張永婷周榮易馬丙祥吳晨蕾謝新月丁雪穎

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)兒科醫(yī)學(xué)院,鄭州 450000;2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,鄭州 450000)

注意缺陷多動障礙( attention deficit/hyperactivity disorder, ADHD)是兒童時期常見的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病,全球范圍研究顯示,ADHD 患病率約為7.2%,并呈上升趨勢[1]。 ADHD 臨床以注意力不集中、多動、沖動為核心癥狀[2],常共患品行障礙、抽動障礙、行為障礙及對立違抗性障礙[3-5],約有50%在兒童或青少年時期被診斷為ADHD 的個體成年后仍會持續(xù)多動癥癥狀[6],這導(dǎo)致患者社會適應(yīng)能力下降,對其生活、學(xué)習(xí)和社交造成極大困擾,給家庭帶來極大壓力。 目前ADHD 臨床上以藥物治療為主,精神興奮劑MPH 為一線治療藥物,臨床療效顯著,但存在長期應(yīng)用成癮性、影響發(fā)育、體重等不良反應(yīng),導(dǎo)致患者依從性差[7]。 黃芩苷是課題組早期在臨床治療ADHD 療效顯著的中藥復(fù)方研究過程中發(fā)現(xiàn)的單體成分[8]。 前期研究顯示,黃芩苷控制ADHD 核心癥狀療效顯著,且未發(fā)現(xiàn)明顯副作用[9]。 截止目前,ADHD 的發(fā)病機(jī)制尚不明確,圍繞多巴胺(dopamine,DA)系統(tǒng)的研究成為當(dāng)前全球范圍內(nèi)ADHD 發(fā)病機(jī)制的研究熱點,受國際社會廣泛關(guān)注[10]。 課題組前期基礎(chǔ)研究表明,黃芩苷對DA 系統(tǒng)具有特殊親和力[11-12],不同劑量的黃芩苷均能控制ADHD 核心癥狀,且在150 mg/kg 劑量下療效最為穩(wěn)定[9]。 深入機(jī)制研究表明,這一療效或許與黃芩苷調(diào)控前額葉皮質(zhì)、紋狀體內(nèi)DA 囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)中囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體Ⅱ型(VMAT2)的表達(dá)有關(guān)[8]。 囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)是DA 囊泡循環(huán)過程中極為關(guān)鍵的環(huán)節(jié),對腦內(nèi)DA 正常釋放、維持腦內(nèi)DA 正常水平意義重大;VMAT2 作為主要表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)末梢的關(guān)鍵蛋白[13],在DA 轉(zhuǎn)運(yùn)和釋放中發(fā)揮關(guān)鍵作用。 研究顯示,ADHD 患者及其動物模型SHR 大鼠均存在腦內(nèi)VMAT2 表達(dá)下調(diào)現(xiàn)象,導(dǎo)致DA 轉(zhuǎn)運(yùn)速度降低和釋放減少,形成腦內(nèi)DA 缺陷[8,14-15]。 研究顯示,VMAT2 功能異常導(dǎo)致大鼠腦內(nèi)DA 含量顯著降低而表現(xiàn)出ADHD 核心癥狀[16]。 基于課題組前期研究和以上理論基礎(chǔ),作者推測VMAT2 可能作為黃芩苷發(fā)揮藥效的潛在作用靶點。 為驗證黃芩苷是否通過作用于DA 囊泡循環(huán)中VMAT2 這一靶點達(dá)到控制ADHD 核心癥狀的療效,進(jìn)而探究其潛在療效機(jī)制。 本研究在前期研究基礎(chǔ)上,應(yīng)用VMAT2 抑制劑丁苯那嗪繼續(xù)開展研究工作,以期為進(jìn)一步闡明黃芩苷的療效機(jī)制以及后期新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

4 周齡SPF 級SHR 雄性大鼠36 只,體重(103±10)g;4 周齡SPF 級WKY 雄性大鼠6 只,體重(93.5±7)g,均采購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2021-0001]。 SHR 大鼠起源于東京高血壓Wistar 大鼠,經(jīng)交叉培育獲得,幼齡SHR 大鼠是國際公認(rèn)的ADHD 動物模型,該模型在10 周齡前不表現(xiàn)高血壓特征,而表現(xiàn)出ADHD 核心臨床癥狀,被廣泛應(yīng)用于ADHD 的研究,WKY 大鼠為其天然對照組[17-18]。 所有動物均飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級動物實驗中心[SYXK(豫)2021-0015],自由飲水進(jìn)食,溫度21 ～24℃,濕度50%～60%。 動物倫理申請經(jīng)由河南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審核批準(zhǔn)(DWLL202202007),符合《實驗動物福利倫理審查指南》(GB/T 35892-2018)、《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》和《河南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會章程》的相關(guān)規(guī)定。 在實驗中,我們嚴(yán)格遵循實驗動物使用的3R 原則,減少對動物的傷害并給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

黃芩苷(貨號:A0016)購自成都曼斯特生物科技有限公司,保存于4℃冰箱;丁苯那嗪(貨號:GC13672)購自上海宏葉生物科技有限公司,保存于-20℃冰 箱; MPH (批 號: 1IE648, 分 裝 批 號:1IE648C)購自河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,生產(chǎn)于Janssen-Cilag Manufacturing,LLC,西安楊森制藥有限公司分裝,規(guī)格為每片18 mg,保存于4℃冰箱。曠場實驗設(shè)備:包含曠場實驗箱、SMART V3.0 軟件,購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司(型號:63041);水迷宮實驗設(shè)備:包含Morris 攝像系統(tǒng)、恒溫水箱、SMART V3.0 軟件,購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司(型號:63034)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物給藥及分組

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d 后,進(jìn)行給藥。 配藥:根據(jù)給藥量150 mg/kg[9],灌胃量1 mL/100 g,配制黃芩苷溶液,冰箱4℃保存;根據(jù)給藥量1.5 mg/kg[19],灌胃量1 mL/100 g,配制MPH 溶液,每顆藥(含18 mg MPH)配120 mL 純水,冰箱4℃保存;根據(jù)給藥量3 mg/kg[20],注射量0.5 mL/100 g,配制丁苯那嗪溶液,即配即用;灌胃前將藥物溶液定量取出,水浴復(fù)溫至30℃后予大鼠灌胃。 給藥前稱重,根據(jù)體重調(diào)整給藥量,每天給藥1 次,時間固定于上午8:00～12:00。 灌胃前將藥物溶液定量取出,水浴復(fù)溫至30℃后予大鼠灌胃,MPH 組(1.5 mg/kg)、黃芩苷組(150 mg/kg)按體重(1 mL/100 g)灌胃給藥,空白組、模型組給等量生理鹽水,MPH+丁苯那嗪組、黃芩苷+丁苯那嗪組在灌胃給藥同時,按體重(0.5 mL/100 g)腹腔注射丁苯那嗪(3 mg/kg)。

1.3.2 曠場實驗

在給藥第0、7、14、21、28 天進(jìn)行曠場實驗,使大鼠從中央?yún)^(qū)域進(jìn)入曠場中,電腦持續(xù)穩(wěn)定追蹤大鼠軌跡,SMART V3.0 軟件記錄大鼠運(yùn)動總距離及平均速度,每只大鼠每次曠場實驗時間為5 min,實驗結(jié)束后將大鼠放回籠中,清理曠場后進(jìn)行下一只。

1.3.3 Morris 水迷宮實驗

在給藥第3 周進(jìn)行為期6 d 的Morris 水迷宮實驗,前5 d 為隱匿站臺實驗,將水箱內(nèi)注水,水面高出逃生平臺約1 cm;水面分為4 個象限,按方位分別命名為西北象限、東北象限、東南象限、西南象限。 逃生平臺置于西南象限中央?yún)^(qū)域。 將大鼠從四個象限依次放入水中,連續(xù)5 d 入水象限的順序采取半隨機(jī)循環(huán)方式,避免固定入水順序影響實驗結(jié)果[21];將大鼠依次從不同象限放入水中,當(dāng)大鼠找到逃生平臺并停留10 s 后,停止信號追蹤,若大鼠120 s 內(nèi)未找到逃生平臺,將其引導(dǎo)至逃生平臺并停留15 s 后,進(jìn)行下一次實驗,結(jié)束后烘干放回籠中。 實驗第6 天為空間探索實驗,撤除逃生平臺,將大鼠從東北象限放入水中,記錄120 s 內(nèi)大鼠穿越平臺次數(shù)和運(yùn)動軌跡,實驗進(jìn)行兩次求均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較采用t檢驗,多組定量數(shù)據(jù)的組間比較采用單因素方差分析,若等方差(P＞0.05)則用LSD進(jìn)行組間比較,若不等方差(P＜0.05)則用DunnettT3 進(jìn)行組間比較。 組間比較結(jié)果中,P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 曠場實驗結(jié)果

2.1.1 曠場實驗中大鼠運(yùn)動總距離實驗結(jié)果

實驗第0 天,空白組運(yùn)動總距離顯著小于各實驗組(P＜0.05)。 實驗第7、14、21、28 天,MPH 組、黃芩苷組運(yùn)動總距離較模型組顯著減少(P＜0.05),且這兩組間無明顯差異;MPH+丁苯那嗪組運(yùn)動總距離較MPH 組顯著增加(P＜0.05)。 實驗第14、21天,黃芩苷+丁苯那嗪組運(yùn)動總距離較黃芩苷組顯著增加(P＜0.05)。 實驗第28 天,黃芩苷+丁苯那嗪組運(yùn)動總距離較模型組顯著減少(P＜0.05),較黃芩苷組顯著增加(P＜0.05)。 見表1,圖1。

圖1 曠場實驗每組大鼠運(yùn)動總距離比較Figure 1 Comparison of total distance traveled by each group of rats in the open field experiment

表1 曠場實驗中每組大鼠運(yùn)動總距離的比較結(jié)果(±s,m,n=6)Table 1 Comparison of total distance traveled by each group of ratsin the open field experiment

表1 曠場實驗中每組大鼠運(yùn)動總距離的比較結(jié)果(±s,m,n=6)Table 1 Comparison of total distance traveled by each group of ratsin the open field experiment

注:與空白組比較, aP＜0.05;與模型組比較, bP＜0.05;與MPH 組比較, cP＜0.05;與黃芩苷組比較,dP＜0.05;與MPH+丁苯那嗪組比較,eP＜0.05。Note.Compared with normal control group, aP＜0.05.Compared with model group, bP＜0.05.Compared with methylphenidate hydrochloride group,cP＜0.05.Compared with baicalin group, dP＜0.05.Compared with MPH+tetrabenazine group, eP＜0.05.

組別Groups第0 天Day 0第7 天Day 7第14 天Day 14第21 天Day 21第28 天Day 28 Normal空co白nt組rol group 7.9±3.9 4.3±1.3 4.0±0.5 3.3±0.4 3.6±1.2 Mo模de型l g組roup 45.8±3.7a 31.0±5.4a 29.9±5.0a 30.7±4.5a 28.4±5.6a MethylphenidaM te P h Hy d組rochloride group 44.2±2.5a 19.7±5.5ab 17.2±5.9ab 16.2±3.0ab 14.5±5.8ab Ba黃ica芩lin苷g組roup 42.4±8.7a 21.6±2.2ab 17.8±5.8ab 14.9±6.1ab 12.3±5.4ab MP MH P+H tet+ra丁be苯na那zin嗪e組group 46.1±4.5a 33.6±5.9ac 29.2±5.2ac 30.4±4.1ac 28.4±6.1ac Baic黃al芩in+苷te+tr丁ab苯ena那zin嗪e組group 45.1±5.6a 28.2±6.7a 26.5±6.7ad 24.3±6.6ad 20.2±6.1abde F 33.514 18.646 14.148 21.040 13.348 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.1.2 曠場實驗中大鼠運(yùn)動平均速度實驗結(jié)果

實驗第0 天,空白組運(yùn)動平均速度較各實驗組顯著降低(P＜0.05)。 實驗第7、14、21、28 天,黃芩苷組、MPH 組運(yùn)動平均速度較模型組顯著降低(P＜0.05),且這兩組間無明顯差異。 實驗第14、21、28天,MPH+丁苯那嗪組運(yùn)動平均速度較MPH 組顯著升高(P＜0.05)。 實驗第7、14、21、28 天,黃芩苷+丁苯那嗪組運(yùn)動平均速度較模型組明顯降低,較黃芩苷組明顯升高。 見表2,圖2。

圖2 曠場實驗每組大鼠運(yùn)動平均速度比較Figure 2 Comparison of average exercise speed of rats in each group in open field experiment

表2 曠場實驗中每組大鼠運(yùn)動平均運(yùn)動速度比較(±s,cm/s,n=6)Table 2 Comparison of average movement speed of each group of rats in the open field experiment

表2 曠場實驗中每組大鼠運(yùn)動平均運(yùn)動速度比較(±s,cm/s,n=6)Table 2 Comparison of average movement speed of each group of rats in the open field experiment

注:與空白組比較, aP＜0.05;與模型組比較, bP＜0.05;與MPH 組比較, cP＜0.05;與MPH+丁苯那嗪組比較, eP＜0.05。Note.Compared with normal control group, aP＜0.05.Compared with model group, bP＜0.05.Compared with methylphenidate hydrochloride group, cP＜0.05.Compared with MPH+tetrabenazine group, eP＜0.05.

組別Groups第0 天Day 0第7 天Day 7第14 天Day 14第21 天Day 21第28 天Day 28 Normal空co白nt組rol group 2.5±1.4 1.4±0.4 1.3±0.2 1.1±0.1 1.4±0.2 Mo模de型l g組roup 15.4±1.4a 13.1±2.2a 11.3±0.8a 11.3±1.2a 9.1±2.3a MethylphenidaM te P h Hy d組rochloride group 14.9±0.8a 7.8±3.2ab 5.7±2.0ab 6.7±0.7ab 4.9±2.1ab Ba黃ica芩lin苷g組roup 14.3±2.8a 7.6±3.5ab 6.7±2.8ab 6.8±1.7ab 4.4±2.4ab MP MHP+H tet+ra丁be苯na那zin嗪e組group 15.5±1.4a 11.2±2.0a 10.1±1.8ac 10.4±1.0ac 9.5±2.0ac Baic黃al芩in+苷te+tr丁abe苯na那zin嗪e組group 17.8±3.3a 9.7±2.1a 8.6±2.5a 7.1±2.3abe 6.9±1.9a F 28.536 10.745 13.795 28.469 9.860 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.1.3 曠場實驗軌跡

曠場實驗軌跡中,空白組在中央?yún)^(qū)域進(jìn)入曠場后立即進(jìn)入周圍區(qū)域運(yùn)動,未進(jìn)入中央?yún)^(qū)域,運(yùn)動軌跡短。 模型組進(jìn)入曠場后運(yùn)動軌跡遍布整個曠場,中央?yún)^(qū)域運(yùn)動軌跡明顯增加,運(yùn)動軌跡長。MPH 組在周圍區(qū)域運(yùn)動軌跡多,中央?yún)^(qū)域運(yùn)動少,運(yùn)動軌跡較模型組明顯減少。 黃芩苷組進(jìn)入曠場后立即進(jìn)入周圍區(qū)域運(yùn)動,未進(jìn)入中央?yún)^(qū)域,運(yùn)動軌跡較模型組明顯減少;MPH+丁苯那嗪組在中央?yún)^(qū)域運(yùn)動軌跡占比較MPH 組增大,運(yùn)動軌跡長;黃芩苷+丁苯那嗪組在中央?yún)^(qū)域運(yùn)動軌跡較模型組減少,較黃芩苷組增加,如圖3。

圖3 曠場實驗中各組大鼠典型運(yùn)動軌跡圖Figure 3 Typical movement trajectory plots of different groups of rats in the open field experiment

曠場實驗結(jié)果顯示,在給藥第7、14、21、28 天,MPH 組和黃芩苷組運(yùn)動總距離和平均速度較模型組顯著降低(P＜0.05),且這兩組間無明顯差異;在給藥第14、21、28 天,黃芩苷+丁苯那嗪組運(yùn)動總距離較黃芩苷組顯著增大(P＜0.05),平均速度較黃芩苷組明顯增大,運(yùn)動總距離和平均速度較模型組明顯減小。

2.2 Morris 水迷宮實驗結(jié)果

2.2.1 Morris 水迷宮空間隱匿站臺實驗中各組大鼠潛伏期實驗結(jié)果

實驗第2 ～5 天,各實驗組潛伏期較空白組顯著縮短(P＜0.05)。 實驗第1 天,黃芩苷組潛伏期較模型組顯著縮短(P＜0.05);第2 ～5 天,黃芩苷組、MPH 組潛伏期較模型組顯著縮短(P＜0.05),這兩組在2～4 d 組間無明顯差異,在第5 天黃芩苷組潛伏期較MPH 組顯著縮短(P＜0.05)。 實驗第1 ～5天,MPH+丁苯那嗪組潛伏期較MPH 組顯著延長(P＜0.05)。 實驗第1、3、4、5 天,黃芩苷+丁苯那嗪組潛伏期較黃芩苷組顯著延長(P＜0.05);第4、5 天,黃芩苷+丁苯那嗪組潛伏期較模型組顯著縮短(P＜0.05)。 見表3,圖4。

圖4 Morris 水迷宮隱匿站臺實驗各組大鼠潛伏期隨時間的變化情況Figure 4 Changes in the latency period of rats in different groups during the Morris water maze experiment over time

表3 Morris 水迷宮隱匿站臺實驗每天各組大鼠潛伏期時間比較 (±s,s,n=6)Table 3 Comparison of latency periods of different groups of rats in the hidden platform experiment of the Morris water maze each day

表3 Morris 水迷宮隱匿站臺實驗每天各組大鼠潛伏期時間比較 (±s,s,n=6)Table 3 Comparison of latency periods of different groups of rats in the hidden platform experiment of the Morris water maze each day

注:與空白組比較, aP＜0.05;與模型組比較, bP＜0.05;與MPH 組比較, cP＜0.05;與黃芩苷組比較, dP＜0.05。Note.Compared with normal control group, aP＜0.05.Compared with model group, bP＜0.05.Compared with methylphenidate hydrochloride group, cP＜0.05.Compared with baicalin group, dP＜0.05.

組別Groups第1 天Day 1第2 天Day 2第3 天Day 3第4 天Day 4第5 天Day 5空白組Normal control group 38.3±9.8 41.3±3.9 38.9±4.7 47.9±8.0 28.8±4.1模型組Model group 27.6±3.0a 20.6±6.4a 26.5±5.1a 25.4±4.1a 22.6±6.2a MPH 組Methylphenidate hydrochloride group 20.6±4.8a 10.2±1.8ab 12.6±6.4ab 9.8±4.7ab 13.7±1.6ab黃芩苷組Baicalin group 14.8±3.2ab 11.6±2.8ab 14.9±3.6ab 8.9±2.4ab 9.3±3.6abc MPH+丁苯那嗪組MPH+tetrabenazine group 33.2±9.0c 16.5±3.7ac 21.8±4.7ac 19.0±4.0ac 20.7±5.1ac黃芩苷+丁苯那嗪組Baicalin+tetrabenazine group 27.4±7.8ad 15.4±3.4a 22.8±5.8ad 16.8±2.7abd 16.5±1.3abd F 6.122 33.834 13.277 37.522 11.725 P 0.002 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2.2 Morris 水迷宮空間探索實驗中各組大鼠穿越平臺次數(shù)、在目標(biāo)象限運(yùn)動距離和停留時間占比實驗結(jié)果

實驗第6 天,除MPH+丁苯那嗪組外,各實驗組穿越平臺次數(shù)、在目標(biāo)象限運(yùn)動距離和停留時間占比較空白組顯著增加(P＜0.05);MPH 組、黃芩苷組穿越平臺次數(shù)、在目標(biāo)象限運(yùn)動距離和停留時間占比較模型組顯著增加(P＜0.05),且這兩組間無明顯差異;MPH+丁苯那嗪組穿越平臺次數(shù)、在目標(biāo)象限運(yùn)動距離和停留時間占比較MPH 組顯著減少(P＜0.05);黃芩苷+丁苯那嗪組在目標(biāo)象限運(yùn)動距離和停留時間占比較黃芩苷組顯著降低(P＜0.05),較模型組明顯升高。 見表4。

表4 Morris 水迷宮空間探索實驗各組大鼠穿越平臺次數(shù)、目標(biāo)象限運(yùn)動距離和停留時間占比(±s,n=6)Table 4 Number of platform crossings, distance moved within the target quadrant and proportion of time spent in the target quadrant in the Morris water maze spatial exploration experiment for each group of rats

表4 Morris 水迷宮空間探索實驗各組大鼠穿越平臺次數(shù)、目標(biāo)象限運(yùn)動距離和停留時間占比(±s,n=6)Table 4 Number of platform crossings, distance moved within the target quadrant and proportion of time spent in the target quadrant in the Morris water maze spatial exploration experiment for each group of rats

注:與空白組比較, aP＜0.05;與模型組比較, bP＜0.05;與MPH 組比較, cP＜0.05;與黃芩苷組比較, dP＜0.05。Note.Compared with normal control group, aP＜0.05.Compared with model group, bP＜0.05.Compared with methylphenidate hydrochloride group, cP＜0.05.Compared with baicalin group, dP＜0.05.

組別Groups穿越平臺次數(shù)Number of platform crossings目標(biāo)象限運(yùn)動距離占比(%)Proportion of movement distance within the target quadrant目標(biāo)象限停留時間占比(%)Proportion of time spent within the target quadrant空白組Normal control group 0.8±0.6 16.3±4.7 15.7±4.1模型組Model group 2.0±0.4a 25.1±1.8a 25.6±5.6a MPH 組Methylphenidate hydrochloride group 3.4±0.8ab 38.5±7.2ab 38.5±5.3ab黃芩苷組Baicalin group 3.1±0.9ab 34.1±1.4ab 34.4±3.1ab MPH+丁苯那嗪組MPH+tetrabenazine group 1.5±0.9c 21.9±3.1c 24.4±2.7ac黃芩苷+丁苯那嗪組Baicalin+tetrabenazine group 2.5±0.6a 27.7±3.4ad 27.6±3.7ad F 7.825 15.558 14.313 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2.3 Morris 水迷宮空間探索實驗典型軌跡圖

Morris 水迷宮空間探索軌跡圖中,空白組運(yùn)動軌跡較短,各象限運(yùn)動軌跡分布均勻;模型組運(yùn)動軌跡混亂,各象限平均分布;MPH 組、黃芩苷組在目標(biāo)象限運(yùn)動軌跡占比較模型組明顯增大;MPH+丁苯那嗪組運(yùn)動軌跡與模型組相當(dāng);黃芩苷+丁苯那嗪組在目標(biāo)象限運(yùn)動軌跡占比較模型組增加,較黃芩苷組減少。 如圖5。

Morris 水迷宮實驗結(jié)果顯示,MPH 組、黃芩苷組潛伏期較模型組顯著縮短(P＜0.05),穿越平臺次數(shù)、在目標(biāo)象限運(yùn)動距離和停留時間占比較模型組顯著升高(P＜0.05),且這兩組在實驗1～4 d 組間無明顯差異,第5 天黃芩苷組潛伏期較MPH 組顯著縮短(P＜0.05)。 黃芩苷+丁苯那嗪組潛伏期在實驗第1、3、4、5 天,較黃芩苷組顯著延長(P＜0.05),在實驗第4、5 天較模型組顯著縮短(P＜0.05);黃芩苷+丁苯那嗪組在目標(biāo)象限運(yùn)動距離和停留時間占比相較于黃芩苷組顯著降低(P＜0.05),相較于模型組明顯升高。

3 討論

腦內(nèi)DA 是由胺能神經(jīng)吸收血液中酪氨酸,在酪氨酸羥化酶催化下形成左旋多巴,再由多巴脫羧化酶最終合成[22]。 合成后的DA 主要在突觸前膜經(jīng)囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體Ⅱ型(VMAT2)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入突觸小泡儲存,從而避免DA 被細(xì)胞質(zhì)中單胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)氧化降解失活,當(dāng)動作電位到達(dá)神經(jīng)末梢時,突觸小泡與突觸前膜融合,胞吐釋放DA[23]。 VMAT2 的正常表達(dá)對腦內(nèi)DA 的轉(zhuǎn)運(yùn)、釋放以及維持腦內(nèi)DA 正常水平意義重大。 課題組前期研究發(fā)現(xiàn),黃芩苷能夠顯著提高VMAT2蛋白及RNA 表達(dá)水平,尤其對紋狀體內(nèi)VMAT2 表達(dá)的影響最為直接[12],但其具體的作用靶點尚不明確。 這為本次探討黃芩苷潛在作用靶點的研究奠定了基礎(chǔ)。

曠場實驗中大鼠的運(yùn)動距離和平均速度反映大鼠的多動和沖動行為[24]。 Morris 水迷宮實驗通過檢測大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力來評估大鼠注意力情況[25-26]。 本次實驗研究顯示,在給藥前的曠場實驗中,所有實驗組運(yùn)動總距離和平均速度較空白組顯著升高,實驗組各組間無明顯差異,表明實驗組大鼠與空白組對比,存在明顯多動、沖動癥狀。 在給藥過程中的曠場實驗中,MPH 組和黃芩苷組運(yùn)動總距離和平均速度較模型組顯著降低,且這兩組間無明顯差異,表明黃芩苷與MPH 均能控制SHR 大鼠多動、沖動癥狀,并且兩種藥物的療效無明顯差異。研究表明,MPH 通過與DA 轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)結(jié)合,抑制DAT 的生理功能,減少DA 重攝取,增加腦內(nèi)DA含量治療ADHD 核心癥狀[27]。 丁苯那嗪在本實驗中作為VMAT2 特異性阻斷劑,能夠可逆性抑制VMAT2 表達(dá)[28]。 在曠場實驗過程中,MPH+丁苯那嗪組大鼠運(yùn)動總距離和平均速度較MPH 組顯著升高,與模型組對比無明顯差異。 這一實驗結(jié)果我們推測,可能是丁苯那嗪阻斷VMAT2 對DA 的轉(zhuǎn)運(yùn)和釋放,DA 釋放減少,導(dǎo)致DAT 再攝取抑制過程中突觸間隙DA 含量降低,即使MPH 發(fā)揮抑制作用也不能達(dá)到腦內(nèi)DA 水平的正常峰度,導(dǎo)致MPH 療效不佳,但其確切機(jī)制還需進(jìn)一步研究。 Morris 水迷宮隱匿站臺實驗中,MPH 組、黃芩苷組大鼠潛伏期較模型組顯著縮短,穿越平臺次數(shù)、在目標(biāo)象限運(yùn)動距離和停留時間占比較模型組顯著升高,且這兩組間無明顯差異。 這一結(jié)果表明,MPH 與黃芩苷均能提高大鼠空間記憶和學(xué)習(xí)能力,改善大鼠注意力不集中,且兩種藥物療效相當(dāng)。

黃芩苷+丁苯那嗪組大鼠在曠場實驗中運(yùn)動總距離和平均速度較模型組顯著降低,較黃芩苷組顯著升高,在隱匿站臺實驗中的潛伏期較黃芩苷組顯著延長,較模型組稍有縮短且兩組之間的差異隨實驗時間的延長逐漸顯著,在空間探索實驗中穿越平臺次數(shù)、在目標(biāo)象限運(yùn)動距離和停留時間占比較模型組升高,較黃芩苷組顯著降低。 實驗結(jié)果表明,黃芩苷作用于VMAT2 控制ADHD 核心癥狀,但其作用靶點并不單一,存在黃芩苷治療ADHD 的其他靶點,而這些靶點尚不明確,這也是課題組后期的研究方向。

本研究在前期研究基礎(chǔ)上,應(yīng)用VMAT2 特異性抑制劑丁苯那嗪初步探索黃芩苷治療ADHD 的潛在療效機(jī)制及作用靶點,但深入的機(jī)制分析尚未進(jìn)行。 實驗尚存在不足之處,缺乏VMAT2 的激動劑組,以便更加明確VMAT2 的表達(dá)對大鼠ADHD癥狀的影響,我們將在后期實驗中進(jìn)行補(bǔ)充和探索。