易敏娜, 曹匯敏*, 黎雙娜絲, 張朱珊瑩, 朱春楠

1. 中南民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院, 湖北 武漢 430074 2. 中南民族大學(xué)認(rèn)知科學(xué)國家民委重點實驗室, 湖北 武漢 430074 3. 中南民族大學(xué)醫(yī)學(xué)信息分析及腫瘤診療湖北省重點實驗室, 湖北 武漢 430074

引 言

鉛是環(huán)境和生物系統(tǒng)中廣泛分布的最常見、 最有害、 最具毒性的重金屬之一, 可能存在于含鉛質(zhì)的粉類化妝品、 錫器劣質(zhì)陶器的釉質(zhì)或琺瑯、 涂料油漆中。 重金屬鉛在生物體內(nèi)難以被降解, Pb2+通常吸附在顆粒物上, 被舔食或吸入后會在人體器官中長期積累造成慢性中毒, 進(jìn)而導(dǎo)致人體神經(jīng)、 免疫、 心血管等多種系統(tǒng)功能被損壞。 世界衛(wèi)生組織和國際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將鉛列為致癌物[1], 血鉛水平是判定鉛中毒的主要手段, 含量大于等于0.1 mg·L-1即被判定為鉛中毒。 由于Pb2+的生物毒性和累積性對人體的危害巨大, 因此研究和開發(fā)具有選擇性和敏感性的探針和方案至關(guān)重要[2]。 傳統(tǒng)的鉛離子檢測方法有電化學(xué)檢測法[3-5]、 電感耦合等離子體質(zhì)譜法[6]等, 這些方法雖然已被廣泛使用于鉛的檢測, 但制樣難度大, 并且還需要專業(yè)的技術(shù)和精密儀器支持。 在眾多檢測方法中熒光傳感法[7]的檢測周期短、 操作步驟簡單、 靈敏度高[8], 是一種高效的鉛離子檢測方法。

近年來, 熒光探針憑借其穩(wěn)定性和高靈敏度受到更多關(guān)注, 許多新型熒光材料已被開發(fā), 如有機(jī)染料、 量子點、 金納米團(tuán)簇等都已用于檢測金屬離子、 農(nóng)藥殘留、 氣體含量、 化學(xué)藥劑、 生物分子等多種領(lǐng)域。 Zhang等合成了用于酸性化合物中Pb2+的納米活性吸附劑[9]; Sahu等合成摻雜硼的藍(lán)綠色碳點, 研究了在生理pH下性能穩(wěn)定的納米傳感探針[10]; Wang等合成了用于檢測水和活細(xì)胞中Pb2+含量的銀納米團(tuán)簇[11]等。 量子點一般具有毒性, 對環(huán)境危害大, 為了提高量子點的穩(wěn)定性和生物相容性等特性, 制備過程中需要用某些金屬加以修飾, 這導(dǎo)致成本升高、 合成步驟繁瑣等問題。 碳量子點(CQDs) 也稱為碳點或碳納米點, 它具有許多傳統(tǒng)的量子點不具備的優(yōu)點, 其光致發(fā)光特性在檢測有害物質(zhì)方面效果顯著, 是一種成本低、 易于合成、 安全無毒的綠色納米材料, 并且具有較高的穩(wěn)定性[12]、 良好的水溶性[13]、 生物相容性[14]等優(yōu)勢。

目前, 很多熒光探針還局限于單發(fā)射熒光響應(yīng)來進(jìn)行檢測, 這種方法容易在檢測過程中受到外界因素的干擾從而影響其檢測的準(zhǔn)確性。 相比于單發(fā)射量子點, 同一激發(fā)下具有兩種發(fā)射峰的雙發(fā)射熒光材料, 能夠與自身對比參照進(jìn)行標(biāo)定, 通過其熒光強(qiáng)度變化的比值來表達(dá)被測信息, 具有更好的靈敏度和穩(wěn)定性, 能有效避免外界無關(guān)因素的干擾和探針本征的熒光缺陷, 提高檢測效果、 靈敏度和穩(wěn)定性。 Mehta等結(jié)合苯并噻唑聚氰乙烯基熒光團(tuán)合成了一種比例熒光肽探針[15], 但其檢測耗時較長, 完成檢測最快需要6 min; Gao等采用水熱法合成了雙發(fā)射碳量子點, 用于噴墨和檢測Fe3+[16]; 石吉勇等提出基于碳點和銅納米團(tuán)簇的比率型熒光探針, 用于檢測螃蟹中Hg2+含量[17]; Shu等以二維鎳基金屬有機(jī)骨架納米片為基體制成可視化即時檢測生物分子硫醇的雙發(fā)射比率探針[18], 許多研究者們都在對雙發(fā)射比率熒光探針進(jìn)行各種研究和嘗試, 但就制備成本、 工序難易程度等方面還存在許多可以優(yōu)化的地方, 從檢測耗時方面來看, 許多比率探針目前還無法做到對被測物質(zhì)的快速響應(yīng)。

基于上述考慮, 本研究分別以檸檬酸鈉和對苯二胺(p-PD)為碳源, 采用水相法合成藍(lán)紅兩種碳點, BCDs作為響應(yīng)信號與Pb2+反應(yīng)導(dǎo)致熒光強(qiáng)度減弱, RCDs對Pb2+的化學(xué)惰性在整個檢測系統(tǒng)中用于背景參考, 將兩種碳點按照一定熒光強(qiáng)度比混合, 二者因其物理、 化學(xué)性質(zhì)的改變從而引起光譜的顯著變化[19]。 當(dāng)Pb2+存在時探針在短短幾秒作出響應(yīng), 視覺上表現(xiàn)出由藍(lán)到紅的熒光顏色變化, 能夠直觀地反映被測物濃度的含量。 作為Pb2+的選擇性檢測探針, 通過透射電子顯微鏡 (TEM) 、 熒光光譜和紫外可見吸收光譜等手段進(jìn)行表征和檢測, 依據(jù)粒子大小、 形貌特征、 吸收強(qiáng)度、 熒光光強(qiáng)、 熒光猝滅等信息對Pb2+的響應(yīng)機(jī)理、 特異性選擇、 pH環(huán)境的影響和熒光穩(wěn)定性能等各種基本性質(zhì)進(jìn)行了比色研究, 以證明該比率熒光探針的可行性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

二水檸檬酸鈉(C6H5Na3O7·2H2O) 分析純(AR, 99.0%)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司、 氯化銨(NH4Cl)分析純(AR, 99.5%)購自成都市科隆化學(xué)品有限公司、 對苯二胺(p-PD)購自上海麥克林生化科技股份有限公司、 氫氧化鈉(NaOH)、 鹽酸(HCl), Pb2+標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 μg·mL-1)購自山東省冶金科學(xué)研究院有限公司, Zn2+、 Fe3+、 K+、 Mn2+、 Na+、 Al3+、 Mg2+、 Hg2+、 Ca2+、 Cu2+的標(biāo)準(zhǔn)液(100 μg·mL-1) 均購自北京有色金屬研究總院, 本實驗中使用的所有試劑均為分析級, 無需進(jìn)一步純化。 在整個制備過程中使用了純水。

美國Thermo Fishre公司Thermo Scientific Talos F200X透射電子顯微鏡, 美國PerkinElmer 公司LS-55熒光分光光度計, 島津UV-3600iPlus紫外可見分光光度計, 上海耀特儀器設(shè)備有限公司DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器, 上海精密科學(xué)儀器有限公司FA2204B電子天平, 梅特勒托利多FE28pH計, 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司TG16-WS醫(yī)用離心機(jī), 武漢品冠儀器設(shè)備有限公司PGUV-10-AS超純水機(jī), 南京先歐儀器制造有限公司XO-5200DT超聲波清洗機(jī)。

1.2 藍(lán)紅碳點的制備

藍(lán)色碳點 (BCDs) 制備方法參照李文婷等聚四氟乙烯反應(yīng)釜水熱合成方法[20]加以改進(jìn)。 稱取0.4 g檸檬酸鈉和2.12 g氯化銨于50 mL三頸燒瓶中, 加入20 mL純水進(jìn)行攪拌, 通入氬氣后將溫度逐步加熱至100 ℃, 控制溫度不變持續(xù)回流6 h。 將所得的淡黃色溶液BCDs冷卻至室溫后保存在4 ℃條件下以備后續(xù)使用。

紅色碳點 (RCDs) 的制備方法如下。 稱取0.216 g對苯二胺, 溶于20 mL純水中, 倒入50 mL三頸燒瓶中磁力攪拌, 溫度逐步加熱至100 ℃并回流保持5 h, 待溶液冷卻至室溫后, 將得到的產(chǎn)物在10 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心10 min以去除不溶性雜質(zhì), 保留上清液, 用純水分散備用。

1.3 鉛離子熒光檢測

將制備的BCDs與RCDs以合適的體積比混合, 制成熒光強(qiáng)度比約2.3∶1的雙發(fā)射比率探針溶液。 控制溶液總量不變, 分別取980 μL比率探針溶液與20 μL濃度0～0.5 mg·L-1的Pb2+溶液超聲混合均勻, 確保在1 min內(nèi)掃描溶液熒光發(fā)射光譜, 設(shè)置掃描范圍380～800 nm, 激發(fā)波長為360 nm。 通過計算藍(lán)紅碳點熒光強(qiáng)度比值來定量分析與Pb2+濃度的關(guān)系, 肉眼觀察并記錄其熒光顏色的變化。

1.4 選擇性實驗

將選取的十種常見的干擾離子Zn2+、 Fe3+、 K+、 Mn2+、 Na+、 Al3+、 Mg2+、 Hg2+、 Ca2+、 Cu2+以Pb2+濃度的兩倍, 即濃度為1 mg·L-1的干擾離子分別加入比率熒光探針溶液中, 記錄其熒光響應(yīng), 以離子的熒光強(qiáng)度比值為縱坐標(biāo)考察該探針對鉛離子的選擇性。

1.5 穩(wěn)定性實驗

對比率探針溶液在0.25、 0.5、 0.75、 1、 1.5、 2、 2.5、 3、 4、 5和6 h時間內(nèi)進(jìn)行熒光發(fā)射譜掃描, 記錄其熒光響應(yīng), 同上述方法, 分析孵育時間對比率探針熒光強(qiáng)度的影響。

用NaOH和HCl調(diào)節(jié)去離子水的pH值, 配制Pb2+濃度為0.1 mg·L-1的溶液, 將含Pb2+的比率探針溶液分散在等量的pH值為1～14的溶液中, 記錄其熒光強(qiáng)度隨pH值的變化趨勢, 通過熒光強(qiáng)度比考察pH值對比率探針熒光性能的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 CDs及比率探針的表征

采用TEM對CDs的尺寸、 形貌等性質(zhì)進(jìn)行表征。 圖1(a)表明制備的BCDs與RCDs納米粒子分布均勻, 具有良好的單分散性。 BCDs顆粒呈球形, 平均直徑小于10 nm, 在高分辨率透射電子顯微鏡(HRTEM)下呈晶格條紋狀[圖1(a)插圖]。 當(dāng)Pb2+與BCDs-RCDs共存的情況下, 圖1(b) TEM結(jié)果表明, BCDs表面官能團(tuán)與Pb2+之間的螯合和靜電相互作用[21]導(dǎo)致納米粒子聚集形成團(tuán)簇, RCDs保持穩(wěn)定不參與反應(yīng), 這一現(xiàn)象印證了藍(lán)色熒光猝滅的原因, 圖1(b)插圖為HRTEM圖像, 清晰地顯示了BCDs的與Pb2+聚集形態(tài)。

圖1 (a) BCDs和RCDs的TEM圖像, 插圖為BCDs的HRTEM圖像; (b) BCDs-RCDs與Pb2+的TEM圖像, 插圖為BCDs與Pb2+聚集后的HRTEM圖像Fig.1 (a) TEM images of BCDs and RCDs, Inset is the HRTEM image of BCDs; (b) TEM images of BCDs-RCDs and Pb2+, Inset is the HRTEM image after BCDs and Pb2+ aggregated

采用熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜分別對BCDs、 RCDs和雙發(fā)射比率探針的光學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征。 圖2(a)所示, 發(fā)射波長為440 nm時, BCDs的激發(fā)光譜在251和353.5 nm出現(xiàn)兩個激發(fā)峰; 發(fā)射波長為700 nm時, RCDs激發(fā)光譜激發(fā)峰在300和360.5 nm附近。 為保證兩者同時被激發(fā), 選取360 nm作為激發(fā)波長, 圖2(b)黑色曲線所示, 比率探針在440和712 nm出現(xiàn)兩個發(fā)射峰熒光信號, 且峰寬較窄。 在365 nm手持紫光燈照射下肉眼可見明亮的藍(lán)色熒光和紅色熒光[圖2(b)插圖]。 兩者混合后可能由于BCDs與RCDs發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)[20], 導(dǎo)致BCDs的熒光略有降低。

圖2 (a) BCDs與RCDs歸一化的激發(fā)光譜圖; (b) BCDs、 RCDs及混合溶液的熒光發(fā)射光譜(λex=360 nm)Fig.2 (a) Excitation spectra normalized by BCDs and RCDs; (b) Fluorescence emission spectra of BCDs, RCDs and mixed solutions (λex=360 nm)

2.2 鉛離子的響應(yīng)機(jī)理

整個鉛離子的傳感檢測體系中BCDs發(fā)揮主要作用, RCDs不參與反應(yīng), 只有BCDs顆粒表面的官能團(tuán)與Pb2+的螯合作用導(dǎo)致納米粒子相互之間吸附聚集, 從而發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象導(dǎo)致熒光顏色發(fā)生變化, 示意圖如圖3所示。

圖3 比率熒光探針Pb2+檢測示意圖Fig.3 Schematic diagram of ratio fluorescent probe Pb2+ detection

以目前醫(yī)學(xué)應(yīng)用的Pb2+含量范圍為標(biāo)準(zhǔn)分別考察了0～0.50 mg·L-1Pb2+濃度下單個碳點與比率探針對鉛離子的響應(yīng)。 圖4中Pb2+在342 nm處存在吸收峰, 與BCDs的峰值所在的位置接近, BCDs的激發(fā)光譜和Pb2+的紫外吸收光譜形狀相似, 表明該碳點能夠用于檢測Pb2+。

圖4 BCDs的激發(fā)光譜和Pb2+的紫外吸收光譜Fig.4 Excitation spectra of BCDs and UV absorption spectra of Pb2+

RCDs與Pb2+混合時不發(fā)生反應(yīng), 如圖5(a)所示, 712 nm處發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度在0～0.50 mg·L-1濃度的Pb2+存在時幾乎保持不變, 因此可以證實RCDs對Pb2+無響應(yīng)。 BCDs表面的-COOH能夠與Pb2+形成螯合產(chǎn)物, -NH2與Pb2+發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)使得藍(lán)色熒光顆粒產(chǎn)生聚集現(xiàn)象, 基于內(nèi)濾波效應(yīng)導(dǎo)致熒光猝滅[22], TEM圖1(b)也能證明這一現(xiàn)象。 圖5(b)體現(xiàn)了隨著Pb2+濃度的提高, 440 nm處的發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度逐漸減弱, 插圖為365 nm紫光燈照射下的熒光變化情況。

圖5 (a) RCDs的熒光發(fā)射光譜; (b) BCDs的熒光發(fā)射光譜Fig.5 (a) Fluorescence emission spectra of RCDs; (b) Fluorescence emission spectra of BCDs

根據(jù)藍(lán)紅碳點的不同體積配比設(shè)置熒光強(qiáng)度比I440/I712分別為1.3∶1、 1.8∶1和2.3∶1時測試不同濃度下對Pb2+的熒光響應(yīng), 確定兩種碳點的發(fā)射峰比值為2.3∶1時從藍(lán)色到紫紅色的熒光顏色變化范圍最寬。 將藍(lán)紅碳點基于最佳熒光強(qiáng)度2.3: 1均勻混合成比率熒光探針溶液, 通過熒光強(qiáng)度和顏色的變化來實現(xiàn)鉛離子含量的判定。 如圖6(a)為0～0.50 mg·L-1濃度的Pb2+比率熒光探針的發(fā)射光譜, 插圖為溶液由藍(lán)色到紅色的變化情況。 比率探針在440 nm處的熒光強(qiáng)度隨Pb2+的濃度增加呈規(guī)律性遞減趨勢, 而712 nm處的熒光強(qiáng)度不受其濃度影響。 為明確比率探針熒光強(qiáng)度與Pb2+濃度的關(guān)系, 繪制440和712 nm處的峰值比值I440/I712與Pb2+濃度的關(guān)系圖來評估Pb2+含量[21]。 如圖6(b)所示, 二者線性關(guān)系良好,R2=0.987 44, 基于三倍標(biāo)準(zhǔn)差規(guī)則, LOD=3σ/s, 其中σ為空白探針樣品測量的標(biāo)準(zhǔn)差,s為線性擬合曲線的斜率, Pb2+的檢出限為0.013 6 mg·L-1。 以上數(shù)據(jù)均由三組實驗所得。

圖6 (a) 比率熒光探針與Pb2+混合后的發(fā)射光譜; (b) I440/I712比值與Pb2+濃度的線性關(guān)系Fig.6 (a) Emission spectra of ratio fluorescent probe mixed with Pb2+; (b) Linear relationship between I440/I712 ratio and Pb2+ concentration

2.3 比率熒光探針的選擇性

選擇性是對熒光探針性能評估的一個很關(guān)鍵的指標(biāo), 選取了十種生活中常見的金屬陽離子Zn2+、 Fe3+、 K+、 Mn2+、 Na+、 Al3+、 Mg2+、 Hg2+、 Ca2+、 Cu2+作為干擾離子分別加入比率探針溶液中, 除Cu2+外未觀察到干擾離子熒光比值(I440/I712)/(I440/I712)0的明顯變化(圖7) , 其中(I440/I712)0為無任何離子存在時的熒光強(qiáng)度比。 由于RCDs的碳源p-PD中氮原子的孤對電子與Cu2+的空軌道能形成絡(luò)合物會使得712 nm處的熒光強(qiáng)度增大, 但在整個體系中RCDs含量極少且BCDs對Cu2+具有惰性, 對整個檢測系統(tǒng)的影響微乎其微, 因此在365 nm激發(fā)下仍然表現(xiàn)出強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光。 干擾離子對藍(lán)色熒光幾乎沒有猝滅作用, 實驗表明比率探針對Pb2+有良好的選擇性。

圖7 比率熒光探針對其他金屬離子的選擇性Fig.7 Selectivity of the ratio fluorescent probe to other metal ions

2.4 比率熒光探針的穩(wěn)定性

以孵育時間和pH環(huán)境為變量, 利用熒光光譜法系統(tǒng)研究了比率熒光探針的穩(wěn)定性。 圖8(a)為室溫下相對熒光強(qiáng)度隨時間的變化情況, 探針的相對熒光強(qiáng)度在6 h內(nèi)變化微小, 表明光學(xué)穩(wěn)定性良好。 不同pH環(huán)境下比率探針的熒光變化情況如圖8(b)所示, 在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿環(huán)境下探針的熒光強(qiáng)度有很大的變化, 在pH<3的強(qiáng)酸環(huán)境下, 由于BCDs表面-COOH和-NH2與H+結(jié)合去質(zhì)子化, 削弱了Pb2+的螯合作用, 導(dǎo)致BCDs失去穩(wěn)定性, 使得藍(lán)色熒光減弱[23]。 在pH值為12、 13的堿性條件下, Pb2+與高濃度的OH-結(jié)合形成沉淀從而減弱Pb2+對BCDs的猝滅反應(yīng)程度, 因此熒光強(qiáng)度驟增。 pH值為14的強(qiáng)堿環(huán)境下, BCDs表面的官能團(tuán)被破壞, 導(dǎo)致熒光減弱[24]。 在pH值為3～11較大的范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度比值波動不大, 實驗結(jié)果表明該探針具有較好的耐鹽性和耐酸性。 綜合上述結(jié)果與討論, 表明該探針的熒光穩(wěn)定性良好。

圖8 (a) 孵育時間對比率探針性能的影響; (b)不同pH對比率探針性能的影響Fig.8 (a) Effect of incubation time on the performance of ratio probes; (b) Effect of different pH on the performance of ratio probe

3 結(jié) 論

采用水相合成法制備了能快速檢測鉛離子的雙發(fā)射可視化比率熒光探針, TEM圖顯示探針尺寸小、 粒徑均勻, 該探針無需任何修飾, 成本低、 檢測方法簡便。 結(jié)果表明BCDs-RCDs具有斯托克斯位移大、 光穩(wěn)定性好、 發(fā)射帶譜窄的優(yōu)點。 基于熒光猝滅的原理, 雙發(fā)射比率熒光探針通過熒光顏色的變化實現(xiàn)Pb2+的可視化檢測, 兩種熒光團(tuán)之間的熒光強(qiáng)度比與Pb2+濃度具有良好的線性關(guān)系, 檢出限低至0.013 6 mg·L-1。 該比率探針無需長時間孵育便能快速對Pb2+做出反應(yīng), 在較大pH范圍和時間范圍內(nèi)探針的靈敏度和穩(wěn)定性良好, 檢測濃度也符合醫(yī)學(xué)應(yīng)用所需范圍, 在不同生理條件下有較好的生物傳感應(yīng)用潛力, 在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景, 也為臨床醫(yī)學(xué)的即時檢測提供了新的思路。