何 苗李佳航劉 鑫楊 威吳良文范晶晶

(1.武漢體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)院,武漢 430079;2.武漢體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練監(jiān)控湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430079)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver diseases, NAFLD)是指在排除過(guò)量飲酒及其他引起肝損害的因素下,以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積出現(xiàn)彌散性氣球樣病變?yōu)橹饕卣鞯穆约膊?也被認(rèn)為是在肝中表現(xiàn)出的代謝綜合征(metabolic syndrome,MS)[1]。 研究表明,NAFLD 不僅導(dǎo)致肝的損傷,也會(huì)增加肥胖、2 型糖尿病和心血管疾病等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn),其中心血管疾病是造成NAFLD 患者最常見(jiàn)的死亡原因之一[2]。 自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的自我降解過(guò)程,通過(guò)清除異常蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器而保護(hù)各種細(xì)胞和器官的功能損傷[3]。 線粒體自噬作為一種線粒體質(zhì)量控制機(jī)制,通過(guò)消除受損或多余的線粒體,早期可應(yīng)對(duì)各種心臟壓力和心臟病狀況,但其功能發(fā)生障礙會(huì)導(dǎo)致異常線粒體積聚、氧化應(yīng)激增強(qiáng)、活性氧增多、ATP 減少,而引起心肌結(jié)構(gòu)和功能損害[4]。 其中,線粒體自噬標(biāo)記蛋白PINK1 通過(guò)激活Parkin 的E3 泛素連接酶活性,使線粒體被p62 等自噬受體識(shí)別并降解,從而維持線粒體數(shù)量平衡。

運(yùn)動(dòng)作為一種非藥物的干預(yù)手段,可有效調(diào)節(jié)人體的生理平衡, 達(dá)到治病和預(yù)防的效果。Cuthbertson 等[5]研究表示,運(yùn)動(dòng)干預(yù)不僅可以降低肝脂肪含量,還可以改善胰島素抵抗及外周組織胰島素敏感性。 例如,適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動(dòng)干預(yù)可明顯改善心臟收縮和舒張功能,顯著增加左心室舒張末期血容量,是改善NAFLD 患者心功能不全的有效策略[6]。相關(guān)研究表明,運(yùn)動(dòng)可通過(guò)提高線粒體質(zhì)量、改善代謝異常從而對(duì)心血管疾病等并發(fā)癥產(chǎn)生良性影響[7-8]。 但最有效的運(yùn)動(dòng)方式和強(qiáng)度尚無(wú)共識(shí)。 一項(xiàng)研究表示,與不運(yùn)動(dòng)小鼠相比,中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)和高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)均能改善全身代謝參數(shù)來(lái)減少NASH 的進(jìn)展,但高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)在改善葡萄糖和胰島素耐量,減少肝脂肪變性和纖維化方面優(yōu)于中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)[9]。 此外,一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照研究比較了能量匹配的中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)和高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)對(duì)NAFLD 患者的影響,但這些患者在規(guī)律運(yùn)動(dòng)4 周后未能檢測(cè)到肝內(nèi)脂質(zhì)含量的差異[10]。 運(yùn)動(dòng)的強(qiáng)度和方式是否會(huì)影響運(yùn)動(dòng)在減輕NAFLD 及心肌損傷進(jìn)展方面的功效,以及這種有益作用的潛在機(jī)制尚不清楚。 因此,本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)長(zhǎng)期高脂飲食建立NAFLD 小鼠模型,并對(duì)其分別進(jìn)行8 周的中強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)和高強(qiáng)度間歇有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù),觀察不同有氧運(yùn)動(dòng)形式對(duì)NAFLD 小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)和線粒體自噬相關(guān)蛋白的影響,進(jìn)一步揭示運(yùn)動(dòng)改善代謝性心肌病的機(jī)制提供理論依據(jù),為臨床對(duì)NAFLD患者制定運(yùn)動(dòng)處方提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40 只SPF 級(jí)雄性C57BL/6J 小鼠,3 周齡,體重為17 ～18 g,購(gòu)自三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(鄂)2022-0012],動(dòng)物合格證編號(hào):42010200005 795。 飼養(yǎng)于武漢體育學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[SYXK(鄂)2021-0087],適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),保證干凈充足的飲食和飲水,其中高脂飼養(yǎng)少量多次,每周徹底更換1 次飼料,期間動(dòng)物房室溫維持在22～25℃,相對(duì)濕度控制在55%～65%,保持12 h/12 h 晝夜節(jié)律。 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)由武漢體育學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理倫理委員會(huì)IACUC 批準(zhǔn)(S0087-20210712-01),所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)福利倫理3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

電鏡固定液(型號(hào):G1102)購(gòu)自Servicebio 公司;PMSF(型號(hào):BL507A)購(gòu)自Biosharp 公司;油紅O 染色套裝及Masson 試劑盒購(gòu)自四維加科技有限公司;PINK1 兔抗(型號(hào):#6946)、Parkin 兔抗(型號(hào):#32833)、Beclin1 兔抗(型號(hào):#3738)、LC3A/B兔抗(型號(hào):#4108)購(gòu)自Cell Signaling Technology 公司;LAMP1 兔抗(型號(hào):ab208943)、PGC-1α 兔抗(型號(hào):ab72230)、GAPDH 兔抗(型號(hào):ab8245)購(gòu)自Abcam 公司;p62 鼠抗(型號(hào):EM0704)購(gòu)自中能華安科技有限公司;HPR 標(biāo)記的山羊抗兔二抗(型號(hào):ab8245)購(gòu)自啟動(dòng)子生物有限公司;HPR 標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(型號(hào):ab8245)購(gòu)自Servicebio 公司。

病理切片機(jī)(型號(hào):RM20116)購(gòu)自上海徠卡儀器有限公司;超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(型號(hào):Scientz-IID)購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司;高速冷凍離心機(jī)(型號(hào):HC-2518R)購(gòu)自安徽中科中佳儀器有限公司;垂直電泳儀(型號(hào):DYY-6C)購(gòu)自北京六一儀器廠;脫色搖床(型號(hào):TSY-B)購(gòu)自Servicebio 公司;超敏熒光化學(xué)發(fā)光成像儀(型號(hào):6300)購(gòu)自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司;透射電子顯微鏡(型號(hào):HT770)購(gòu)自日本東京日立集團(tuán);小動(dòng)物跑步機(jī)(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái),型號(hào):ZS-PT-Ⅲ)購(gòu)自北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型建立及分組

40 只SPF 級(jí)雄性C57BL/6J 小鼠,隨機(jī)分為普通飼養(yǎng)組(Chow 組,n=10)和高脂飼養(yǎng)(能量配比為蛋白質(zhì)20%,碳水化合物20%,脂肪60%)組(HFD 組,n= 30)。 實(shí)驗(yàn)第18 周,根據(jù)體重超過(guò)Chow 組小鼠20%的26 只HFD 組小鼠進(jìn)行模型鑒定檢測(cè),兩組隨機(jī)抽取2 只小鼠處死,做肝病理切片,對(duì)比觀察其肝脂肪變性情況,確定NAFLD 模型建立成功。 剩余Chow 組小鼠繼續(xù)編為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組(Control 組),將HFD 組小鼠隨機(jī)分為模型組(Model 組),中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)組(MICT 組)和高強(qiáng)度間歇有氧運(yùn)動(dòng)組(HIIT 組),每組8 只,所有小鼠維持原有飼養(yǎng)條件并根據(jù)不同運(yùn)動(dòng)方案對(duì)運(yùn)動(dòng)組小鼠施加運(yùn)動(dòng)干預(yù)。

1.3.2 運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案

所有運(yùn)動(dòng)組小鼠在正式運(yùn)動(dòng)干預(yù)前進(jìn)行1 周的跑臺(tái)適應(yīng)性訓(xùn)練,在最后1 d 進(jìn)行最大攝氧量檢測(cè),之后實(shí)行正式運(yùn)動(dòng)干預(yù),每周5 d,連續(xù)8 周。 運(yùn)動(dòng)方式包括中等強(qiáng)度有氧訓(xùn)練以及高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練,運(yùn)動(dòng)方案均在相關(guān)參考文獻(xiàn)基礎(chǔ)上改進(jìn)。 MICT組[11]:第1 周運(yùn)動(dòng)速度12 m/min,時(shí)間由40 min 遞增至60 min,第2 周速度增加至15 m/min(50%～75% VO2max),每天60 min,保持此運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度至實(shí)驗(yàn)結(jié)束;HIIT 組[12]:第1 周以18 m/min(90%～95%VO2max) 的速度在跑步機(jī)上跑2 min, 然后以5 m/min(30% ～40% VO2max) 休 息2 min, 總 共40 min,最大跑速每周增加1 m/min,在最后1 周獲得25 m/min 的最終速度。 訓(xùn)練時(shí)驅(qū)趕不跑步小鼠,保證充足的運(yùn)動(dòng)量。 實(shí)驗(yàn)期間,密切觀察每只小鼠體重變化、攝食量及精神狀態(tài)。

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用x2檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)取材

在最后一次運(yùn)動(dòng)干預(yù)結(jié)束48 h 后,所有小鼠稱重后斷頸處死,迅速取心肌組織并稱重。 根據(jù)體重和心臟重量計(jì)算心臟指數(shù):心臟指數(shù)=(心臟重量(g)/體重(g))×100%。 每組隨機(jī)取3 只小鼠左心室心肌樣本部分置于40%多聚甲醛固定后分別用油紅O 染色和Masson 染色觀察,部分心肌樣本放置于4%戊二醛電鏡固定液中儲(chǔ)存供后續(xù)電鏡檢測(cè),其余組織置于凍存管中于-80℃冰箱儲(chǔ)存待用。

1.3.4 油紅O 染色

小鼠肝組織固定好后,由不同濃度梯度酒精進(jìn)行脫水,置于二甲苯中透明,浸蠟、包埋和切片,將石蠟切片脫蠟至水,有稀釋后的油紅O 儲(chǔ)存液染色10 min,而后脫色、復(fù)染,中性樹脂封片,置于顯微鏡下鏡檢,獲得不同區(qū)域視野圖像,接著拍照保存。圖像中,脂滴呈現(xiàn)紅色,細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色。

1.3.5 Masson 染色

將多聚甲醛固定的左心室石蠟包埋和切片。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟兩次,無(wú)水乙醇梯度脫水后先后用蘇木素和麗春紅溶液染色,再通過(guò)苯胺藍(lán)復(fù)染5 min,后用1%冰醋酸處理1 min,將切片依次放入濃度為50%、70%、90%、100%乙醇中各沖洗5 min,使用二甲苯脫水透明后用中性樹膠封片。 在200 倍鏡顯微鏡下觀察拍攝,每只小鼠隨機(jī)選取3個(gè)切片,在顯微鏡下選取最具代表的視野進(jìn)行拍攝,利用Image-Pro Plus 6.0 分析軟件,計(jì)算各區(qū)域心肌膠原沉積所占比例,即膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)=膠原面積/組織總面積×100%。

1.3.6 透射電鏡

將心肌組織切成1mm3大小的組織塊,迅速將樣品放入2.5%戊二醛磷酸緩沖液中固定24 h,之后使用不同濃度梯度無(wú)水乙醇各脫水15 min,再用90%和100%丙酮各脫水15 min,用純丙酮/包埋液混合液處理過(guò)夜后在包埋板上包埋,室溫下處理3 h后在烘箱內(nèi)固化,通過(guò)超薄切片機(jī)切片70 nm 左右,最后使用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染切片,使用HT 7800 透射電鏡檢查心肌線粒體形態(tài)和組織纖維化。

1.3.7 Western blot 實(shí)驗(yàn)

每只小鼠稱取0.04 g 心臟組織置于2 mL 的勻漿管中,加入600 μL 蛋白酶抑制劑和6 μL RIPA 裂解液并混勻,于勻漿機(jī)內(nèi)機(jī)械勻漿,勻漿液在4℃、10 000 r/min 條件下,離心5 min,取上清液,在參數(shù)設(shè)置工作2 s,間歇2 s,超聲5 min,取上清液,BCA法測(cè)蛋白濃度。 2×的蛋白上樣緩沖液,按照1 ∶1與上清液樣品充分混勻,再放置100℃煮樣機(jī)中10 min,待冷卻后放入-20℃冰箱中保存,即為蛋白樣品。 取等體積蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳,電泳條件為45 V,40～60 min,85 V,1 h。 此后以濕轉(zhuǎn)法恒流330 mA 轉(zhuǎn)膜60 ～120 min,轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF 膜置于5%脫脂牛奶中常溫封閉2 h,之后與一抗4℃孵育搖床過(guò)夜(一抗稀釋比例:PINK1,1 ∶1000; Parkin, 1 ∶ 1000; PGC-1α, 1 ∶ 1000;Beclin1, 1 ∶1000; LC3A/B, 1 ∶ 1000; LAMP1,1 ∶1000;p62,1 ∶500),次日使用TBST 洗滌3 次,每次10 min,室溫下與二抗孵育1.5 h(二抗稀釋比例:1 ∶ 5000)。 再 次 用TBST 洗 滌3 次, 每 次10 min。 使用化學(xué)放光成像儀掃描條帶,滴加發(fā)光劑顯色成像,并保存。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

圖像由Image J 軟件和Adobe Photoshop 2022軟件分析處理,所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)由Graph Pad Prism 8.0.0 軟件(La Jolla,CA,USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并進(jìn)行圖像化處理,結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)來(lái)表示,組間比較均采用單因素方差分析,P＜0.05 表示結(jié)果具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 NAFLD 小鼠模型建立

小鼠基礎(chǔ)體重為(17.30±0.60)g,分別對(duì)Chow組和HFD 組進(jìn)行普通飼料和高脂飼料喂養(yǎng)。 喂養(yǎng)2周后,Chow 組小鼠體重為(21.15±0.76)g,HFD 組小鼠體重為(22.41±0.85)g;喂養(yǎng)6 周后,Chow 組小鼠體重為(25.19±1.11)g,HFD 組小鼠體重為(27.88±1.76)g;喂養(yǎng)10 周后,Chow 組小鼠體重為(27.53±1.31)g,HFD 組小鼠體重為(30.96±2.33)g;喂養(yǎng)14周后,Chow 組小鼠體重為(28.73±1.29)g,HFD 組小鼠體重為(34.16±3.13)g;喂養(yǎng)18 周后,Chow 組小鼠體重為(28.54±1.30)g,HFD 組小鼠體重為(38.58±3.99)g(圖1)。 18 周建模結(jié)束后,HFD 組體重比Chow 組高35.18%(＞20%);隨后每組隨機(jī)選取2 只小鼠做肝油紅O 染色觀察肝脂肪變性情況,如圖2 顯示,Chow 組肝無(wú)明顯脂質(zhì)沉積,HFD組肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)生明顯脂質(zhì)沉積,存在大量空泡樣變,表明NAFLD 模型建立成功。

圖1 NAFLD 模型建立過(guò)程中體重的變化Figure 1 Change of body weight during the establishment of NAFLD model

圖2 各組小鼠肝油紅O 染色(18 周)Figure 2 Liver oil red O staining of mice in each group(18 weeks)

2.2 有氧運(yùn)動(dòng)改善NAFLD 小鼠體重及心臟指數(shù)

8 周運(yùn)動(dòng)干預(yù)結(jié)束后,與Control 組相比,Model組的終末體重極顯著升高(圖3,P＜0.001),且與干預(yù)前體重相比,體重也顯著性增長(zhǎng)(P＜0.01);與Model 組相比,經(jīng)過(guò)中強(qiáng)度和高強(qiáng)度有氧訓(xùn)練后,高脂喂養(yǎng)小鼠體重極顯著降低(P＜0.001)。 除體重增加外,Model 組小鼠心臟指數(shù)顯著低于Control 組(P＜0.01),經(jīng)過(guò)運(yùn)動(dòng)干預(yù)后,與Model 組相比,MICT組小鼠心臟指數(shù)明顯上升(P＜0.05),HIIT 組小鼠心臟指數(shù)呈上升趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。這表明8 周的有氧運(yùn)動(dòng)和高脂飲食分別對(duì)體重和心臟指數(shù)的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

注:與Control 組相比, ##P＜0.01, ###P＜0.001;與Model 組相比, *P＜0.05, ***P＜0.001。圖3 各組體重、心臟指數(shù)比較Note.Compared with Control group, ##P＜0.01, ###P＜0.001.Compared with Model group, *P＜0.05, ***P＜0.001.Figure 3 Comparison of body weight and heart index in each group

2.3 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)NAFLD 小鼠心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能影響

通過(guò)觀察小鼠心肌Masson 染色及計(jì)算心肌細(xì)胞膠原容積分?jǐn)?shù)(圖4)發(fā)現(xiàn),Control 組心肌內(nèi)有少量膠原纖維分布。 與Control 組相比,Model 組小鼠心肌內(nèi)膠原纖維含量極顯著增加(P＜0.01);經(jīng)過(guò)8周運(yùn)動(dòng)干預(yù)后,與Model 組相比,MICT 組和HIIT 組心肌內(nèi)膠原纖維含量顯著減少(P＜0.05)。 進(jìn)一步通過(guò)透射電鏡觀察小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)(圖4)發(fā)現(xiàn),Control 組心肌結(jié)構(gòu)較清晰,肌纖維排列整齊,肌小節(jié)明暗帶分布均勻,z 線連續(xù)清晰(黑色箭頭),線粒體結(jié)構(gòu)完整(紅色箭頭),少見(jiàn)或不見(jiàn)脂滴(黃色箭頭);與Control 組相比,Model 組心肌肌纖維排列雜亂、斷裂,明暗帶模糊、甚至消失,心肌形態(tài)雜亂不堪,線粒體腫脹、嵴發(fā)生斷裂且模糊不清,其中夾雜多個(gè)脂滴。 經(jīng)過(guò)8 周運(yùn)動(dòng)干預(yù)后,與Model 組相比,MICT 組和HIIT 組心肌肌纖維排列略有恢復(fù),明暗帶、z 線清晰可見(jiàn),線粒體水腫、變性程度略有改善,心肌形態(tài)較好恢復(fù),脂滴也略有減少,其中,MICT 組改善效果優(yōu)于HIIT 組。 以上結(jié)果表明,長(zhǎng)期高脂飲食可導(dǎo)致心肌大量膠原纖維沉積,使心肌發(fā)生纖維化病理改變,且可引起心肌細(xì)胞內(nèi)肌纖維排列紊亂,線粒體結(jié)構(gòu)受損,但經(jīng)不同運(yùn)動(dòng)干預(yù)后,均可有效減少心肌膠原沉積,減少心肌纖維化,并且可有效改善心肌肌纖維排列紊亂、恢復(fù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能。

注:黑色箭頭代表肌節(jié),紅色箭頭代表線粒體,黃色箭頭代表脂滴。 與Control 組相比, #P＜0.05, ##P＜0.01;與Model 組相比, *P＜0.05。圖4 各組小鼠左心室Masson 染色、透射電鏡及心肌膠原體積統(tǒng)計(jì)分?jǐn)?shù)Note.Black arrows represent sarcomere, red arrows represent mitochondria and yellow arrows represent lipid droplets.Compared with Control group,#P＜0.05, ##P＜0.01.Compared with Model group, *P＜0.05.Figure 4 Masson staining, transmission electron microscopy and myocardial collagen volume statistical fraction in left atrial tissue of mice in each group

2.4 有氧運(yùn)動(dòng)上調(diào)NAFLD 小鼠心肌線粒體自噬

與Control 組相比,Model 組小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)PINK1 表達(dá)無(wú)明顯變化(P＞0.05),但Parkin 表達(dá)水平極顯著下調(diào)(圖5,P＜0.01)。 通過(guò)8 周運(yùn)動(dòng)干預(yù)后,與Model 組相比較,兩個(gè)運(yùn)動(dòng)組心肌細(xì)胞PINK1表達(dá)水平均無(wú)顯著性差異(P＞0.05),而在MICT 組心肌細(xì)胞內(nèi)Parkin 活性被顯著激活(P＜0.05),HIIT組Parkin 表達(dá)水平具有上調(diào)趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 以上結(jié)果表明,長(zhǎng)期高脂飲食可抑制小鼠心肌內(nèi)PINK1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬,導(dǎo)致功能障礙的線粒體積聚和心肌病的發(fā)展,而不同強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)均可恢復(fù)由PINK1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬,改善線粒體功能。

注:與Control 組相比, #P＜0.05, ##P＜0.01;與Model 組相比, *P＜0.05。圖5 Western blot 檢測(cè)各組小鼠心肌內(nèi)PINK1 和Parkin 蛋白表達(dá)水平Note.Compared with Control group, #P＜0.05, ##P＜0.01.Compared with Model group, *P＜0.05.Figure 5 Western blot detection of PINK1 and Parkin protein expression levels in mice myocardium of each group

2.5 有氧運(yùn)動(dòng)促進(jìn)對(duì)NAFLD 小鼠心肌自噬

由于線粒體可通過(guò)一般自噬途徑被清除,因此我們進(jìn)一步檢測(cè)一般自噬及溶酶體相關(guān)指標(biāo)Beclin1、LC3、p62 和LAMP1。 如圖6 結(jié)果顯示,與Control 組相比,Model 組心肌細(xì)胞內(nèi)Beclin1 表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P＞0.05);而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和p62 蛋白表達(dá)水平都顯著上調(diào)(P＜0.01、P＜0.05),但LAMP1 表達(dá)水平顯著下降(P＜0.01),這些結(jié)果表明,長(zhǎng)期高脂喂養(yǎng)小鼠,導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)自噬通量受阻,可能是由于阻斷了溶酶體對(duì)內(nèi)容物的降解,而不是自噬的啟動(dòng)。 經(jīng)過(guò)8 周運(yùn)動(dòng)干預(yù)后,與Model 組相比,兩個(gè)運(yùn)動(dòng)組心肌細(xì)胞Beclin1 表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞0.05);MICT 組p62 表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著降低(P＜0.05、P＜0.01),LAMP1 活性被顯著激活(P＜0.05);HIIT 組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著下降(P＜0.05)、p62 蛋白表達(dá)水平極顯著下調(diào)(P＜0.01)、LAMP1 蛋白表達(dá)水平具有上升趨勢(shì),但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 以上結(jié)果表明,運(yùn)動(dòng)可增加高脂條件下心肌細(xì)胞中總的自噬通量,此外,還可顯著增加高脂條件下LAMP1 蛋白表達(dá),促進(jìn)自噬溶酶體降解。

注:與Control 組相比, #P＜0.05, ##P＜0.01;與Model 組相比, *P＜0.05, **P＜0.01。圖6 Western blot 檢測(cè)各組小鼠心肌內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平Note.Compared with Control group, #P＜0.05, ##P＜0.01.Compared with Model group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 6 Western blot detection of related autophagy protein expression levels in mice myocardium of each group

由于線粒體平衡依賴于新線粒體的生成或受損線粒體的清除,因此我們又進(jìn)一步檢測(cè)線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白PGC-1α 表達(dá)水平。 與Control 組相比,Model 組心肌細(xì)胞內(nèi)PGC-1α 蛋白表達(dá)極顯著下降(P＜0.01)。 通過(guò)運(yùn)動(dòng)干預(yù)后,與Model 組相比,兩個(gè)運(yùn)動(dòng)組內(nèi)PGC-1α 蛋白表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 綜上所述,本實(shí)驗(yàn)推測(cè)高脂喂養(yǎng)的小鼠心臟中可能存在功能障礙的線粒體積聚,其原因可能是由于心肌細(xì)胞清除線粒體的能力受損,而運(yùn)動(dòng)可以改善并恢復(fù)線粒體自噬正常水平。

3 討論

NAFLD 作為一種代謝性慢性疾病,長(zhǎng)期高熱量飲食可顯著增加心血管疾病,造成心肌組織結(jié)構(gòu)和功能的損害。 Gon?alves 等[13]研究證實(shí)6 周高糖膳食飼養(yǎng)可誘導(dǎo)Wistar 大鼠左右心室心肌肥大和心肌纖維化,表現(xiàn)為心肌僵硬度增加和心臟舒張功能障礙;Wang 等[14]研究同樣發(fā)現(xiàn)進(jìn)行11 個(gè)月高脂膳食后小鼠呈現(xiàn)出明顯的心肌肥大和心肌纖維化。本實(shí)驗(yàn)中,18 周高脂飲食可以引起NAFLD 小鼠心臟指數(shù)顯著增加,Masson 染色和透射電鏡結(jié)果顯示高脂組心肌內(nèi)膠原纖維含量相比于對(duì)照組明顯增加,且心肌肌纖維排列雜亂、斷裂,明暗帶模糊、甚至消失,心肌形態(tài)雜亂不堪,線粒體腫脹、嵴發(fā)生斷裂且模糊不清,夾雜多個(gè)脂滴,說(shuō)明經(jīng)過(guò)18 周高脂膳食飼養(yǎng)成的NAFLD 小鼠呈現(xiàn)出明顯的心肌結(jié)構(gòu)的損害。 研究表明,運(yùn)動(dòng)是改善NAFLD 進(jìn)展的重要方式,可延緩甚至逆轉(zhuǎn)高脂環(huán)境下的心肌損傷[15]。張磊等[16]研究發(fā)現(xiàn),在對(duì)肥胖SD 大鼠進(jìn)行8 周跑臺(tái)有氧運(yùn)動(dòng)可明顯降低肥胖小鼠的心肌膠原沉積,改善心肌纖維化。 另一項(xiàng)研究表明,8 周高脂飼養(yǎng)誘導(dǎo)的小鼠呈現(xiàn)心肌纖維化,但經(jīng)過(guò)8 周自主運(yùn)動(dòng)后,不僅心肌炎癥受到抑制,心肌纖維化也因運(yùn)動(dòng)而減輕,心肌功能顯著改善[17]。 該研究結(jié)果與上述研究結(jié)論一致,經(jīng)過(guò)8 周中強(qiáng)度和高強(qiáng)度間歇有氧運(yùn)動(dòng)后,兩個(gè)運(yùn)動(dòng)組體重和心臟指數(shù)明顯下降,心肌細(xì)胞膠原沉積減少,心肌肌纖維排列略有恢復(fù),明暗帶、z 線清晰可見(jiàn),線粒體水腫、變性程度略有改善,心肌形態(tài)較好恢復(fù),脂滴也略有減少,并且中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)改善效果更為顯著。 以上結(jié)果表明,長(zhǎng)期高脂飲食可導(dǎo)致心肌大量膠原纖維沉積,使心肌發(fā)生纖維化病理改變,且可引起心肌細(xì)胞內(nèi)肌纖維排列紊亂,線粒體結(jié)構(gòu)受損,但經(jīng)有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后,均可有效減少心肌膠原沉積,減少心肌纖維化,并且可有效改善心肌肌纖維排列紊亂、恢復(fù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能。

線粒體自噬是一種選擇性自噬過(guò)程,可有效去除功能障礙或多余的線粒體[18],并與自噬途徑共享其核心分子機(jī)制。 因?yàn)槭軗p的線粒體導(dǎo)致活性氧的過(guò)量產(chǎn)生和細(xì)胞死亡[19-20],通過(guò)線粒體吞噬選擇性去除功能障礙的線粒體是維持線粒體穩(wěn)態(tài)和保持細(xì)胞活力的重要機(jī)制。 然而自噬的改變?cè)诖x性心肌病中的功能作用仍有爭(zhēng)議,或被抑制[21-22],或被激活[23-24]。 最近一項(xiàng)研究表明,進(jìn)行2 個(gè)月的高脂喂養(yǎng)可以激活小鼠心肌自噬,但這些小鼠卻表現(xiàn)出心臟肥大、舒張功能障礙和脂質(zhì)積聚[25]。 本研究發(fā)現(xiàn)高脂誘導(dǎo)的NAFLD 小鼠心肌細(xì)胞表現(xiàn)出PINK1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬下降,Beclin1 表達(dá)水平無(wú)變化,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值、p62 表達(dá)水平的增加,LAMP1 蛋白水平的顯著降低,提示小鼠心肌細(xì)胞中線粒體自噬受抑制,且自噬流受阻。 這種自噬受損狀態(tài)可能是由于高脂狀態(tài)下心肌溶酶體對(duì)內(nèi)容物的降解被阻斷。 因此,推斷出HFD 喂養(yǎng)的小鼠心臟中可能存在功能障礙的線粒體積聚。 但與此同時(shí),本實(shí)驗(yàn)的另一結(jié)果表示高脂條件下線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白PGC-1α 表達(dá)卻顯著減少,這個(gè)結(jié)果與Mu 等[26]研究結(jié)果一致,這說(shuō)明高脂喂養(yǎng)的小鼠心肌線粒體的積聚主要由于心肌細(xì)胞清除線粒體的能力受損。

目前有多項(xiàng)研究證實(shí),運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練在預(yù)防和改善心血管疾病方面發(fā)揮重要作用。 Gon?alves 等[27]研究表明,對(duì)NAFLD 小鼠進(jìn)行自由活動(dòng)和耐力有氧訓(xùn)練干預(yù),可有效恢復(fù)正常線粒體自噬及增加線粒體生物發(fā)生,且耐力訓(xùn)練優(yōu)于自由訓(xùn)練。 運(yùn)動(dòng)過(guò)程中自噬的調(diào)節(jié)是一個(gè)雙向過(guò)程,合適的運(yùn)動(dòng)可刺激線粒體自噬通量,恢復(fù)細(xì)胞正常自噬功能,有效預(yù)防心功能受損,延緩代謝性心肌病的發(fā)展[15]。 在本研究中發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)8 周有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后,兩個(gè)運(yùn)動(dòng)組均可增加高脂條件下心肌細(xì)胞中的自噬通量,上調(diào)新生心肌細(xì)胞中線粒體自噬、線粒體生物發(fā)生和溶酶體功能相關(guān)蛋白的表達(dá),可有效維持非酒精性脂肪肝小鼠心肌中內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。

目前運(yùn)動(dòng)是治療NAFLD 便捷且安全的有效策略,但不同的運(yùn)動(dòng)形式可能會(huì)引起不同的效果。 首先,本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果提供了證據(jù)支持運(yùn)動(dòng)對(duì)NAFLD 小鼠其他代謝器官有益,并發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期高脂飲食可造成心肌結(jié)構(gòu)損傷,抑制心肌自噬流量,損傷細(xì)胞清除線粒體的能力。 其次,本研究認(rèn)為兩種運(yùn)動(dòng)方式均能恢復(fù)因長(zhǎng)期高脂飲食造成的心肌細(xì)胞內(nèi)自噬受損,促進(jìn)心肌線粒體自噬,改善心肌纖維化,其中中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)改善效果更佳。 這些結(jié)果為運(yùn)動(dòng)改善代謝性心肌病提供了新思路和實(shí)踐基礎(chǔ)。 但本實(shí)驗(yàn)缺乏超聲心動(dòng)圖直接評(píng)估實(shí)驗(yàn)中小鼠心臟功能,未能直接觀察到不同運(yùn)動(dòng)方案改善心臟功能的情況,后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)繼續(xù)補(bǔ)充完善。