柳 揚(yáng)范 偉*丁 潔

(1.貴州省人民醫(yī)院肝膽外科二部,貴陽 550002;2.貴州省人民醫(yī)院腫瘤科,貴陽 550002)

原發(fā)性肝癌的死亡率在全世界排名第三,患病率位居第五,有約70%的肝癌患者在確診時(shí)已處于晚期,生存時(shí)長(zhǎng)低于1 年[1-2]。 索拉非尼屬于在肝癌治療指南中主要推薦的診治晚期肝癌的重要方案,有效率約40%,但其長(zhǎng)時(shí)間服用會(huì)出現(xiàn)耐藥性,最后導(dǎo)致治療效果相對(duì)較差[3-4]。 且有越來越多的學(xué)者研究顯示,腫瘤中的上皮-間質(zhì)的轉(zhuǎn)化為影響藥物耐藥的因素之一,但耐藥機(jī)制尚不清晰,因而探究索拉非尼的耐藥機(jī)制對(duì)于晚期肝細(xì)胞肝癌臨床效果的改善及預(yù)后有著積極作用。 lncRNA 為一類特異性的非編碼RNA,在修飾組蛋白、重塑基因構(gòu)造、轉(zhuǎn)錄及遺傳后基因的表達(dá)等過程中起到了一定的作用,SNHG16 屬于lncRNA 家族中的其中一員,且在miRNA 分子的作用下能夠?qū)?xì)胞的分化及增殖有效調(diào)節(jié),并在腫瘤的化療耐藥及發(fā)展中有所參與[5]。 miR-570 是腫瘤抑制因子的一種,在減緩肝癌細(xì)胞增殖、血管的生長(zhǎng)中有著重要的作用,且在血清及肝癌組織內(nèi)其表達(dá)呈低水平[6]。 基于此,本文探究了lncRNA SNHG16 通過靶向調(diào)控miR-570 可有效改善肝癌細(xì)胞HepG2 對(duì)于索拉非尼的耐藥性,效果顯著。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

人肝癌細(xì)胞HepG2 購自于(澳睿賽生物技術(shù)(上海)有限公司;貨號(hào):ORC0088)。

1.2 主要試劑與儀器

RPMI-1640 培養(yǎng)基(上海百賽生物技術(shù)股份有限公司,貨號(hào):10-040-CM);MTT 試劑(艾美捷科技有限公司,貨號(hào):MBS843090-C);Lipofectamine TM 2000 轉(zhuǎn)染試劑(11668019)購自于北京百奧創(chuàng)新科技有限公司;BCA 蛋白試劑盒(賽默飛世爾科技,貨號(hào):23221-23230);CyclinD1、P21、MMP9、MMP2 抗體分別購自于上海撫生實(shí)業(yè)有限公司、北京澤平科技有限責(zé)任公司、北京義翹神州科技股份有限公司。 酶標(biāo)儀(美谷分子儀器(上海)有限公司,型號(hào):SpectraMax iD5);流式細(xì)胞儀(上海頂儀科技有限公司,型號(hào):FACSCalibur)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

通過濃度遞增方法對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2 實(shí)施長(zhǎng)期的培養(yǎng),創(chuàng)建索拉非尼耐藥HepG2 細(xì)胞株模型,即為HepG2-R。 使用HepG2 作親本細(xì)胞,通過在37℃、5% CO2的環(huán)境中培育,待細(xì)胞的狀態(tài)平穩(wěn)后,在培養(yǎng)液中置入1、2、4、8 及16 μmol/L 索拉非尼,行1 周培育后,索拉非尼換為更高的含量,直到在索拉非尼(16 μmol/L)的培養(yǎng)液中細(xì)胞能穩(wěn)定生長(zhǎng),說明誘導(dǎo)HepG2-R 細(xì)胞成功。 后續(xù)在培養(yǎng)基中對(duì)HepG2-R 細(xì)胞中低濃度的索拉非尼施以常規(guī)培育,維持耐藥性,且將HepG2 的正常細(xì)胞標(biāo)記成HepG2-P。

1.3.2 lncRNA SNHG16、miR-570 在肝癌細(xì)胞中表達(dá)水平檢測(cè)

提取肝癌細(xì)胞、正常肝細(xì)胞中總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,選取實(shí)時(shí)熒光定量法予以檢測(cè)lncRNA SNHG16、miR-570 表達(dá)量,采用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物序列,PCR 反應(yīng)體系:0.5 μL 的上下游引物、模板為2 μL cDNA、8 μL 的SYBR Green,放蒸餾水至30 μL。 反應(yīng)條件:96℃ 6 min、92℃ 30 s、75℃45 s,80℃ 10 min,共行45 個(gè)循環(huán),以GAPDH 為內(nèi)參,采取2-△△Ct方法計(jì)算出lncRNA SNHG16、miR-570 的表達(dá)量。 (見表1)

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

通過對(duì)SNHG16 的siRNA 進(jìn)行合成,HepG2-R細(xì)胞按密度為2×105/孔置于6 個(gè)孔板內(nèi),待細(xì)胞開始貼壁后,放入含10%胎牛血清的RPMI-1640。 培養(yǎng)箱內(nèi)培育24 h,細(xì)胞融合程度為35%～55%,后將完成稀釋的HepG2 siRNA 混合于LipofectamineTM2000 試劑中,產(chǎn)生HepG2 siRNA/LipofectamineTM2000 復(fù)合物,接著在細(xì)胞培養(yǎng)板孔中加HepG2 siRNA 轉(zhuǎn)染載體予以融合,后置入5% CO237℃的培養(yǎng)箱實(shí)施培育,6 h 之后換為RPMI-1640 培養(yǎng)液(含10% 胎牛血清),20 h 恢復(fù)生長(zhǎng),使用熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞熒光蛋白的表達(dá)量,使用qRT-PCR 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染率,確認(rèn)成功轉(zhuǎn)染后,分別將其記作HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-570 組、HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-NC 組、HepG2-R+anti-miR-570 組、HepG2-R + anti-miR-NC 組、 HepG2-R + pcDNA SNHG16 組和HepG2-R+pcDNA 組,用于后續(xù)的試驗(yàn)。 接著將si-NC、si-SNHG16、miR-NC、miR-570 通過類似的操作在HepG2 細(xì)胞內(nèi)實(shí)施轉(zhuǎn)染,分別記si-NC 組、si-SNHG16 組、miRNC 組和miR-570 組。

1.3.4 MTT 法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率

集取細(xì)胞,調(diào)至5×105/mL,于96 孔板內(nèi)進(jìn)行接種,加MTT 溶液(5 g/L 25 μL),培育4 h,去除清液,放入二甲基亞砜(DMSO)(120 μL),搖勻,直到結(jié)晶紫開始融化,后將酶標(biāo)儀調(diào)到470 nm 波長(zhǎng),以此對(duì)細(xì)胞吸光(A)值進(jìn)行測(cè)定。 細(xì)胞增殖抑制率=(對(duì)照組A 值-試驗(yàn)組A 值)/對(duì)照組A 值×100%。并根據(jù)藥物的濃度及抑制率分別記作橫軸與縱軸,描繪出濃度對(duì)應(yīng)的曲線,算出半數(shù)的抑制濃度IC50。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡

按照上述的形式收集每組的HepG2-R 細(xì)胞通過PBS 洗滌后制出單細(xì)胞的懸浮液(2×105/mL),接著將100 mL 細(xì)胞懸浮液放入96 孔板中,后滴加Annexin V-FITC 6 mL,在5℃環(huán)境中培育約30 min,接著加4 mL 的碘化丙啶,均勻混合后于室溫下培育10 min,并采用流式細(xì)胞儀測(cè)試細(xì)胞的凋亡。

1.3.6 Transwell 測(cè)定細(xì)胞遷移

首先將細(xì)胞在無血清的培養(yǎng)基中培育24 h,集取細(xì)胞,調(diào)節(jié)至5×106/mL,取150 μL 的細(xì)胞放于Transwell 小室的上室中,取550 μL 含有清液的培養(yǎng)基放于Transwell 小室的下室中,后將Transwell 小室放置于培養(yǎng)箱內(nèi)培育48 h,接著預(yù)備結(jié)晶紫染色液與甲醛固定液予以備用,后將Transwell 小室取出,利用棉簽緩慢地擦拭掉聚碳酸酯膜表面上的細(xì)胞,后將膜移置固定液內(nèi),30 ～35 min,接著將膜放入染色液內(nèi)15 min 進(jìn)行染色,后通過鑷子緩慢將膜的下方朝上置于載玻片予以固定,使用光鏡檢測(cè)細(xì)胞數(shù)目,取其平均數(shù)值。

1.3.7 CyclinD1、P21、MMP9、MMP2 檢測(cè)

選用Western blot 法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞周期蛋白(CyclinD1、P21、MMP9、MMP2)表達(dá),首先在含甲基磺酰氟(PMSF)的裂解液內(nèi)使細(xì)胞發(fā)生裂解反應(yīng),取蛋白后經(jīng)BCA 法對(duì)蛋白進(jìn)行定量測(cè)定,接著在沸水內(nèi)進(jìn)行約15 min 的浸泡處理,使其變性,加樣本,調(diào)節(jié)60 V 電壓實(shí)施電泳處理,40 min 左右,調(diào)電壓到120 V 后繼續(xù)電泳,90 ～120 min 后停止,將蛋白經(jīng)轉(zhuǎn)膜儀換至PVDF 膜上,在低溫環(huán)境下轉(zhuǎn)膜,完成后通過5%的脫脂奶粉進(jìn)行1 h 封閉處理,培養(yǎng)一抗(抗體P21、CyclinD1、MMP2、MMP9)、二抗(經(jīng)過氧化酶所標(biāo)記后的LgG 抗體),并在暗室放置膜,加ECL 試劑,用凝膠檢測(cè)軟件觀察條帶的灰度數(shù)值,內(nèi)參為GAPDH。

1.3.8 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)

集取細(xì)胞,取裂解液裂解細(xì)胞,加熒光素酶底物(5 μL)、緩沖液,混勻,測(cè)定熒光強(qiáng)度,放入緩沖液及底物,混勻,對(duì)熒光的強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)5 次,分別對(duì)各個(gè)樣本作復(fù)孔3 個(gè),最后對(duì)熒光素酶強(qiáng)度比較分析,檢測(cè)SNHG16 聯(lián)合miR-570 在細(xì)胞中的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0 軟件分析,shapiro-wilk 檢驗(yàn)符合正態(tài)分布,以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用重讀測(cè)量方差分析,同一時(shí)間點(diǎn)兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間進(jìn)行比較采用F檢驗(yàn),以率(%)表示計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn),P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA SNHG16、miR-570 在肝癌細(xì)胞組織及正常肝組織中的表達(dá)

如表2 所示,與人體正常肝組織相比,肝癌細(xì)胞組織的lncRNA SNHG16 表達(dá)升高,miR-570 表達(dá)下降,具有顯著性差異(P＜0.05)。

表2 lncRNA SNHG16、miR-570 在肝癌細(xì)胞組織組及正常肝組織組中的表達(dá)(±s)Table 2 Expression of lncRNA SNHG16 and miR-570 in liver cancer cell tissue group and normal liver tissue group

表2 lncRNA SNHG16、miR-570 在肝癌細(xì)胞組織組及正常肝組織組中的表達(dá)(±s)Table 2 Expression of lncRNA SNHG16 and miR-570 in liver cancer cell tissue group and normal liver tissue group

注:與人體正常肝組織組相比, aP＜0.05。Note.Compared with human normal liver tissue group, aP＜0.05.

組別Groups宿主基因16 SNHG16 miR-570人體正常肝組織組Human normal liver tissue group 1.13±0.14 1.08±0.20肝癌細(xì)胞組織組Liver cancer cell tissue group 2.10±0.27a 0.61±0.15a t 12.350 7.281 P＜0.001 ＜0.001

2.2 lncRNA SNHG16 和miR-570 在肝癌細(xì)胞及肝癌不同濃度的索拉非尼耐藥細(xì)胞中的表達(dá)

如表3 所示,與HepG2-P 組相比,HepG2-R 組LncRNA SNHG16 表達(dá)上升,miR-570 表達(dá)水平下降(P＜0.05),表明與HepG2-P 組對(duì)比,HepG2-R 組細(xì)胞在索拉非尼濃度為1、2、4、8、16 μmol/L 中的抑制率均下降,IC50值上升,具有顯著性差異(P＜0.05)。

表3 lncRNA SNHG16 和miR-570 在肝癌細(xì)胞及肝癌不同濃度的索拉非尼耐藥細(xì)胞中的表達(dá)(±s)Table 3 Expression of lncRNA SNHG16 and miR-570 in liver cancer cells and Sorafenib resistant cells with different concentrations of liver cancer

表3 lncRNA SNHG16 和miR-570 在肝癌細(xì)胞及肝癌不同濃度的索拉非尼耐藥細(xì)胞中的表達(dá)(±s)Table 3 Expression of lncRNA SNHG16 and miR-570 in liver cancer cells and Sorafenib resistant cells with different concentrations of liver cancer

注:與HepG2-P 組相比, aP＜0.05。Note.Compared with HepG2-P group, aP＜0.05.

組別Groups宿主基因16 SNHG16 miR-570 半抑制濃度(μmol/L)IC50索拉非尼(μmol/L)Sorafenib 1 2 4 8 16 HepG2-P 組HepG2-P group 1.12±0.16 1.05±0.1 8 30.28±2.11 6.97±0.71 20.95±2.77 38.86±3.18 69.34±6.06 86.24±9.05 HepG2-R 組HepG2-R group 2.08±0.22a 0.59±0.10a 200.46±12.07a 5.06±0.57a 16.57±2.03a 24.43±2.26a 37.41±2.58a 40.57±5.69a t 13.670 8.652 53.790 8.125 4.940 14.330 18.780 16.550 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 lncRNA SNHG16 過表達(dá)聯(lián)合索拉非尼對(duì)HepG2-R 細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響

如表4,圖1、圖2 所示,HepG2-R+pcDNA SNHG16 作為過表達(dá)組,其lncRNA SNHG16 表達(dá)明顯升高(P＜0.05),表明lncRNA SNHG16 過表達(dá)的HepG2-R 細(xì)胞株構(gòu)建成功,與HepG2-R+pcDNA 組相比,HepG2-R+pcDNA SNHG16 組的遷移細(xì)胞個(gè)數(shù)及CyclinD1、P21、MMP-9、MMP-2 的表達(dá)水平降低,抑制率、凋亡率及P21 的表達(dá)水平上升,具有顯著性差異(P＜0.05)。

圖1 增殖、凋亡、遷移相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 1 Expression of proteins related to proliferation,apoptosis and migration

圖2 細(xì)胞凋亡圖Figure 2 Cell apoptosis

表4 lncRNA SNHG16 過表達(dá)聯(lián)合索拉非尼對(duì)HepG2-R 細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響(±s)Table 4 Effects of lncRNA SNHG16 overexpression combined with Sorafenib on proliferation, apoptosis and migration of HepG2-R cells

表4 lncRNA SNHG16 過表達(dá)聯(lián)合索拉非尼對(duì)HepG2-R 細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響(±s)Table 4 Effects of lncRNA SNHG16 overexpression combined with Sorafenib on proliferation, apoptosis and migration of HepG2-R cells

注:與HepG2-R+pcDNA 組相比, aP＜0.05。Note.Compared with HepG2-R+pcDNA group, aP＜0.05.

組別Groups HepG2-R+pcDNA 組HepG2-R+pcDNA group H H ep e Gp G 2-2 R-R+p+cp Dc D NN AA S N SN H H GG 1 6 1 6 g r組oup t P宿S主N基H G因16 1 6 1.17±0.15 2.12±0.24a 13.000 ＜0.001 I抑nh制ibi率tio(n%ra)te 11.72±1.10 42.29±2.44a 44.240 ＜0.001 A凋po亡pt率osi(s%ra)te 17.87±2.09 22.41±3.24a 4.560 ＜0.001遷移的細(xì)胞個(gè)數(shù)(n)Number of migrated cells 138.51±10.16 83.28±7.55a 16.900 ＜0.001周Cy期cl素inD D 11 0.95±0.13 0.51±0.07a 11.540 ＜0.001 p21 蛋P2白1抗體0.35±0.09 0.73±0.14a 8.843 ＜0.001基質(zhì)金M屬M(fèi)P蛋-9白酶90.67±0.08 0.35±0.05a 13.140 ＜0.001基質(zhì)金M屬M(fèi)P蛋-2白酶20.83±0.09 0.49±0.06a 12.170 ＜0.001

2.4 抑制miR-570 表達(dá)聯(lián)合索拉非尼對(duì)HepG2-R細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響

如表5,圖3、圖4 所示,與HepG2-R+anti-miRNC 組相比,HepG2-R+anti-miR-570 組miR-570 表達(dá)水平降低(P＜0.05),表明抑制miR-570 的HepG2-R細(xì)胞株構(gòu)建成功,與HepG2-R+anti-miR-NC 組比較,HepG2-R+anti-miR-570 組CyclinD1、MMP-9、MMP-2表達(dá)水平降低,抑制率、凋亡率及P21 表達(dá)水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖3 增殖、凋亡、遷移相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 3 Expression of proteins related to proliferation,apoptosis and migration

圖4 細(xì)胞凋亡圖Figure 4 Cell apoptosis

表5 抑制miR-570 表達(dá)聯(lián)合索拉非尼對(duì)HepG2-R 細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響(±s)Table 5 Effects of miR-570 inhibition combined with Sorafenib on proliferation, apoptosis and migration of HepG2-R cells

表5 抑制miR-570 表達(dá)聯(lián)合索拉非尼對(duì)HepG2-R 細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響(±s)Table 5 Effects of miR-570 inhibition combined with Sorafenib on proliferation, apoptosis and migration of HepG2-R cells

注:與HepG2-R+anti-miR-NC 組相比, aP＜0.05。Note.Compared with HepG2-R+anti-miR-NC group, aP＜0.05.

組別Groups HepG2-R+anti-miR-NC 組HepG2-R+anti-miR-NC group H H ep e Gp G 2-2 R-R+a+na tn i-t mi-m iR iR-5-75 07 0 g r組oup t P微小mi R R N-5 A 7-05 701.11±0.12 0.52±0.09a 15.230 ＜0.001 I抑nh制ibi率tio(n%ra)te 12.36±2.25 41.61±3.18a 29.080 ＜0.001 A凋po亡pt率osi(s%ra)te 18.32±2.11 24.46±3.47a 5.856 ＜0.001 N遷um移be的r o細(xì)f m胞ig個(gè)ra數(shù)ted(c n e)lls 76.86±8.10 40.43±6.06a 13.950 ＜0.001周Cy期cl素inD D 11 0.76±0.09 0.39±0.06a 13.250 ＜0.001 p21 蛋P2白1抗體0.33±0.04 0.79±0.09a 18.090 ＜0.001基質(zhì)金M屬M(fèi)P蛋-9白酶90.68±0.07 0.25±0.04a 20.660 ＜0.001基質(zhì)金M屬M(fèi)P蛋-2白酶20.79±0.08 0.36±0.05a 17.650 ＜0.001

2.5 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)

如表6 所示,雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)顯示,miRNC 組WT-SNHG16、miR-570 組WT-SNHG16、miRNC 組MUT-SNHG16、miR-570 組MUT-SNHG16 細(xì)胞相對(duì)熒光素酶表達(dá)活性分別為(1.16±0.14)、(0.50±0.10)、(1.02±0.08)、(0.98±0.07),且相較于miR-NC 組WT-SNHG16,miR-570 組WT-SNHG16 表達(dá)活性較低,說明lncRNA SNHG16 靶向調(diào)控miR-570。

表6 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)(±s)Table 6 Double luciferase reporting tests

表6 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)(±s)Table 6 Double luciferase reporting tests

注:與miR-NC 組相比, aP＜0.05。Note.Compared with miR-NC group, aP＜0.05.

組別Groups野生型宿主基因16 WT-SNHG16變異型宿主基因1 MUT-SNHG16 miR-NC 組miR-NC group 1.16±0.14 1.02±0.08 miR-570 組miR-570 group 0.50±0.10a 0.98±0.07 t 14.860 1.457 P＜0.001 0.156

2.6 過表達(dá)miR-570 干擾lncRNA SNHG16 對(duì)HepG2-R 細(xì)胞耐藥性的影響

如表7,圖5 所示,過表達(dá)lncRNASNHG16 可使HepG2-R 細(xì)胞中miR-570 表達(dá)下降(P＜0.05),與HepG2-R+pcDNA SNHG16 +miR-NC 組相比,HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-570 組的遷移細(xì)胞個(gè)數(shù)及CyclinD1、MMP-9、MMP-2 的表達(dá)水平升高,抑制率、凋亡率及P21 的表達(dá)水平降低,具有顯著性差異(P＜0.05)。

圖5 CyclinD1、P21、MMP-9、MMP-2 表達(dá)Western blot 圖Figure 5 Western blot expression of CyclinD1, P21,MMP-9 and MMP-2

表7 過表達(dá)miR-570 干擾lncRNA SNHG16 對(duì)HepG2-R 細(xì)胞耐藥性的影響(±s)Table 7 Effect of overexpression of miR-570 interfering lncRNA SNHG16 on drug resistance of HepG2-R cells

表7 過表達(dá)miR-570 干擾lncRNA SNHG16 對(duì)HepG2-R 細(xì)胞耐藥性的影響(±s)Table 7 Effect of overexpression of miR-570 interfering lncRNA SNHG16 on drug resistance of HepG2-R cells

注:與HepG2-R+pcDNA 組相比, aP＜0.05;與HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-NC 組相比, bP＜0.05。Note.Compared with HepG2-R+pcDNA group, aP＜0.05.Compared with HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-NC group, bP＜0.05.

組別Groups HepG2-R+pcDNA 組HepG2-R+pcDNA group HepG2-R+pcDNA SNHG16 組HepG2-R+pcDNA SNHG16 group HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-NC 組HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-NC group HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-570 組HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-570 group F P miR-570 0.93±0.13 0.44±0.07a 0.38±0.06 0.79±0.11b 14.880 ＜0.001 I抑nh制ibi率tio(n%ra)te 13.29±1.12 45.35±3.76a 47.30±3.13 18.68±2.09b 39.620 ＜0.001凋亡率(%)Apoptosis rate 17.95±2.11 20.46±2.87a 29.40±3.06 17.75±2.09b 11.930 ＜0.001 N遷um移be的r o細(xì)f m胞ig個(gè)ra數(shù)ted(c n e)lls 90.48±8.29 50.21±6.75a 47.37±5.42 80.54±7.67b 16.860 ＜0.001周Cy期cl素inD D 11 0.71±0.07 0.25±0.03a 0.24±0.04 0.62±0.06b 22.580 ＜0.001 p21 蛋P2白1抗體0.31±0.03 0.72±0.08a 0.76±0.09 0.45±0.05b 18.370 ＜0.001基質(zhì)金M屬M(fèi)P蛋-9白酶90.68±0.07 0.29±0.04a 0.25±0.03 0.54±0.05b 21.870 ＜0.001基質(zhì)金M屬M(fèi)P蛋-2白酶20.80±0.09 0.36±0.05a 0.32±0.03 0.60±0.07b 19.600 ＜0.001

3 討論

肝癌在每個(gè)年齡段都有可能會(huì)出現(xiàn),各種類型肝炎病毒引起的慢性感染可致使機(jī)體發(fā)生慢性肝炎,伴隨疾病的進(jìn)展發(fā)展為肝癌,且肝內(nèi)脂肪的積累、肝硬化或長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)食霉變的食物等均與肝癌疾病發(fā)生有著緊密聯(lián)系[7-8]。

化療是臨床治療癌癥最基本的方案之一,臨床救治失敗主要因?yàn)榛熕幬锏哪退幮援a(chǎn)生、DNA 受損修復(fù)、藥物的排外、細(xì)胞凋亡等因素互相作用,使耐藥病理機(jī)制相對(duì)復(fù)雜[9]。 索拉非尼通過靶向多項(xiàng)相關(guān)靶點(diǎn),可減緩腫瘤細(xì)胞的增殖及新生血管的產(chǎn)生,發(fā)揮對(duì)肝癌抑制的效果,并且該藥物為首要診治晚期肝癌的靶向藥物,能有效改善預(yù)后[10-11]。研究發(fā)現(xiàn),上皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)化、腫瘤的微環(huán)境及信號(hào)通路等可能會(huì)與索拉非尼的耐藥有關(guān)[12-13]。 本文研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞HepG2 與lncRNA SNHG16 對(duì)索拉非尼耐藥有一定的關(guān)聯(lián)性,說明lncRNA SNHG16對(duì)miR-570 進(jìn)行調(diào)控可有助于緩輕肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼耐藥的預(yù)后。

研究顯示,lncRNA 在腫瘤出現(xiàn)及進(jìn)展中有一定的參與,lncRNA 也可對(duì)肝癌的轉(zhuǎn)移起到調(diào)節(jié)作用[14-15]。 SNHG16 在乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等腫瘤組織及細(xì)胞中表達(dá)異常,與腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移及增殖相關(guān)[16-17]。 隨著臨床對(duì)miRNA 的研究不斷加深,可知其能對(duì)多類腫瘤發(fā)揮出明顯的調(diào)節(jié)作用,且在惡性腫瘤中表達(dá)異常,其主要的特異性常表現(xiàn)為對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞增殖、分化的調(diào)控[18]。 研究顯示,miR-570 可在腫瘤產(chǎn)生及進(jìn)展中有所參與,且可有效調(diào)節(jié)腫瘤免疫有關(guān)的靶向基因,進(jìn)而對(duì)肝癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖及凋亡的過程發(fā)揮一定的干預(yù)效果,同時(shí)可經(jīng)調(diào)節(jié)B7-H1 基因進(jìn)行靶向調(diào)控,抑制肝癌細(xì)胞的侵襲、增殖[19]。 研究發(fā)現(xiàn),與人體正常的肝組織比較,肝癌細(xì)胞組織中的lncRNA SNHG16 表達(dá)升高,miR-570 呈低表達(dá),且在HepG2-R+pcDNA SNHG16 組及HepG2-R+anti-miR-570 組中遷移細(xì)胞的個(gè)數(shù)及CyclinD1、P21、MMP-9、MMP-2、miR-570 的表達(dá)水平降低,lncRNA SNHG16、抑制率、凋亡率及P21 的表達(dá)水平升高;CyclinD1、MMP-9、MMP-2 的表達(dá)水平降低,抑制率、凋亡率及P21的表達(dá)水平升高,促進(jìn)肝癌細(xì)胞的發(fā)展,經(jīng)對(duì)lncRNA SNHG16 水平進(jìn)行調(diào)控可有效改善HepG2-R 細(xì)胞耐藥性,與其他學(xué)者研究較相似[20-21]。 表明lncRNA SNHG16 經(jīng)調(diào)控miR-570 水平表達(dá),可有效改善HepG2 細(xì)胞對(duì)索拉非尼耐藥。

綜上所述, 在肝癌細(xì)胞中分析 lncRNA SNHG16、miR-570 的作用,探究lncRNA SNHG16、miR-570 在肝癌病癥中的病理機(jī)制,結(jié)果顯示lncRNA SNHG16 在肝癌索拉非尼耐藥細(xì)胞中呈高水平表達(dá),經(jīng)靶向調(diào)控miR-570 表達(dá)可有效促進(jìn)索拉非尼的耐藥性,為臨床進(jìn)一步分析肝癌索拉非尼耐藥病理機(jī)制指明了方向。