喻帥克羅茂麗王連睿周天豹苗明三白 莉

(河南中醫(yī)藥大學(xué),鄭州 450046)

骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是骨組織常見的原發(fā)性惡性腫瘤,全球發(fā)病率每一百萬人約有4 人,好發(fā)于15 ～19 歲的青少年[1-3],主要表現(xiàn)為疼痛、腫塊、跛行等,具有高轉(zhuǎn)移性、預(yù)后差、病情發(fā)展迅速等特點[4-6]。 OS 現(xiàn)代治療多采用放療、化療、根治性手術(shù)切除和晚期截肢[7-8],多方法結(jié)合治療雖然可以抑制癌細(xì)胞增殖和減少轉(zhuǎn)移風(fēng)險,卻為機(jī)體帶來不可逆損傷和殘疾,化療毒性和耐藥性導(dǎo)致機(jī)體免疫下降,加深了患者的痛苦[9-12]。 因此,對OS 的發(fā)病機(jī)制,以及有效的治療方法和藥物進(jìn)行更深入的研究是非常有必要的,而穩(wěn)定可靠的動物模型是開展OS 相關(guān)研究的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。 OS 動物模型應(yīng)用于骨肉瘤相關(guān)研究已有較長的歷史,創(chuàng)造了多種可行的造模方式,例如病毒誘導(dǎo)模型[13]、輻射誘導(dǎo)模型[14]、腫瘤移植模型[15]等,但相關(guān)文獻(xiàn)缺少統(tǒng)一的模型制備及評價標(biāo)準(zhǔn)。 本文將通過對骨肉瘤動物模型研究的文獻(xiàn)進(jìn)行歸納分析,探討模型動物的選擇、造模方法、主要檢測指標(biāo)等,以期為骨肉瘤動物模型的完善提供方法學(xué)參考。

1 材料和方法

1.1 資料來源

在中國知網(wǎng)(CNKI)、萬方數(shù)據(jù)庫知識服務(wù)平臺(Wanfang)中以“骨肉瘤”“動物”為主題詞進(jìn)行檢索,鎖定檢索年限2000 年1 月～2022 年10 月,在PubMed 數(shù) 據(jù) 庫 以“(osteosarcoma) AND (animal model)”進(jìn)行檢索,檢索時間范圍均設(shè)置為2019 年10 月～2022 年10 月。 其中中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫檢索出相關(guān)期刊文獻(xiàn)1478 篇、萬方數(shù)據(jù)庫799 篇、PubMed數(shù)據(jù)庫檢索文獻(xiàn)227 篇,文獻(xiàn)總數(shù)為2504 篇。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn):選擇具有骨肉瘤動物模型應(yīng)用的實驗性期刊文獻(xiàn),排除標(biāo)準(zhǔn):(1)會議性文獻(xiàn)、碩博士學(xué)位論文、綜述類文獻(xiàn)、理論研究類文獻(xiàn);(2)未明確記錄造模方法或?qū)嶒瀯游锓N類的文獻(xiàn);(3)數(shù)據(jù)庫之間重復(fù)的文獻(xiàn)。

1.3 數(shù)據(jù)規(guī)范

實驗動物名稱、種類等均參照《實驗動物和動物實驗技術(shù)》[16]進(jìn)行規(guī)范總結(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

將納入標(biāo)準(zhǔn)的284 篇文獻(xiàn)的實驗動物種類、性別、造模方法、癌細(xì)胞種類、檢測指標(biāo)等數(shù)據(jù)錄入Excel 表,建立骨肉瘤動物模型數(shù)據(jù)庫。 使用Microsoft Excel 2016 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理與分析。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)篩選結(jié)果

初次檢索到文獻(xiàn)2504 篇,排除不符合標(biāo)準(zhǔn)以及重復(fù)的文獻(xiàn),最終篩選得到符合標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)284 篇,建立數(shù)據(jù)庫。 分析數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)OS 動物模型使用頻數(shù)為302 例,一篇文獻(xiàn)中出現(xiàn)兩次及以上OS 模型的原因是比較不同造模方法[17],以及癌細(xì)胞株種類原因[18-19]引起的藥效差異和模型成功率差異。

2.2 骨肉瘤造模動物種類

將284 篇文獻(xiàn)中使用的動物種類進(jìn)行統(tǒng)計,共有實驗動物15 類[20-26]。 其中使用頻次＞10 的共有3 種,使用最多的為BALB/c-nu/nu 裸鼠(227 例,75.17%),其次為SD 大鼠(20 例,6.62%)和C3H小鼠(11 例,3.64%)。 動物年齡多為(4 ～6)周齡、(6～8)周齡,實驗動物性別選擇以雌性為主,共101例,占比35.94%,其次為雄性(99 例,35.23%),雌雄各半(81 例,28.83%)(21 篇文獻(xiàn)未注明性別情況,故不計入統(tǒng)計),動物種類分布情況見表1。

表1 骨肉瘤模型動物種類Table 1 Osteosarcoma model animal species

2.3 骨肉瘤動物模型造模方法

統(tǒng)計納入標(biāo)準(zhǔn)的284 篇文獻(xiàn)中骨肉瘤動物模型的造模方法,發(fā)現(xiàn)異位移植法使用頻數(shù)為230 例,原位移植法為72 例,且異位移植模型以細(xì)胞液移植為主。 異位移植法中背部皮下移植(66 例,21.85%)最多,其次為腋部皮下移植(55 例,18.21%)、后肢皮下移植(41 例,13.58%);原位移植法是接種在股骨遠(yuǎn)端或脛骨近端的骨髓腔,其中細(xì)胞液移植(51例,16.89%)、組織塊移植(21 例,6.95%)。 細(xì)胞液移植法中明確表明細(xì)胞數(shù)量的有242 例,多選擇1×107/mL 或1×106/mL 癌細(xì)胞濃度注射;瘤組織塊移植法中瘤組織直徑以1～2 mm 大小為主。 詳細(xì)造模情況見表2、表3。

表2 骨肉瘤動物模型造模方法Table 2 Methods for the animal model of osteosarcoma

表3 細(xì)胞液移植法癌細(xì)胞濃度Table 3 Cancer cell concentrations by cell fluid transplantation

2.4 骨肉瘤動物模型造模癌細(xì)胞株種類

在納入的284 篇文獻(xiàn)中,癌細(xì)胞種類使用頻次＞15 的有5 種,分別是人源骨肉瘤MG-63 細(xì)胞100例,鼠源骨肉瘤UMR-106 細(xì)胞39 例、人源骨肉瘤143B 細(xì)胞31 例、患者腫瘤細(xì)胞混懸液23 例、人源骨肉瘤U2OS 細(xì)胞17 例。 詳細(xì)分布見表4。

表4 骨肉瘤動物模型造模癌細(xì)胞株種類Table 4 Type of molded cancer cell lines in animal models of osteosarcoma

2.5 骨肉瘤動物模型檢測指標(biāo)

統(tǒng)計納入標(biāo)準(zhǔn)的284 篇文獻(xiàn)中骨肉瘤動物模型的檢測指標(biāo),若檢測指標(biāo)為同一組織的多個同類型指標(biāo),則歸為一類,不再分開統(tǒng)計[27],如血清中同時檢測TNF-α、IL-6、VEGF、IL-2 水平等;若同一組織被分成不同種類的檢測指標(biāo),則分別統(tǒng)計,如腫瘤組織在同一動物實驗中既檢測腫瘤組織免疫組化又檢測腫瘤組織病理。 且因同一文獻(xiàn)中,不同造模方法的檢測指標(biāo)相同,故檢測指標(biāo)百分比通過納入文獻(xiàn)數(shù)量計算。 其中頻數(shù)＞50 的有5 項,檢測最多的為腫瘤組織表觀指標(biāo):腫瘤大小、瘤徑、個數(shù)、重量等(238 例,83.80%);腫瘤組織HE 病理染色(129 例,45.42%);動物表觀指標(biāo):體重、毛發(fā)、飲食、活動狀態(tài)等(94 例,33.10%);腫瘤組織免疫組化: VEGF、 Bax、 Bcl-2、 Caspase-3、 NF-κB、 CD34、CD31、HIF-1α、Ki67 等(89 例,31.34%);抑瘤率(71例,25.00%)。 骨肉瘤動物模型檢測指標(biāo)詳情見表5。

表5 骨肉瘤動物模型檢測指標(biāo)Table 5 Test indexes of the animal model of osteosarcoma

3 討論

骨肉瘤有兩個高發(fā)期,一個是兒童及青少年時期,多原發(fā)性發(fā)于長骨的干骺端, 以股骨遠(yuǎn)端及脛骨近端最為常見[28-29],可能與骨的生長活動有關(guān)[30],另一個是骨肉瘤高發(fā)期是老年期,患者中多為繼發(fā)性腫瘤,常與Pagets 骨病(Paget disease of bone)及放療后惡變等相關(guān)[31-33]。 患者臨床表現(xiàn)多為局部疼痛與腫脹,且夜間病發(fā)較為嚴(yán)重[34]。 但現(xiàn)有OS 模型尚不完全符合OS 臨床病癥特點,因此進(jìn)一步研究OS 模型,對OS 發(fā)病機(jī)制,以及新藥研發(fā)具有重要意義。 下面對數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析,以期為建立簡便穩(wěn)定的骨肉瘤模型提供參考。

3.1 常用實驗動物分析

本文通過OS 動物模型實驗性文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn),骨肉瘤動物模型以鼠類為主要來源,小鼠以BALB/c-nu/nu 裸鼠為主,大鼠以SD 大鼠為主。 鼠類在遺傳學(xué)、病理學(xué)、生物學(xué)等方面與人類非常相似,且鼠類生長周期短,時間成本低,價格低廉,是做動物實驗的理想材料[35]。 首選模型動物BALB/c-nu/nu裸鼠缺乏成熟的胸腺和免疫T 細(xì)胞,細(xì)胞免疫功能低下,對同種或異種移植物排斥力低。 又因裸鼠無毛,便于觀察和測量腫瘤的生長情況,故BALB/cnu/nu 裸鼠更適用于制備骨肉瘤模型[36]。 縱觀BALB/c-nu/nu 裸鼠生理周期,4 周齡以下裸鼠可能不耐受,導(dǎo)致裸鼠死亡,而6 周齡以上裸鼠體內(nèi)NK細(xì)胞活性增加,免疫力會呈現(xiàn)一定程度的增強(qiáng)[37-38],導(dǎo)致成瘤率降低,因此選擇4 ～6 周齡裸鼠有利于腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移[39]。

3.2 常用造模方法及腫瘤細(xì)胞分析

建立與臨床吻合度高的OS 動物模型是其機(jī)制研究與新藥研發(fā)的重要基礎(chǔ)。 數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)目前OS 模型造模方法主要以異位移植造模為主,占比76.16%,其中背部皮下移植最多,其次為腋部皮下移植、后肢皮下移植。 目前常用的骨肉瘤造模方法各有優(yōu)劣:(1)皮下異位移植模型操作簡便,腫瘤表淺,便于觀察腫瘤的生長,記錄腫瘤的生長曲線,但這種造模方法與原發(fā)性骨肉瘤中的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有較大差別[40];(2)尾靜脈細(xì)胞液移植法是考察骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的重要手段,易于成模;(3)原位移植滿足了腫瘤生長所需要的局部微環(huán)境,具有良好的重復(fù)性,但原位移植需要手術(shù)操作,暴露股骨或脛骨[39,41],需考慮手術(shù)后預(yù)防感染的問題;(4)細(xì)胞液移植法增大了腫瘤細(xì)胞與周圍組織的接觸面積,腫瘤新生血管可為其提供更好的血供,但在細(xì)胞液中腫瘤細(xì)胞處于游離狀態(tài),可能會沿針道走行,致使細(xì)胞液流出或錯位移植等問題[23];(5)組織塊移植法易于固定[42],但瘤組織塊有限的接觸面積限制了機(jī)體對整個瘤組織的血供,影響了腫瘤傳代率,且創(chuàng)面手術(shù)增加了術(shù)后出血和感染的風(fēng)險[43]。

接種的腫瘤細(xì)胞種類是影響骨肉瘤動物模型的重要因素之一,經(jīng)統(tǒng)計,使用較多的骨肉瘤細(xì)胞為人源MG-63 細(xì)胞和鼠源UMR-106 細(xì)胞,兩者均具有較高的成模率。 其中人源MG-63 細(xì)胞具有較高的肺轉(zhuǎn)移率[44-45],且人源MG-63 細(xì)胞能更好地反映骨肉瘤患者的臨床特征,以便實驗結(jié)果的臨床轉(zhuǎn)化。 同時為保證細(xì)胞活力,可在荷瘤前1 d 更換培養(yǎng)基,提高接種成功率[23]。

3.3 高頻檢測指標(biāo)分析

根據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),研究者主要通過表觀指標(biāo)、抑瘤率、腫瘤組織病理、腫瘤組織免疫組化、腫瘤組織PCR、血清中細(xì)胞因子表達(dá)等指標(biāo)檢測,評價骨肉瘤模型成模情況和藥物療效。 所統(tǒng)計文獻(xiàn)中,表觀指標(biāo)包括腫瘤組織表觀指標(biāo)(腫瘤瘤徑、個數(shù)、重量)和動物表觀指標(biāo)(如體重、毛發(fā)、飲食、活動狀態(tài)等),可初步判定骨肉瘤模型成模情況。 腫瘤組織病理進(jìn)一步判斷骨肉瘤模型的病變程度和藥物療效。 腫瘤組織免疫組化、PCR、Western blot 等分子生物學(xué)檢測主要圍繞著細(xì)胞凋亡、炎癥因子、細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲、腫瘤血管生成等展開,故多選擇與之 相 關(guān) 的Bcl-2、 Bax、 Caspase-3、 NF-κB、 STAT3、MEPK、VEGF 等相關(guān)通路進(jìn)行研究[26,46-48],同時腫瘤組織和血清的生化指標(biāo)與病理染色相互佐證,進(jìn)一步探究OS 的機(jī)制通路。

綜上所述,目前對骨肉瘤研究多選擇4 ～6 周齡的BALB/c-nu/nu 裸鼠,性別不限,多使用細(xì)胞液移植法異位造模,癌細(xì)胞主要選擇MG-63 細(xì)胞、UMR-106 細(xì)胞、143B 細(xì)胞或U2OS 細(xì)胞,檢測指標(biāo)多選擇腫瘤組織表觀指標(biāo)、腫瘤組織HE 染色、腫瘤組織免疫組化、動物表觀指標(biāo)、抑瘤率等。 同時,在分析過程中發(fā)現(xiàn)了一些問題:(1)所統(tǒng)計文獻(xiàn)中陽性藥涉及較少;(2)大多文獻(xiàn)未提及動物成模的標(biāo)準(zhǔn),且模型成功的判定沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。 綜合動物倫理學(xué)與實驗實際需要,建議小鼠成模標(biāo)準(zhǔn)為小鼠腫瘤體積在100～150 mm3;(3)血清生化指標(biāo)LDH 和ALP是臨床檢測中的重要依據(jù)[49],建議未來的動物模型中將其作為重要指標(biāo)進(jìn)行考察;(4)中醫(yī)認(rèn)為骨肉瘤病因病機(jī)為氣虛、血瘀、痰濁,而目前骨肉瘤動物模型少有對應(yīng)的中醫(yī)指征,因此可在造模時加入中醫(yī)致病因素,如高脂飼料喂養(yǎng)等方法,誘發(fā)模型動物痰濁血瘀,配合腫瘤細(xì)胞液皮下移植,構(gòu)建符合中西醫(yī)臨床病證結(jié)合要求的骨肉瘤動物模型。

本文通過對骨肉瘤動物模型相關(guān)文獻(xiàn)挖掘與分析,對常用骨肉瘤動物模型的動物選擇、造模方法、優(yōu)缺點及檢測指標(biāo)進(jìn)行整理比較,并針對不足之處進(jìn)行探討,希望本文可為后續(xù)模型完善提供思路,為建立更符合發(fā)病機(jī)制的動物模型提供參考。