蔡 瑜王璐婉謝冬琳高大鵬*

(1.浙江藥科職業(yè)大學(xué),浙江 寧波 315500;2.寧波大學(xué),浙江 寧波 315211;3.寧波大學(xué)附屬第一醫(yī)院,浙江 寧波 315020)

酒是人類社會流傳下來最古老的飲料之一。無論慶典、社交還是日常生活,酒都是必不可少之物。 但長期過量飲酒會造成酒精濫用及依賴,嚴重影響學(xué)習(xí)、記憶和認知等神經(jīng)功能,是世界范圍內(nèi)最嚴重的公共衛(wèi)生問題之一[1]。 據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)表的全球酒精與健康報告指出,全球所有死亡人數(shù)的5.9%和全球疾病經(jīng)濟負擔(dān)的5.1%可歸因于過量飲酒[1]。 我國是一個酒類生產(chǎn)和消費的大國,到2030 年中國成人的人均飲酒量將超過美國,成為世界上最大的飲酒國家[1]。 酒精依賴患者由于長期大量飲酒造成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)營養(yǎng)代謝紊亂、神經(jīng)損傷及神經(jīng)退行性病變,被稱為慢性酒精中毒性腦病[2-3]。 該病臨床主要表現(xiàn)有認知功能障礙,包括注意力不集中、記憶力下降和思維能力受損等,后期可出現(xiàn)酒精性癡呆、酒精性譫妄等[4-5]。 臨床病例研究發(fā)現(xiàn),長期飲酒造成腦內(nèi)海馬和額葉區(qū)域的灰質(zhì)和白質(zhì)體積異常減少,提示這些區(qū)域有顯著的神經(jīng)元丟失[6]。 過量飲酒對個體、家庭及社會造成了沉重的負擔(dān),因此,為探究慢性酒精中毒性腦損傷的發(fā)病機制和治療藥物而構(gòu)建有效穩(wěn)定的動物研究模型十分重要。

目前,國內(nèi)外文獻報道的常見的動物模型給酒方式包括口服、灌胃、腹腔注射和吸入。 通常,腹腔注射和灌胃方式用于急性飲酒模型,而口服和吸入方式用于慢性的酒精暴露方案[7]。 但是,以上任何一種單一的給酒方式均存在不足,無法滿足方便經(jīng)濟、穩(wěn)定可靠和盡可能模擬人類飲酒的造模要求。因此探索多種給酒方式結(jié)合的造模方法可能是解決單一給酒方式局限性的有效途徑。 此外,已報道的慢性酒精中毒性腦損傷小鼠模型的評價尚有很多不足。 因此,探索建立多種給酒方式結(jié)合的慢性酒精中毒的動物模型,并全面、客觀評價腦損傷動物模型具有重要意義。 本實驗通過小鼠長期飲用水中添加酒精結(jié)合酒精灌胃法,觀察小鼠的認知和運動行為學(xué)改變以及檢測腦組織的形態(tài)學(xué)變化,構(gòu)建慢性小鼠酒精中毒性腦損傷模型,為后續(xù)慢性酒精中毒性腦病機制的研究和治療藥物的評價建立有效穩(wěn)定的動物模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

40 只SPF 級C57BL/6J 雄性小鼠,體重(19±1.5)g,7 周齡,購自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(浙)2019-0001]。 實驗動物飼養(yǎng)于寧波大學(xué)實驗動物中心[SYXK(浙)2019-0005]。本實驗經(jīng)寧波大學(xué)實驗動物中心實驗動物倫理委員會審查批準(IACUC-NBU20230138),并在動物飼養(yǎng)和實驗過程嚴格遵循實驗動物3R 原則。 所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,隨機分成對照組20 只和模型組20 只,開始正式實驗。

1.2 主要試劑與儀器

北京56°二鍋頭酒(北京京極酒業(yè)有限公司,生產(chǎn)批號:20210827);蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin,HE)染色試劑盒(Solarbio 北京索萊寶科技有限公司,G1120,生產(chǎn)批號:20230217)和尼氏染色試劑盒(焦油紫法)(Solarbio 北京索萊寶科技有限公司,G1430,生產(chǎn)批號:20220214)。 ANY-maze 行為學(xué)分析系統(tǒng)(美國stoelting 公司);徠卡RM2235 輪轉(zhuǎn)式切片機(徠卡顯微系統(tǒng)(上海)有限公司);光學(xué)顯微鏡(日本Nikon 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型的建立

根據(jù)美國國家酒精濫用與酒精中毒研究所(National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism,NIAAA)的定義,危險飲酒(risky use)是指65 歲以下的男性,每天飲用超過4 個標(biāo)準杯乙醇。 為了模擬人類酗酒者的每日酒精飲用量,經(jīng)過體表面積折算,每只小鼠每天的酒精使用量需達到10 g/kg 及以上。 造模過程使用的酒精濃度和實驗時長基于預(yù)實驗的結(jié)果,具體動物模型建立過程如下:將56°白酒稀釋成5%(v/v)和28%(v/v)兩個濃度,模型組小鼠除基礎(chǔ)飲用水中含終濃度為5%(v/v)的酒精外,同時灌胃28%(v/v)酒精,前兩周灌胃劑量呈梯度增長(從0 逐漸增加至6 g/kg 體重),隨后4 周灌胃劑量維持在6 g/kg 體重,對照組飲用水中不添加酒精同時灌胃等量生理鹽水。 繼6 周的建模過程后,所有小鼠接受認知和運動行為學(xué)實驗包括Y 迷宮、Morris 水迷宮、爬桿實驗和平衡木實驗,每個實驗之間間隔1 ～3 d,使得動物獲得充分的休息。 具體慢性酒精中毒性腦損傷的建模過程和行為學(xué)實驗時間表見圖1。

圖1 慢性酒精中毒性腦損傷的建模過程和行為學(xué)實驗時間表Figure 1 Modeling process of chronic alcoholic brain injury and timeline for behavior experiments

1.3.2 行為學(xué)測試方法

(1)Y 迷宮實驗

Y 迷宮實驗參照文獻[8]進行并稍有改進。 Y 迷宮裝置由三個等長水平臂組成(每個臂長40 cm,寬10 cm,高20 cm),彼此成120°角,從一個中心點向外輻射。 簡要步驟如下:小鼠被放置在三個臂的中心,在8 min 的時間里,它們可以自由地出入所有的三個臂。 記錄進入三個臂的總次數(shù)和進入順序。交替百分比被定義為連續(xù)進入三個不同臂的次數(shù)/(總次數(shù)-2)。 交替百分比可以作為動物空間工作記憶的指標(biāo),而進入三個臂的總次數(shù)可以作為動物自發(fā)運動的指標(biāo)。

(2)Morris 水迷宮實驗

Morris 水迷宮實驗參照文獻[9-10]進行并稍有改進。 水迷宮宮體直徑125 cm,高75 cm。 內(nèi)壁涂黑,宮體內(nèi)充滿自來水,水溫保持在(23±2)℃。 逃生平臺直徑9 cm,距離圓周30 cm,置于宮體內(nèi)坐標(biāo)位置的第一象限。 簡要步驟如下:整個水迷宮實驗包括1 d 的適應(yīng)環(huán)境,1 d 的尋找可見平臺定位航行,5 d的尋找隱藏平臺(平臺低于水面0.7 cm)定位航行和去除平臺后1 d 的空間探索。 在定位航行過程中,將自由活動的小鼠分別從四個象限隨機放入水中,讓其在逃生中尋找平臺,若90 s 后,小鼠仍未找到平臺,則引導(dǎo)小鼠找到平臺上,并在平臺上待15 s,每天訓(xùn)練3 次;在空間探索過程中,將小鼠從迷宮的固定位置放入水中,讓其自由探索60 s。 小鼠活動通過水池上方固定的攝像頭進行圖像采集并用ANY-mazeTM軟件進行處理。 主要觀察指標(biāo)有:定位航行實驗中小鼠找到平臺的平均逃避潛伏期和平均游泳速度,空間探索實驗中小鼠穿越平臺的次數(shù)、在平臺象限的停留時間和搜索路徑。 動物在最后1 d 空間探索實驗中的表現(xiàn)可以用來全面評估小鼠的空間記憶能力。

(3)平衡木實驗

參照Drucker-Colín 等[11]報道的平衡木實驗方法并稍有改進,簡要步驟如下:取100 cm 長、直徑1.8 cm 的圓木棒作為平衡木,平放于地面,兩端各一木架支撐(高60 cm)。 其中一端置一黑色塑料籠,為每次實驗小鼠的終點。 實驗前,訓(xùn)練小鼠從平衡木一端爬行至另一端的塑料籠里,并在籠里待15 s,每只小鼠訓(xùn)練6 次。 訓(xùn)練完畢進行平衡木爬行時間測定,記錄每只小鼠在整根平衡木爬行的總時間,作為動物運動和平衡能力的指標(biāo)。

(4)爬桿實驗

參照Arai 等[12]報道的爬桿實驗方法并稍有改進。 簡要步驟如下:將小鼠放在長50 cm,直徑1.2 cm,45°固定的圓木棒上,使肌肉處于靜力緊張狀態(tài)。 先引導(dǎo)動物在15 s 內(nèi)由桿頂爬至桿底,每只訓(xùn)練4 次,訓(xùn)練完畢進行爬桿時間測定,記錄每只小鼠的爬桿時間,作為動物運動協(xié)調(diào)能力的指標(biāo)。

1.3.3 腦組織形態(tài)學(xué)檢測方法

將小鼠麻醉后,開胸,左心室插入灌注針頭,先灌注生理鹽水50 mL,再灌注4%多聚甲醛溶液50 mL,待小鼠全身僵直后,斷頭處死,冰上取全腦,4%多聚甲醛溶液固定18 h,石蠟包埋,磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution, PBS)漂洗,梯度乙醇脫水,石蠟包埋,切片,片厚8 μm,HE 及尼氏染色,光鏡觀察皮層及海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準誤差(xˉ±sxˉ)表示,組間比較采用兩獨立樣本t檢驗進行分析,Morris水迷宮隱藏平臺測試期采用two-way ANOVA 進行分析。 所有統(tǒng)計分析及作圖均使用GraphPad Prism 9.5.0 軟件進行。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠認知功能比較

在建立慢性酒精中毒性腦損傷模型小鼠的過程中,模型組小鼠體重增長顯著低于對照組,從第2周開始直至第6 周,模型組小鼠的體重明顯低于同齡的對照組小鼠(圖2)。 為了揭示酒精暴露小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶缺陷,每只小鼠都接受了Y 迷宮測試和Morris 水迷宮測試。 在Y 迷宮測試中,對照組和模型組小鼠進入三臂的總次數(shù)沒有差異,這表明動物自發(fā)活動不受長期酒精暴露的影響。 在Y 迷宮測試中,模型組小鼠的自發(fā)交替率低于對照組(P＜0.01),提示慢性乙醇處理可誘發(fā)小鼠短期空間工作記憶障礙(圖2)。

注:A:小鼠體重變化;B:Y 迷宮實驗。 與對照組相比, *P＜0.05, **P＜0.01。圖2 小鼠體重和Y 迷宮實驗結(jié)果比較Note.A, Body weight changes of mice.B, Y maze test.Compared with the control group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 2 Comparison of body weights and the performance in Y maze between two groups

在Morris 水迷宮實驗結(jié)果中,平臺測試中兩組的逃避潛伏期和平均游泳速度均無顯著差異(圖3)。 在隱藏平臺試驗測試中,對于兩組小鼠在連續(xù)4 d 訓(xùn)練的逃避潛伏期數(shù)據(jù)進行two-way ANOVA 分析(針對組別和訓(xùn)練天數(shù)這兩個因素),所得的分析結(jié)果說明,無論是組別因素,還是訓(xùn)練天數(shù)因素,均對最終的逃避潛伏期有顯著影響(分別是P＜0.05 和P＜0.001),但上述兩個因素沒有交叉影響(P=0.9313)。

注:A:可見平臺測試;B:隱藏平臺測試;C:空間探索測試。 與對照組相比, *P＜0.05。圖3 水迷宮實驗結(jié)果比較Note.A, Visible platform trial.B, Hidden platform trial.C, Probe trial.Compared with the control group, *P＜0.05.Figure 3 Comparison of the results of water maze between two groups

這些分析結(jié)果表明,在隱藏平臺試驗測試中,兩組小鼠隨訓(xùn)練天數(shù)的增加,逃避潛伏期逐漸降低,結(jié)果有顯著性差異;并且相對于對照組,模型組的逃避潛伏期維持較長時間,結(jié)果有顯著性差異。此外,對于隱藏平臺試驗測試的數(shù)據(jù)進行t檢驗發(fā)現(xiàn),兩組小鼠隱藏平臺測試第1 天逃避潛伏期差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 與對照組相比,模型組在第2 ～4 天逃避潛伏期顯著增加(P＜0.05)。 在空間探索測試中,長期暴露于酒精的小鼠與對照組小鼠相比,穿越平臺次數(shù)顯著減少(P＜0.05)以及在平臺象限停留時間百分比顯著降低(P＜0.05)。 在搜索策略方面,模型組小鼠的路徑軌跡不太集中于平臺所在象限。 綜上,與對照組相比,長期酒精暴露導(dǎo)致小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶缺陷。

2.2 兩組小鼠運動功能比較

在平衡木實驗中,模型組小鼠通過平衡木的總時間顯著大于對照組(P＜0.01),見圖4。 在爬桿實驗中,模型組小鼠的爬桿時間與對照組相比顯著延長(P＜0.05),見圖4。 綜上,與對照組相比,慢性酒精暴露導(dǎo)致小鼠的運動協(xié)調(diào)能力明顯降低。

注:A:平衡木實驗;B:爬桿實驗。 與對照組相比, *P ＜0.05, **P＜0.01。圖4 平衡木和爬桿實驗結(jié)果比較Note.A, beam balance experiment.B, pole test.Compared with the control group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 4 Comparison of the results of beam balance experiment and pole test between two groups

2.3 兩組小鼠腦組織形態(tài)學(xué)比較

HE 染色顯示對照組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元排列清晰,細胞結(jié)構(gòu)完整、輪廓清晰,而模型組小鼠神經(jīng)元表型明顯收縮變形(圖5A),并且,在長期乙醇暴露后,小鼠海馬組織CA1 區(qū)神經(jīng)元數(shù)量顯著減少。 尼氏染色結(jié)果進一步證實了兩組神經(jīng)元的這些病理改變(圖5B)。 即對照組海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)輪廓清晰,而模型組小鼠神經(jīng)元萎縮,形態(tài)破壞。 并且,經(jīng)長期乙醇暴露后,小鼠海馬組織CA1 區(qū)神經(jīng)元數(shù)量顯著減少。 兩組小鼠腦組織病理染色結(jié)果表明,與對照組相比,長期乙醇暴露導(dǎo)致小鼠海馬區(qū)形態(tài)損傷和細胞壞死。

注:A:海馬組織HE 染色;B:海馬組織尼氏染色。圖5 海馬組織HE 和尼氏染色結(jié)果比較Note.A, HE staining of hippocampus.B, Nissl staining of hippocampus.Figure 5 Comparison of the results of HE staining and Nissl staining of hippocampus

3 討論

酒精使用障礙是發(fā)達國家最常見的神經(jīng)和精神疾病之一,影響全球數(shù)百萬人[13]。 隨著我國社會經(jīng)濟發(fā)展,慢性酒精中毒性腦病的發(fā)病率逐年上升,但目前尚未得到足夠的重視。 為了進一步對長期過量酗酒所致的腦損傷的病理變化和發(fā)病機制有更好的研究,探索建立合適的動物模型至關(guān)重要。

國內(nèi)外文獻報道的慢性酒精中毒性肝損傷模型和慢性飲酒成癮/戒斷模型及評價已較成熟,而慢性酒精誘導(dǎo)的腦損傷動物模型及評價尚未完善。對于建立慢性酒精中毒性腦損傷動物模型,有一些重要的造模因素需考慮并優(yōu)化,包括選取的動物種類品系、給予動物酒精的方式、給予酒精的濃度、動物酒精暴露的時間和劑量等。 本研究均通過文獻調(diào)研結(jié)合預(yù)實驗對上述各因素進行確定并優(yōu)化,以期得到一種盡可能模擬人類慢性飲酒過程、穩(wěn)定可靠且造模時間短的腦損傷模型,這也是本研究對于目前已有造模方法的改進創(chuàng)新之處。 具體模型建立過程中,首先,本實驗選取了C57BL/6J 品系的小鼠作為建立模型的對象,這向該品系小鼠有較高的自愿飲酒量以及對酒精的生理反應(yīng)與人類非常相似等特征有關(guān)[14]。 盡管國內(nèi)外文獻也選用過BALB/c、ICR 及昆明小鼠作為造模對象[15-17],但總體而言,C57BL/6J 小鼠是目前研究酒精誘導(dǎo)的器官損傷最常用的動物之一。 此外,建立模型過程中,如何給予動物酒精的方式也是需要考慮并優(yōu)化的。國內(nèi)外文獻報道常見的給酒方式包括口服(含酒精的流質(zhì)飲食或飲用水)、灌胃、腹腔注射和吸入(暴露于酒精蒸氣)。 通常,急性飲酒模型采用的是腹腔注射和灌胃方式,而慢性的動物酒精暴露方案采用口服和吸入方式[7]。 含酒精的流質(zhì)飲食最早是由Lieber 和DeCarli 開發(fā)的,在造模過程中,該飲食作為實驗動物唯一的食物和水來源[18-19]。 Lieber-DeCarli 模型雖然造模簡便但未模仿人類飲酒。 并且,還存在造模耗時長、飲食種類受限、營養(yǎng)情況與正常飲食時不同等不足。 Tsukamoto-French 模型是通過動物胃內(nèi)植入導(dǎo)管的方式給予酒精[20],造模過程需要特殊的設(shè)備技術(shù)和持續(xù)的動物監(jiān)測、成本高,不便于廣泛應(yīng)用。 飲用水中添加酒精的模型是長期乙醇暴露的更實用的解決方案,該模型已用于多種物種,包括小鼠、大鼠和豚鼠[21-22]。 該模型優(yōu)點是模擬人類飲酒的生理過程、建模方便便宜,可長期給酒(8 個月以上),但存在造模時間長,并且可能無法模擬人類酒精疾病的晚期階段等不足[23]。de Witte 等[24]開發(fā)了一種稱為“肺酒精化”的酒精吸入模型,可以長期達到較高的(200 mg/dL)血液酒精水平,適合酒精成癮方面的研究,但吸入酒精畢竟不同于飲用酒精,不能完全模擬真實情況。 綜合考量上述給酒方式的優(yōu)缺點,此次模型采用飲水中添加酒精+灌胃法,避免單一給酒方式的局限性,使動物模型盡可能模擬人類慢性飲酒過程并縮短造模時間。 更值得一提的是,通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn),小鼠灌胃時能耐受的酒精濃度需低于30%(v/v),因此56°的白酒原液需稀釋1 倍后使用并1 d 中分兩次灌胃。 陳翠桃等[16]采用白酒原液灌胃前30 min給予小鼠灌胃蒸餾水的方法,這些都是為了減少高度酒精灌胃引起的小鼠中毒癥狀甚至死亡。 并且,造模前兩周采用酒精劑量梯度提升,提高小鼠耐受性和存活率。 最后,動物暴露酒精的時間長短也是建立模型時需要考慮的問題。 通常研究人員會將1個月或更長時間地給予酒精視為慢性酒精暴露[23]。酒精引起的慢性疾病,如慢性酒精中毒性腦病,是一個多步驟的疾病過程,研究者感興趣的多步驟多進程的哪個階段將決定酒精的給藥持續(xù)時間[23]。 本研究對慢性酒精中毒性腦病的早期癥狀尤其是認知功能障礙和運動功能障礙最為關(guān)注,結(jié)合前期的預(yù)實驗結(jié)果,最終將小鼠慢性酒精暴露的時間優(yōu)化為6 周,相比目前報道的造模方法,既縮短了造模時間,又可以獲得穩(wěn)定的慢性酒精中毒性腦損傷模型。

采用動物模型效度對本研究所建立的小鼠動物模型進行評價。 動物模型效度是動物模型的綜合評價標(biāo)準,即評價所建立的動物模型在多大程度上模擬了臨床該種疾病。 動物模型效度主要由表面效度、結(jié)構(gòu)效度和預(yù)測效度組成,其中表面效度指動物模型與臨床疾病癥狀和體征的相似性,結(jié)構(gòu)效度指動物造模過程與臨床疾病的致病過程和病理機制的相似性,預(yù)測效度指動物模型與臨床患者對治療藥物反應(yīng)的相似性。 首先,從表面效度看,本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組比較,模型組體重增長幅度顯著降低,日?；顒右妆辉肼曮@嚇、動作刻板;在認知行為學(xué)實驗中,模型組在Y 迷宮測試中的自發(fā)交替率顯著降低,在水迷宮空間探索階段的穿越平臺次數(shù)和在平臺象限停留時間百分比顯著降低;在運動行為學(xué)實驗中,長期酒精暴露會導(dǎo)致小鼠通過平衡木的總時間和爬桿時間顯著延長;并且,模型組小鼠腦組織HE 染色和尼氏染色均顯示出海馬區(qū)形態(tài)損傷和細胞壞死。 這些與臨床上觀察到的患者在病理及病理生理方面的變化極為相似。 例如,慢性酒精中毒性腦病的患者早期常有焦慮不安、頭痛、失眠、乏力、注意力不集中等,逐漸出現(xiàn)智能障礙和精神異常,表現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、注意力不集中、記憶力下降,常伴有虛構(gòu)、思維能力受損,有的出現(xiàn)眼肌麻痹、共濟失調(diào)和影像學(xué)改變等。 與國內(nèi)文獻已報道的慢性酒精中毒性腦損傷模型評價相比,本研究對模型小鼠的認識功能、運動功能以及海馬區(qū)病理損傷都采用兩種經(jīng)典實驗方法進行評價,結(jié)果相互佐證。 其次,從結(jié)構(gòu)效度看,慢性飲酒是酒精中毒性腦病的重要誘因,據(jù)此,建立小鼠長時間酒精暴露可以認為是一種具有良好效度的疾病模型。最后,從預(yù)測維度看,目前臨床尚無藥物治療該疾病,因此無從驗證模型的預(yù)測效度。 綜上所述,本實驗所建立的小鼠慢性酒精中毒性腦損傷模型在動物模型的表面和結(jié)構(gòu)效度上是非常有優(yōu)勢的,基本模擬了人類長期飲酒導(dǎo)致的早期神經(jīng)病理和行為學(xué)改變。 此外,本實驗造模方法簡單方便、飼養(yǎng)成本較低、動物存活率高、時間短,在6 周內(nèi)可初步建立小鼠慢性酒精中毒性腦損傷模型。 本研究的局限性在于,僅從動物行為學(xué)和腦組織形態(tài)學(xué)兩方面評價了慢性酒精對小鼠腦組織所造成的損傷。在接下來的研究工作中,我們將進一步探討慢性酒精所致的認知功能障礙的分子機制以及潛在藥物的治療作用。