劉浩東, 姜喜全, 牛 昊, 劉鈺博, 李 惠, 劉 媛, Wei Zhang, 李魯艷, 陳 婷, 趙燕杰*, 倪家升*

1. 山東建筑大學(xué)理學(xué)院, 山東 濟南 250101 2. 齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)激光研究所, 山東 濟南 250104

引 言

拉曼光譜由于能夠提供實時的、 無損的樣品指紋光譜, 且具有不受水的干擾、 樣品制備簡單等特點, 可以對多種有機物和無機物進行定性[1-2]和定量[3-4]的分析測量, 現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)以及科學(xué)研究中[5-6]。 通常情況下, 拉曼信號的強弱與被測物質(zhì)的濃度呈正向線性關(guān)系, 然而在實際檢測場合中, 會受到背景電流噪聲、 檢測設(shè)備自身穩(wěn)定性以及激發(fā)光與待檢測樣品相互作用位置等多種制約因素的影響, 導(dǎo)致拉曼光譜的重現(xiàn)性差[7]。 此外, 當(dāng)改變激光器功率或者拉曼光譜儀積分時間等儀器參數(shù)以及檢測樣品所用到的容器時, 繪制的擬合標(biāo)準曲線往往不具有通用性, 需要重新繪制, 這將增加更多的工作時間。

Wopenka與Pasteris等[8]提出的拉曼強度歸一化理論, 為拉曼光譜法在基于強度比值的定量分析領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了理論依據(jù), 使拉曼光譜分析的發(fā)展方向逐漸向定量化領(lǐng)域擴展。

拉曼散射的強度I與多種影響因素有關(guān), 數(shù)學(xué)表達可以簡化為

I=KNσI0

(1)

式(1)中:σ為拉曼散射截面積;I0為入射光強度;N為被探測體積內(nèi)的分子數(shù);K為相關(guān)比例常數(shù),K值與實驗儀器以及拉曼散射的效率相關(guān)聯(lián)。 通常情況下, 拉曼散射的強度隨檢測物質(zhì)的濃度一般呈線性關(guān)系, 但拉曼散射強度還受到實驗過程中其他測試條件的影響(例如激發(fā)光強度、 設(shè)備的相關(guān)光學(xué)配置和結(jié)構(gòu)以及校準樣品等), 因此不能與檢測目標(biāo)的濃度直接聯(lián)系起來, 必須排除實驗過程中測試條件對結(jié)果的影響, 基于相對強度的拉曼光譜歸一化方法是消除該影響最有效的方法。 數(shù)學(xué)表達式為

(2)

式(2)中: 下標(biāo)R表示實驗過程中作為對照所建立的參考系, 在實際測量過程中需保證參考系內(nèi)的拉曼光譜測量條件與被測樣品完全相同。 被探測體積內(nèi)的分子數(shù)可以用于拉曼定量分析, 數(shù)學(xué)定義為

(3)

式(3)中:σR/σ可以看作是一個常數(shù), 作為對照的參考系在與被測樣品處于完全相同的基準下, 相對拉曼強度I/IR就可直接與濃度相關(guān)聯(lián), 從而作為被測樣品濃度定量分析的參照。

目前, 拉曼光譜的定量分析方法主要以相對強度為基準, 包括內(nèi)標(biāo)法[9-10]和外標(biāo)法[11]。 外標(biāo)法要求樣品和相應(yīng)標(biāo)定物的拉曼光譜需連續(xù)采集, 以便通過外標(biāo)物對拉曼信號進行校正, 但采集過程的不同步性使得采集條件不可避免地會有差異。 而內(nèi)標(biāo)法所用的標(biāo)定物存在于樣品中, 樣品和內(nèi)標(biāo)物的拉曼信號在同一條件下同時采集, 比外標(biāo)法更適合于拉曼強度的校正。 因此, 內(nèi)標(biāo)法常用于減少光譜重現(xiàn)性對拉曼測量分析結(jié)果的影響, 已有相關(guān)報道采用該方法對溶液中待測物濃度進行定量分析[12-13]。

采用激光拉曼系統(tǒng)研究了不同濃度的乙醇溶液拉曼光譜的特征峰(C-C-O對稱伸縮, 874 cm-1)與其他參考峰/內(nèi)標(biāo)峰的相對強度關(guān)系, 分別提出基于乙醇本征峰位比值法和基于CCl4特征峰位的內(nèi)標(biāo)法, 從實驗上驗證了在高濃度乙醇溶液中分別采用以上兩種方法對乙醇溶液進行定量分析的問題, 并建立了線性回歸分析模型, 為高濃度范圍的乙醇溶液較為精準的定量分析提供了有效方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

選用RLE-RI02拉曼光譜檢測系統(tǒng)(北京杏林睿光科技有限公司), 該檢測系統(tǒng)由光譜儀(波段350～1 050 nm, 分辨率～1 nm, 積分時間0～10 s可調(diào))、 電荷耦合元件CCD(采用2 048 Pixels, 在垂直方向的感光面上像素尺寸為14 μm×200 μm)、 激光器[采用波長(785±0.5) nm的半導(dǎo)體激光器, 線寬<0.1 nm, 功率支持0～500 mW線性可調(diào)節(jié)]、 拉曼探頭(瑞利散射截止深度OD6, 焦距為8 mm)、 樣品檢測池、 光纖等組成。

無水乙醇(AR, ≥99.7%)、 四氯化碳(AR, ≥99.5%)、 去離子水。 實驗測試的溶液均由試劑與去離子水配置。

1.2 測試方法

實驗一: 乙醇峰位比值法擬合曲線的繪制, 配置乙醇水溶液, 溶液濃度以體積分數(shù)表示, 用去離子水將無水乙醇稀釋至濃度分別為88%～99.7%(無水乙醇濃度取99.7%)的標(biāo)準溶液, 濃度間隔為2%。 取各濃度樣品溶液2 mL于比色皿中, 分別放入待檢測樣品池進行測定, 采集樣品拉曼光譜并記錄其光譜數(shù)據(jù)。 為降低儀器響應(yīng)時間對光譜數(shù)據(jù)的影響, 測量時選擇單步測量, 并在測量前扣除暗背景及背景噪聲。 激光功率為500mW, 拉曼光譜儀掃描光譜波數(shù)范圍125～3 350 cm-1, 拉曼信號相對強度范圍以最高峰值為參考, 實驗中取0～1 300, 積分時間2 s, 積分次數(shù)1次。 重復(fù)測量三次并取平均值。

實驗二: 四氯化碳內(nèi)標(biāo)法擬合曲線的繪制, 配置乙醇水溶液, 溶液濃度以體積分數(shù)表示, 用去離子水將無水乙醇稀釋至濃度分別為88%～99.7%(無水乙醇濃度取99.7%)的標(biāo)準溶液, 濃度間隔為2%。 取各濃度樣品溶液2 mL于比色皿中, 各樣品溶液中分別加入0.3 mL四氯化碳, 此時溶液中乙醇體積分數(shù)發(fā)生改變, 充分混合后, 樣品混合液中乙醇的濃度(體積分數(shù))變?yōu)?6.5%～86.7%, 將混合后的待測樣品分別放入樣品檢測池進行測定, 采集樣品拉曼光譜并記錄其光譜數(shù)據(jù)。 為降低儀器響應(yīng)時間對光譜數(shù)據(jù)的影響, 測量時選擇單步測量, 并在測量前扣除暗背景及背景噪聲。 激光功率為500 mW, 拉曼光譜儀掃描光譜波數(shù)范圍125～3 350 cm-1, 拉曼信號相對強度范圍以最高峰值為參考, 在該實驗中取0～1 550, 積分時間2 s, 積分次數(shù)1次。 重復(fù)測量三次并取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 乙醇溶液峰位比值法標(biāo)準曲線的建立

對無水乙醇溶液進行測試, 得到的拉曼光譜信號如圖1中曲線(a)所示, 用Savitzky-Golay(S-G)濾波擬合法對曲線(a)進行2階多項式平滑處理, 處理后的光譜圖如圖1中曲線(b)所示。 無水乙醇有多個拉曼特征峰, 由圖1可以看出, 在874 cm-1附近有較高的絕對峰強, 由C-C-O的對稱伸縮引起的, 其余峰位振動模式見表1。 選定874 cm-1處的拉曼信號作為乙醇定量分析的定量峰; 初步選擇1 041、 1 083、 1 267和1 446 cm-1四個峰作為峰位比值法歸一化的參考峰。

圖1 無水乙醇拉曼光譜Fig.1 Raman spectroscopy of anhydrous ethanol

表1 乙醇分子振動模式及拉曼峰位移Table 1 Vibrational modes and Raman peak shifts of ethanol molecules

分別以四個參考峰作為基準, 對不同濃度的乙醇溶液進行測定。 將乙醇874 cm-1處拉曼特征峰強度與其他特征峰強度進行對比, 得到兩個峰位的相對強度, 并對其進行歸一化, 為直觀顯示擬合曲線, 對1 267 cm-1峰位數(shù)據(jù)作等比例縮小50%處理。 將歸一化后的峰強作為縱坐標(biāo)、 乙醇溶液的濃度為橫坐標(biāo), 對以上所述不同濃度的數(shù)據(jù)進行線性擬合。 以上選取的四組參考峰所對應(yīng)的擬合標(biāo)準曲線如圖2所示, 拉曼信號的相對強度與乙醇的濃度之間存在較為良好的線性關(guān)系, 標(biāo)準曲線的擬合系數(shù)R2分別為0.991、 0.992、 0.991、 0.996, 說明四個拉曼特征峰均有望作為體系中乙醇定量檢測的參考峰。

圖2 不同參考峰相對強度與乙醇濃度線性擬合曲線Fig.2 Linear fitting curves of relative intensities of different reference peaks with ethanol concentration

分別以四個參考峰作為基準, 對比擬合標(biāo)準曲線的斜率及方差等參數(shù)隨時間的變化率, 即對其時間穩(wěn)定性進行檢驗(t檢驗)。t檢驗中, 30 d之后實驗參數(shù)以及實驗中主要參考的物理量均與第一次實驗相同。 無水乙醇為易揮發(fā)溶液, 在實驗中采用避光環(huán)境, 且第一次實驗與30 d之后的實驗環(huán)境溫度保持一致, 同時對無水乙醇做嚴格密封處理, 經(jīng)歸一化處理后, 外界因素對實驗結(jié)果的影響已降到可控條件下的最低水平。 距第一次實驗測量30 d時, 再次重復(fù)進行實驗, 分別采集對應(yīng)不同濃度的乙醇溶液的拉曼光譜, 并采用上述1 041 cm-1等四個參考峰的測量結(jié)果重新繪制對應(yīng)峰位的擬合標(biāo)準曲線。 兩條曲線的對比關(guān)系如圖3所示。 對不同參考峰的各組數(shù)據(jù)做聯(lián)合假設(shè)檢驗(F檢驗), 顯著性水平(α)取0.05,F檢驗表明, 在α=0.05水平下, 圖3(b)和(d)中兩條擬合曲線的總體方差與檢驗方差并沒有存在較為明顯的差異。t檢驗表明, 在α=0.05水平下, 圖3(a)、 (b)、 (c)中兩條擬合曲線的斜率均具有較為明顯的差異。 即相隔30 d之后, 參考峰以 1 041、 1 083和1 267 cm-1處的拉曼信號為基準的擬合標(biāo)準曲線斜率或方差比率發(fā)生了變化, 而參考峰以1 446 cm-1處拉曼信號為基準的擬合標(biāo)準曲線基本沒有顯著性變化。 說明在實際應(yīng)用中, 參考峰以1 446 cm-1處乙醇的拉曼特征峰為基準時具有相比其他本征峰位參考峰更好的時間穩(wěn)定性, 在30 d內(nèi)進行二次復(fù)測試也無需進行標(biāo)準曲線的再次測量與繪制, 避免了重復(fù)定量分析實驗與后期數(shù)據(jù)處理過程對時間的消耗。 因此, 在對乙醇溶液采用本征峰位比值法進行定量分析時, 可以選擇1 446 cm-1處的拉曼信號作為參考峰。

圖3 不同參考峰對應(yīng)標(biāo)準曲線的時間穩(wěn)定性(a): 1 041 cm-1; (b): 1 083 cm-1; (c): 1 267 cm-1; (d): 1 446 cm-1Fig.3 Time stability of standard curves corresponding to different reference peaks(a): 1 041 cm-1; (b): 1 083 cm-1; (c): 1 267 cm-1; (d): 1 446 cm-1

2.2 四氯化碳內(nèi)標(biāo)法標(biāo)準曲線的建立

在無水乙醇中加入四氯化碳得到混合溶液, 對混合溶液進行測試, 得到的拉曼光譜信號如圖4中曲線(a)所示, 用S-G濾波擬合法對曲線(a)進行2階多項式平滑處理, 處理后的光譜圖如圖4中曲線(b)所示。 四氯化碳有多個拉曼特征峰, 由圖4可以看出, 在446 cm-1處有較高的絕對峰強, 這是由A1非簡并態(tài)振動引起的, 其余峰位振動模式見表2。 選定874 cm-1處的拉曼信號作為乙醇定量分析的定量峰; 進行內(nèi)標(biāo)峰的選擇時需要滿足以下特定條件: 內(nèi)標(biāo)峰和定量峰(874 cm-1)不能峰位距離太遠, 譜峰主要區(qū)域不能大范圍重疊, 各譜峰的最大峰強之間也不能差距過大, 以及譜峰不能失真、 形狀要尖銳等。 CCl4特征峰位與乙醇特征峰位不重合, 且CCl4不影響乙醇主要譜峰的位置及強度, 故可以利用其拉曼特征峰作為乙醇定量分析內(nèi)標(biāo)峰。 因此初步選擇四氯化碳特征峰位207、 306、 446 cm-1三個峰作為內(nèi)標(biāo)峰。

表2 四氯化碳分子振動模式及拉曼峰位移Table 2 Vibration modes and Raman peak shifts of carbon tetrachloride molecules

圖4 無水乙醇與CCl4混合溶液拉曼光譜Fig.4 Raman spectra of anhydrous ethanol mixed with CCl4

分別以三個內(nèi)標(biāo)峰作為參考, 對不同濃度的乙醇與0.3 mL四氯化碳混合溶液進行測定。 將乙醇874 cm-1處拉曼特征峰強度與其他特征峰強度進行對比, 得到兩個峰的相對強度, 并對其進行歸一化, 為直觀顯示擬合曲線, 對446 cm-1峰位數(shù)據(jù)作等比例放大20%處理。 將歸一化后的峰強作為縱坐標(biāo)、 混合溶液中乙醇的濃度作為橫坐標(biāo), 對上述不同濃度的數(shù)據(jù)進行線性擬合。 以上選取的三組內(nèi)標(biāo)峰所對應(yīng)的擬合標(biāo)準曲線如圖5所示, 拉曼信號的相對強度與混合溶液中乙醇的濃度之間存在較為良好的線性關(guān)系, 標(biāo)準曲線的擬合系數(shù)R2分別為0.998、 0.998、 0.999, 與實驗一中乙醇峰位比值法歸一化相比線性度略有上升, 分析認為在對乙醇進行攝譜的過程中, 不同濃度的樣品所對應(yīng)的散射指數(shù)也不相同, 另外溶液中背景噪聲、 儀器及光源功率穩(wěn)定性以及樣品自吸收等因素都會對拉曼光譜帶來影響, 這一部分因素的影響可以通過在待測樣品中加入適當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)物來消除或抵消[14]。

圖5 不同內(nèi)標(biāo)峰相對強度與乙醇濃度線性擬合曲線Fig.5 Linear fitting curves of relative intensities of different internal standard peaks with ethanol concentration

分別以三個內(nèi)標(biāo)峰作為參考, 對比擬合標(biāo)準曲線的斜率及方差等參數(shù)隨時間的變化率, 對其進行t檢驗。 CCl4同樣為易揮發(fā)溶液, 在實驗中采用避光環(huán)境, 保持兩次實驗環(huán)境溫度一致, 同時對CCl4做嚴格密封處理, 最大限度降低外界因素對實驗結(jié)果的影響。 距第一次實驗測量30 d時, 再次重復(fù)進行實驗, 分別采集對應(yīng)不同濃度的乙醇溶液與CCl4混合溶液的拉曼光譜, 并采用上述207 cm-1等三個內(nèi)標(biāo)峰的測量結(jié)果重新繪制對應(yīng)峰位的擬合標(biāo)準曲線。 兩條曲線的對比關(guān)系如圖6所示。 對不同內(nèi)標(biāo)峰的各組數(shù)據(jù)做F檢驗, 顯著性水平(α)取0.05,F檢驗表明, 在α=0.05水平下, 圖6(a)和(b)中兩條擬合曲線的總體方差與檢驗方差均存在較為明顯的差異。t檢驗表明, 在α=0.05水平下, 圖6(a)、 (b)中兩條擬合曲線的斜率均具有較為明顯的差異。 即相隔30 d之后, 內(nèi)標(biāo)峰以207和306 cm-1處的拉曼信號為基準的擬合標(biāo)準曲線斜率或方差比率發(fā)生了變化, 而內(nèi)標(biāo)峰以446 cm-1處拉曼信號為基準的擬合標(biāo)準曲線基本沒有顯著性變化[如圖6(c)所示], 從分子的振動模式考慮, 主要是因為該模式下4個Cl原子沿各自與C原子的連線在同軸方向同時做向內(nèi)或向外的運動, 振動強度和穩(wěn)定性更好。 說明在實際應(yīng)用中, 內(nèi)標(biāo)峰以446 cm-1處CCl4的拉曼特征峰為基準時具有相比其他內(nèi)標(biāo)峰更好的時間穩(wěn)定性, 且相比實驗一峰位比值法1 446 cm-1處特征峰具有更高的擬合精確度與穩(wěn)定性, 在30 d內(nèi)進行二次復(fù)測時也無需進行標(biāo)準曲線的再次測量與繪制, 避免了重復(fù)定量分析實驗與后期數(shù)據(jù)處理過程對時間的消耗。 在對乙醇溶液采用基于CCl4內(nèi)標(biāo)法特征峰位進行定量分析時, 可以選擇446 cm-1處的拉曼信號作為內(nèi)標(biāo)峰。

圖6 不同內(nèi)標(biāo)峰對應(yīng)標(biāo)準曲線的時間穩(wěn)定性(a): 207 cm-1; (b): 306 cm-1; (c): 446 cm-1Fig.6 Time stability of standard curves corresponding to different internal standard peaks(a): 207 cm-1; (b): 306 cm-1; (c): 446 cm-1

3 結(jié) 論

采用激光拉曼光譜系統(tǒng), 分別使用乙醇峰位比值法和CCl4內(nèi)標(biāo)法對乙醇拉曼光譜特征峰(C-C-O對稱伸縮, 874 cm-1)進行標(biāo)定, 測定了不同濃度的乙醇溶液拉曼光譜, 采用乙醇本征峰位和CCl4特征峰得到定量峰與多個參考峰及內(nèi)標(biāo)峰的相對強度比值變化關(guān)系。 通過歸一化方法進行數(shù)據(jù)處理, 分別建立了線性回歸方程。F檢驗與t檢驗表明, 使用乙醇峰位比值法進行標(biāo)定時, 參考峰以1 446 cm-1(CH3-不對稱變形)處拉曼信號為基準的擬合標(biāo)準曲線具有相比其他本征峰位參考峰更好的時間穩(wěn)定性, 同時在30 d內(nèi)進行二次復(fù)測時也無需進行標(biāo)準曲線的再次測量與繪制; 使用CCl4內(nèi)標(biāo)法進行標(biāo)定時, 內(nèi)標(biāo)峰以CCl4拉曼特征峰(A1非簡并態(tài), 446 cm-1)為基準時的擬合標(biāo)準曲線具有相比其他內(nèi)標(biāo)峰更好的時間穩(wěn)定性及更高的準確度。 除了可對乙醇溶液進行定量測試外, 采用該系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理方法也可對其他類型的溶液(如乙酸、 甲醇、 葡萄糖發(fā)酵液等)進行高精度的簡單快速實時檢測, 具有一定的應(yīng)用價值和意義。