像學(xué)、病原學(xué)、病理學(xué)等檢查有活動性結(jié)核病的依據(jù);且從未進(jìn)行抗結(jié)核治療。ATLI的判定標(biāo)準(zhǔn):依據(jù)中國《抗結(jié)核藥物性肝損傷診治指南(2019年版)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7],至少滿足以下一種及以上標(biāo)準(zhǔn):(1)活動性肺結(jié)核患者在使用了一線抗結(jié)核藥物之后,血清ALT水平≥3倍的正常值上限(ULN)和(或)TBIL升高≥2倍ULN。(2)血清 AST、ALP 和TBIL水平同時升高,且至少l項升高≥2倍ULN。(3)所有受試患者均需排除其他疾病或病因所引起的肝臟損傷。

3 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《肺結(jié)核診斷》(WS 288—2017)標(biāo)準(zhǔn)[6]。(2)年齡16～60歲。(3)首次確診且未接受過治療的患者。(4)口服標(biāo)準(zhǔn)化抗結(jié)核治療方案:2HREZ/4HR。(5)入組前肝功能正常。(6)納入本研究前1個月內(nèi)未使用過抗生素、益生菌等微生態(tài)制劑等。(7)所有受試者均長期(5年以上)居住在蘇州地區(qū),并且都自愿簽署了知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)懷孕、哺乳期婦女。(2)有消化道疾病的患者。(3)伴有嚴(yán)重的單一臟器或多臟器功能不全等疾病者。(4)伴有糖尿病、自身免疫性疾病、HIV 等患者。(5)抗結(jié)核治療中斷或因病情調(diào)整治療方案的患者。隨訪時間:本研究設(shè)定4次隨訪采樣時間點。第1次在患者診斷為肺結(jié)核病但尚未開始用藥時(T0),第2次在使用結(jié)核藥物治療1周時(T1),第3次在抗結(jié)核治療2周時(T2),第4次使用結(jié)核治療4周時(T4),采集這4個節(jié)點的糞便和血清學(xué)標(biāo)本。4周內(nèi)患者出現(xiàn)肝功能異常納入肝損傷組(ATLI組),采集出現(xiàn)肝損傷時(Tinjury)的糞便樣本,肝功能正常病例作為對照組(Non-ATLI 組)。本項目由蘇州市第五人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2021-026)。

二、研究方法

(一)運用縱向研究的方法,對入組患者抗結(jié)核藥物治療前后不同時間點的腸道菌群進(jìn)行比較,觀察抗結(jié)核藥物使用過程中菌群的變化,探究腸道微生物群的改變與藥物性肝損傷的關(guān)系。

(二)現(xiàn)場調(diào)查:收集研究對象的基本資料,包括性別、出生年月、體重、身高、居住地、吸煙史和飲酒史等;跟蹤隨訪抗結(jié)核治療期間患者發(fā)生肝功能異常的情況,記錄肝損時患者的臨床表現(xiàn)、血清學(xué)指標(biāo)。

(三)實驗研究

1 儀器與試劑 NanoDrop2000分光光度計(美國熱電公司);DNA 測序儀(Mi Seq)(美國 Illumina 公司);PCR 擴增儀、電泳儀(美國 BIO-RAD 公司);金屬浴、離心機(Thermo Fisher);MK-3酶聯(lián)儀(芬蘭雷勃公司);旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);微量加樣器(μL)(德國 Eppendorf 公司);-80℃超低溫冰箱、-20℃冰箱(美菱冰箱);ABI GeneAmp? 9700 型(美國ABI公司)。NEXTFLEX? Rapid DNA-Seq Kit(美國Bioo Scientific公司);E.Z.N.A.? soil DNA kit(美國Omega Biotek公司);AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(美國Merck公司);Agarose-Molecular biology grade(美國Invitrogen 公司);QuantusTMFluorometer(普洛麥格生物技術(shù)有限公司);FastPfu DNA Polymerase、5×FastPfu Buffer(北京全式金生物技術(shù)有限公司);無水乙醇(南通化學(xué)試劑有限公司)。

2 標(biāo)本收集與保存:(1)糞便樣本的收集:患者清晨留取糞便后放至無菌糞便盒中,立即冷藏并送至實驗室,采用無菌牙簽取糞便樣品中段0.2 g左右糞便標(biāo)本放置于滅菌凍存管中,并保存在-80℃ 冰箱。(2)血清標(biāo)本采集:抽受試者5mL左右外周靜脈血,常溫靜置,3000r/min離心10min,取血清,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3 肝功能指標(biāo)檢測:采用生化分析儀檢測血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、總膽紅素(total bilirubin,TBil)、直接膽紅素(direct bilirubin,DBil)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)水平。

4 糞便標(biāo)本DNA提取和PCR擴增:(1)糞便微生物DNA的提取:嚴(yán)格按照E.Z.N.A.? soil DNA kit (Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)說明書進(jìn)行入組患者糞便腸道微生物群落總DNA抽提。(2)DNA濃度及純度測定:NanoDrop2000測總DNA濃度并記錄;1%瓊脂糖凝膠電泳測DNA的提取質(zhì)量。抽提的糞便DNA-80℃保存?zhèn)溆谩?3)16S rDNA高變區(qū)的PCR擴增:使用正向引物(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和反向引物(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對16S rDNA的V3～V4 高變區(qū)進(jìn)行PCR擴增。(4)PCR產(chǎn)物純化及濃度的測定:將PCR產(chǎn)物加入離心管后震蕩混合,按照AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)說明書進(jìn)行膠回收。(5)測序文庫的構(gòu)建及高通量測序:根據(jù)NEXTFLEX DNA測序試劑盒的操作步驟建庫:①對基因組修復(fù)好的末端進(jìn)行接頭鏈接。②去除接頭自連的DNA片段。③PCR擴增整合文庫模板。④利用磁珠回收PCR產(chǎn)物,最終獲得文庫。通過NovaSeq PE250平臺實施后續(xù)的測序。

5 測序數(shù)據(jù)處理:通過fastp(version 0.20.0)和FLASH(version 1.2.7)軟件對序列數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和拼接。使用UPARSE軟件(version 7.1),通過97%相似度對序列進(jìn)行操作分類單元(Operational Taxonomic Unit,OTU)聚類,并去除嵌合體。使用RDP classifier(version 2.2) 對具有代表性的特定序列進(jìn)行物種分類注釋分析,比較Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫(v138),閾值設(shè)置為70%。Qiime2軟件分析樣本微生物群的Alpha多樣性指數(shù)。使用 Qiime(版本 1.9.1)計算UniFrac 距離矩陣。采用R軟件的limma包進(jìn)行組間差異菌群的分析。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、血清肝功能指標(biāo)變化

按照初治肺結(jié)核患者抗結(jié)核治療4周內(nèi)是否出現(xiàn)肝損傷,將25名患者分為肝損組(ATLI)12人和對照組(Non-ATLI)13人。將肝損組(ATLI)和對照組(Non-ATLI)患者抗結(jié)核治療前后的血清肝功能指標(biāo)進(jìn)行對比后發(fā)現(xiàn),兩組患者的血清肝功能指標(biāo)在治療前(T0)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(見圖1A);而血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)在肝損組患者出現(xiàn)肝損時(ATLI-Tinjury)和對照組患者治療4周時(Non-ATLI-T4)對比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(見圖1B)。

圖1 ATLI組和Non-ATLI組間不同時間點肝功能指標(biāo)的比較

二、樣本測序量及深度

79份樣本經(jīng)16S rDNA測序后進(jìn)行雙端序列的質(zhì)控、拼接、去噪,最后得到2230137條高質(zhì)量的序列,平均22385條序列/樣本,共生成1850個ASVs。對每個樣本隨機抽取13746條序列繪制稀疏曲線,發(fā)現(xiàn)當(dāng)測序深度達(dá)2000以上時曲線進(jìn)入平臺期,說明測序數(shù)據(jù)量足夠大,測序深度滿足實驗要求(見圖2)。

圖2 稀疏曲線

三、腸道菌群的Alpha多樣性

Alpha多樣性系特定生態(tài)環(huán)境內(nèi)物種的多樣性,主要用以評價以下兩方面:一是豐富度,即物種類別越高,豐富多樣性越高;二是均勻度,即菌落中不同物種的數(shù)目均勻程度越高,多樣性越高。因此,本研究選擇表示物種多樣性的Shannon指數(shù)、simpson指數(shù),物種均勻度的evenness指數(shù),物種豐富度的chao1指數(shù)、faith_pd指數(shù)以及observed_features指數(shù)來評價腸道微生物群Alpha多樣性的變化情況。肝損組(ATLI)和對照組(Non-ATLI)在T0到T4的縱向比較中發(fā)現(xiàn),chao1指數(shù)、faith_pd指數(shù)、observed_features指數(shù)在用藥后1周、2周、4周下降均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而Shannon指數(shù)在肝損傷組和對照組從T0到T4期的縱向比較中均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。因此,從T0到T4期的過程中,肝損組和對照組均表現(xiàn)為僅腸道菌群的豐富度下降,而物種多樣性未發(fā)生明顯的改變(見圖3)。

圖3 ATLI組和Non-ATLI組從 T0到 T4時α多樣性變化

四、腸道菌群的Beta多樣性

Beta多樣性是評價個體間微生物組成相似性的指標(biāo),受個體間物種種類差別的影響。通過對ATLI和Non-ATLI組患者T0到T4的動態(tài)比較后發(fā)現(xiàn),兩組患者在抗結(jié)核治療前(T0) 和抗結(jié)核治療4周(T4)對比時,在unifrac距離矩陣進(jìn)行主坐標(biāo)分析(Principle Co-ordination Analysis,PCoA)時均存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。表明肝損組和對照組患者在使用抗結(jié)核藥物治療后,腸道菌群的結(jié)構(gòu)均發(fā)生了改變(見圖4)。

圖4 ATLI組和Non-ATLI組從T0到T4時腸道菌群的PCoA分析

五、腸道菌群物種組成及組件豐度差異分析

79份樣本1850個ASVs共識別出11個門、17個綱、29個目、64個科、223個屬水平的細(xì)菌。Wilcoxon秩和檢驗分析表明,ATLI-TinjuryvsATLI-T0 時有12個菌屬的相對豐度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中腸桿菌(Enterobacter)、梭桿菌(Fusobacterium)、乳桿菌(Lactobacillus)、檸檬酸桿菌(Citrobacter)、魏斯氏菌(Weissella)、塞內(nèi)加爾厭氧菌(Senegalimassilia)在ATLI-Tinjury時的相對豐度明顯高于ATLI-T0,而產(chǎn)糞甾醇真桿菌、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、普拉梭菌科(Fusicatenibacter)、凸腹真桿菌、Family XIII AD3011 group、蘇黎世桿菌科(Turicibacter)在ATLI-Tinjury時的相對豐度顯著低于ATLI-T0(見表1)。

表1 肝損傷組從T0到Tinjury腸道菌群物種組成及組件豐度差異分析

(表2)結(jié)果顯示,對照組治療前及治療4周的動態(tài)變化中,有21個菌屬的相對豐度差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中梭桿菌屬(Fusobacterium)、DTU089在Non-ATLI-T4時的相對豐度均高于Non-ATLI-T0;而羅姆布茨菌(Romboutsia)、腸球菌(Enterococcus)、瘤胃球菌(Ruminococcus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、消化鏈球菌(Peptostreptococcus)、Oribacterium、纏結(jié)優(yōu)桿菌、metagenome、孿生球菌屬(Gemella)、奇異菌屬(Atopobium)、糞球菌(Coprococcus)、歐陸森氏菌(Olsenella)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、卡氏伯克霍爾德菌(Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia)、塞內(nèi)加爾菌屬(Senegalimassilia)、Lachnospiraceae UCG-010、薩特氏菌(Sutterella)、eligens group菌的相對豐度在Non-ATLI-T4 中均低于Non-ATLI-T0。

表2 對照組從T0到T4腸道菌群物種組成及組件豐度差異分析

六、LEfSe物種差異分析

如(圖5)所示,通過LEfSe差異分析,在ATLI-TinjuryvsNon-ATLI-T4組之間共篩選出17個具有顯著差異的分類群[P<0.05,線性判別分析(Linear discriminant analysis,LDA)>2]。其中,腸桿菌(Enterobacter)、乳桿菌(Lactobacillus)、Anaerosporobacter、Herbinix、變形桿菌(Proteus)、普雷沃氏菌屬9(Prevotella 9)在ATLI-Tinjury組明顯高于Non-ATLI-T4組;而產(chǎn)糞甾醇真桿菌(Eubacteriumcoprostanoligenes group)、Fusicatenibacter、奇異菌屬(Atopobium)、埃格特菌(Eggerthella)、Solobacterium、瘤胃球菌科的UBA1819(Ruminococcaceae UBA1819)、纏結(jié)優(yōu)桿菌(Eubacteriumnodatum group)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、Eubacteriumbrachygroup、Sellimonas、Lachnoclostridium在ATLI-Tinjury組明顯低于Non-ATLI-T4組。

圖5 肝損組和對照組的差異腸道菌群

七、腸道差異菌與肝功能指標(biāo)的相關(guān)分析

將17個腸道差異菌和血清肝功能指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,因Fusicatenibacter、奇異菌屬、埃格特菌、Solobacterium、產(chǎn)糞甾醇真桿菌、纏結(jié)優(yōu)桿菌豐度值低,無法進(jìn)行后續(xù)的分析,故最終選取11個差異菌與血清學(xué)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。如(圖6)所示,乳桿菌、Herbinix、Anaerosporobacter、[Eubacterium]brachy group、變形桿菌、普雷沃氏菌屬9、腸桿菌、考拉桿菌屬均與肝功能指標(biāo)AST、ALT存在相關(guān)性。

圖6 組間差異菌與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性分析

討 論

腸道菌群參與人體多個器官、組織的病理生理過程,在結(jié)核病發(fā)生、發(fā)展、治療、轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮了重要的作用。本研究將腸道菌群與抗結(jié)核藥物性肝損傷建立聯(lián)系,追蹤隨訪了25例初治肺結(jié)核患者治療前后腸道菌群的動態(tài)變化,并根據(jù)抗結(jié)核治療4周內(nèi)是否出現(xiàn)肝損傷分為肝損組(ATLI)和對照組(Non-ATLI),通過兩組之間的比較,旨在找出與抗結(jié)核藥物性肝損傷有關(guān)的差異腸道菌屬。

腸道菌群可以通過影響免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)、生長代謝等方式間接影響機體的健康狀況。已有研究證實,代表腸道菌群Alpha多樣性的Shannon指數(shù)被作為微生物組健康的重要指標(biāo)[8-9],Shannon指數(shù)越高,表明腸道菌群的多樣性越高,機體越健康。腸道菌群多樣性的下降與相關(guān)疾病的發(fā)生息息相關(guān),Alpha多樣性的下降可導(dǎo)致肥胖、代謝性疾病(糖尿病)、自身免疫性疾病、腫瘤、營養(yǎng)不良、炎癥性腸病等。結(jié)核病的一線藥物治療實際上是一個持續(xù)的、多藥聯(lián)合的抗生素應(yīng)用過程,已有研究證實抗結(jié)核藥物可影響腸道微生物群的構(gòu)成。本研究中觀察了抗結(jié)核治療前后不同時間段腸道菌群的縱向變化情況,發(fā)現(xiàn)在ATLI組和Non-ATLI組中,反映腸道菌群豐富度的chao1指數(shù)、faith_pd指數(shù)、observed_features指數(shù)均下降,而反應(yīng)物種多樣性的Shannon指數(shù)未發(fā)生明顯改變,這表明抗結(jié)核藥物及用藥時間僅改變了腸道菌群的豐富度,而物種多樣性未發(fā)生改變,這與Hu等人[10]的研究結(jié)果存在差異。本研究還進(jìn)行了腸道菌群β多樣性的分析,結(jié)果顯示ATLI組和Non-ATLI組患者在使用抗結(jié)核藥物治療后,菌群結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變,表明抗結(jié)核藥物影響了腸道菌群的整體結(jié)構(gòu)。然而,在對ATLI-Tinjury組和Non-ATLI-T4組進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn),兩組患者腸道菌群的β多樣性并無明顯差異?？紤]到兩組患者在治療前的疾病是相同的,并且都接受了相同的治療方案,因此無論抗結(jié)核治療后是否出現(xiàn)肝損傷,疾病本身及藥物種類對所有結(jié)核患者腸道菌群總的影響理論上應(yīng)該是相似的。

除此之外,本研究還進(jìn)行了腸道菌群物種組成及組件豐度差異的分析。通過Wilcoxon秩和檢驗分析發(fā)現(xiàn),兩組患者的腸道菌群都發(fā)生了明顯改變,其中ATLI組在T0和Tinjury兩個時間節(jié)點、Non-ATLI組在T0和T4兩個時間節(jié)點分別有12和21個菌屬的相對豐度發(fā)生了明顯的變化。本研究的實驗結(jié)果表明:梭桿菌屬的相對豐度在兩組患者抗結(jié)核治療過程中均有增加,這與Fang[11]等人報道的結(jié)果不相符,導(dǎo)致研究差異的原因可能與測序方法不同、樣本量的大小等因素均有關(guān),故后續(xù)還需擴大樣本量深入探討梭桿菌屬在兩組患者抗結(jié)核治療過程中的變化情況。瘤胃球菌屬的相對豐度在兩組患者抗結(jié)核治療過程中均減少。兩組患者在抗結(jié)核治療過程中腸道菌群的物種組成及豐度變化既有差異,又有一定的相似性。原因可能有以下幾個方面:首先,抗結(jié)核藥物(尤其是廣譜抗生素利福平)及肺結(jié)核疾病本身可導(dǎo)致腸道菌群的組成變化;其次,由于“腸-肺軸”的存在,肺結(jié)核病所處的不同狀態(tài)也可影響菌群的組成[12];最后,兩組之間的差異性基于“腸-肝軸”理論,Chen[13]等人研究發(fā)現(xiàn),腸道菌群的變化與肝臟損傷存在顯著的相關(guān)性。肝損傷時,腸道微生物群中的瘤胃球菌、毛螺菌科、乳桿菌等有益菌的相對豐度明顯降低,腸道細(xì)菌致病性相關(guān)基因富集,可能會影響藥物及其代謝物和相關(guān)異生物的代謝和毒性,影響了宿主的平衡[14-16]。

最后,本研究還進(jìn)一步比較分析了兩組間的差異菌,并根據(jù)LEfSe分析,最終發(fā)現(xiàn)17個具有顯著差異的分類群,分別為腸桿菌、乳桿菌、Herbinix、Anaerosporobacter、變形桿菌、普雷沃氏菌屬9、產(chǎn)糞甾醇真桿菌、Fusicatenibacter、奇異菌屬、埃格特菌、Solobacterium、瘤胃球菌科的UBA1819、纏結(jié)優(yōu)桿菌、考拉桿菌屬、Eubacteriumbrachygroup、Sellimonas和Lachnoclostridium。本研究的最終目標(biāo)是找出與ATLI有關(guān)的菌群標(biāo)志物,我們將找到的可能與肝功能受損相關(guān)的菌屬與肝功能AST、ALT、TBIL、DBIL指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)乳桿菌、Herbinix、Anaerosporobacter、[Eubacterium]brachy group、變形桿菌、普雷沃氏菌屬9、腸桿菌、考拉桿菌屬均與肝功能指標(biāo)AST、ALT相關(guān),提示這些菌屬可能與抗結(jié)核藥物性肝損傷的發(fā)生有關(guān)。這與吳冬雪[17]等人研究所涉及的與肝損傷有關(guān)的菌屬不一致,這可能與不同地域研究對象自身腸道菌群特征差異有關(guān)。

綜上所述,本研究通過將抗結(jié)核治療期間出現(xiàn)肝損傷及未出現(xiàn)肝損傷的患者腸道菌群進(jìn)行對比,分析了兩組之間腸道菌群的變化,并試圖尋找與ATLI有關(guān)的腸道菌屬。最終發(fā)現(xiàn),初治肺結(jié)核患者在口服抗結(jié)核藥物治療后不同時間段的腸道菌群多樣性和β多樣性雖未見明顯差異,但物種豐富度及物種組成均發(fā)生了明顯的變化。本研究也找出了藥物性肝損傷時的細(xì)菌物種,為今后以腸道微生物為靶點干預(yù)抗結(jié)核藥物性肝損傷提供新的研究思路。