白雪冰, 宋昌澤, 張倩瑋, 代斌秀, 靳國杰, 劉文政, 陶永勝*

1. 西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院, 陜西 楊凌 712100 2. 西北農(nóng)林科技大學寧夏賀蘭山東麓葡萄酒試驗示范站, 寧夏 永寧 750104

引 言

“赤霞珠(CabernetSauvignon, Vitis Vinifera L.)”是我國種植面積最廣的釀酒葡萄品種, 廣泛分布于新疆、 寧夏、 云南、 山西和河北等地[1]。 磷是“赤霞珠”生長發(fā)育的必需營養(yǎng)元素之一, 參與了生物膜與核酸的合成、 新陳代謝、 酶的活性調(diào)節(jié)等重要生物過程。 根據(jù)產(chǎn)量不同, 每公頃成年葡萄樹每年消耗的磷元素為5～15 kg[2]。 缺磷會抑制“赤霞珠”的花粉受精作用[3], 增加胚退化的風險[4], 減低葡萄樹的抗逆性。 缺磷病的診斷一直以來都是葡萄病害防治的重點, 傳統(tǒng)分析方法(如磷釩鉬黃比色法[5])的破壞性極強, 實時性差, 進而導致錯過低磷治理的最佳時效期; 即時檢測法[6]的成本高且伴隨轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境釋放問題, 并不符合可持續(xù)發(fā)展的理念。 開發(fā)葡萄葉片缺磷脅迫的低成本、 實時、 無損檢測方法, 對“赤霞珠”葉片缺磷病的防治, 提高葡萄園經(jīng)濟效益具有重要意義。 可見光/近紅外(VIS/NIR)光譜分析技術具有原位無損、 高通量快速、 實時在線等特點[7], 可通過電子躍遷記錄葡萄葉片中的磷含量信息, 基于化學計量學方法可精準診斷葡萄葉片缺磷脅迫情況。 葡萄葉重金屬元素的光譜映射波段已有廣泛研究。 Mirzaei等[8]和Roviello等[9]采用全波段原位光譜(350～2 500 nm)分析“Askari”和“Vivarais”葡萄葉片的重金屬含量, 研究發(fā)現(xiàn)Cu的特征波段為2 431、 809、 489和616 nm; Zn的特征波段為2 032、 883、 665、 564、 688和437 nm; Pb的特征波段為1 865、 728、 692、 683和356 nm; Cr的特征波段為863、 2 044、 415、 652、 713和1 036 nm; Cd的特征波段為1 373、 631、 744和438 nm, 構建了葡萄葉重金屬含量實時監(jiān)測系統(tǒng), 實現(xiàn)對葡萄園重金屬脅迫的風險把控。 光譜分析技術在葡萄葉病蟲害的快速診斷中的應用較為成熟。 Pithan等[10]以“赤霞珠”葡萄葉為研究對象, 通過對比葉片患霜霉病前后的光譜反射率確定了8個特征波段(443、 496、 516、 573、 695、 1 420、 1 900和2 435 nm), 分析發(fā)現(xiàn)這些波段主要分布于葉綠素和水分的響應區(qū)間, 進一步推斷霜霉病會降低葡萄葉的葉綠素和水分代謝。 Junges等[11]分析了“梅洛”葡萄卷葉病(GLRaV)在VIS/NIR光譜波長范圍的響應關系, 探明綠峰(520～550 nm)、 葉綠素吸收峰(650～670 nm)、 紅邊(700～720 nm)和近紅外初始波段(800～900 nm)為GLRaV的有效表征區(qū)間, 建立了GLRaV的實時診斷方法。 Yang等[12]以葡萄葉的VIS/NIR光譜信息為輸入量, 基于輕量級人工神經(jīng)網(wǎng)絡ShuffleNet V2開發(fā)了葡萄葉炭疽病、 霜霉病、 扇葉病、 葉蟬和螨蟲等多種病蟲害的實時診斷系統(tǒng), 增強葡萄園病蟲害防止的科學與實時性。 目前, 葡萄葉缺素癥的光譜實時診斷研究也成為重點研究之一。 Rustioni等[13]基于葡萄葉片缺鐵會葉綠素含量降低的生理特點, 通過分析341～1 025 nm范圍內(nèi)的450個反射信息確立了以葉綠素特征(495～678 nm)為主要依據(jù)的葉片缺鐵診斷模型, 該方法適用于多個品種的葡萄葉片分析。 Rustioni等[14]使用Jaz系統(tǒng)光譜儀采集了多品種葡萄葉片在341～1 025 nm范圍內(nèi)的反射率信息, 分別繪制了葡萄葉片缺氮和鉀的光譜指紋圖譜, 為葡萄園微量元素營養(yǎng)管理提供依據(jù)。 Cuq等[15]通過“長相思”葡萄葉908～1 676 nm的光譜信息追溯含碳、 氫、 氮、 硫等官能團的物質(zhì)含量變化, 進而檢測葡萄葉的氮素利用率及氮素營養(yǎng)狀況, 為氮肥施用提供決策信息。 在Cuq等[16]進一步的研究中, 基于908～1 676 nm的光譜反射率構建了葡萄葉鉀、 鈣和鎂等多種元素的原子質(zhì)量預測模型, 用于檢測葡萄的營養(yǎng)健康監(jiān)測和缺素癥防治。 上述研究結論佐證了采用光譜分析技術實時診斷葡萄葉重金屬、 病蟲害和缺素脅迫具有一定的可行性, 但有關葡萄葉缺磷脅迫的光譜快速無損診斷研究甚少, 尚未實現(xiàn)對低磷癥狀的準確識別。 本研究以釀酒葡萄“赤霞珠”葉片為研究對象, 分別采集了正常、 缺磷脅迫初期和末期葡萄葉的VIS/NIR反射率信息, 通過化學計量學方法篩選磷素的光譜表征波段, 構建“赤霞珠”葉片缺磷脅迫的快速無損診斷方法, 為葡萄園病害防治與管理提供理論參考和技術依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

試驗于2021年7月至8月在西北農(nóng)林科技大學曹新莊試驗農(nóng)場(108.07°E, 34.28°N)進行, 平均海拔530 m, 試驗期間平均氣溫為21～29 ℃, 平均降雨量123.73 mm。 選取東西向四行“赤霞珠”品種釀酒葡萄為研究對象, 每行40株(株距1 m), 通過實驗誘發(fā)西側(cè)植株受缺磷脅迫。

實驗分別采用數(shù)碼相機(EOS 800D, 佳能(中國)有限公司, 中國)和200～1 100 nm微型光纖光譜儀[ATP3030, 奧譜天成(廈門)光電有限公司, 中國]實時采集“赤霞珠”葡萄葉片460片。 參考張敏等[17]研究方法, 通過閾值分割算法將樣本劃分為健康葉片、 缺磷脅迫初期、 末期, 缺磷像素g(x,y)計算公式如式(1)

(1)

式(1)中,f(x,y)為葡萄葉片圖像的灰度值,T為缺磷像素點的判別閾值。 若缺磷像素點占總像素點的0～20%, 則判定為缺磷脅迫初期; 若缺磷像素點大于20%, 則判定為缺磷脅迫末期。 最終獲取了健康葉片120個、 缺磷脅迫早期葉片140個、 缺磷脅迫晚期葉片200個。 “赤霞珠”葡萄葉片缺磷脅迫的診斷模型依托于數(shù)學平臺(Matlab R2021b, The MathWorks公司, 美國)進行開發(fā)與測試。

1.2 數(shù)據(jù)分析與處理

由于環(huán)境雜光干擾和葉面散射現(xiàn)象, 田間實時采集的葡萄葉光譜信號包含部分隨機噪聲和散射噪聲, 導致信號出現(xiàn)基線抖動或漂移等干擾。 Savitzky-Golay卷積平滑(S-G Smoothing)和移動平均平滑(MAS)等方法可有效提高光譜信號的平滑, 去除隨機噪聲; 標準正態(tài)變換(SNV)和多元散射校正(MSC)等方法可校正光譜曲線的位置, 去除散射噪聲。 本研究采用上述4種方法及組合方法處理葡萄葉健康時和缺磷脅迫下的光譜信號, 降低信號噪聲對“赤霞珠”葡萄葉缺磷脅迫診斷的干擾。

在葡萄葉光譜信號的田間采集過程中, 人為操作誤差會使數(shù)據(jù)集中個別樣本嚴重偏離真實值, 出現(xiàn)離群點。 本研究采用主成分分析(PCA)計算樣本的特征向量, 分析樣本方差衍變的矢量方向及幅度, 獲取樣本在主成分載荷圖中的聚類, 落在樣本聚類置信空間之外的樣本被判定為離群點。

1.3 缺磷脅迫診斷模型

葡萄葉光譜信號中不僅反映了磷素的相關信息, 也包含了葉綠素、 水分、 其他營養(yǎng)元素等生物信息。 因此, 篩選與缺磷脅迫存在響應關系的特征波段, 可有效降低模型的時間復雜度和空間復雜度。 本研究采用連續(xù)投影法(SPA)篩選葡萄葉光譜信號中缺磷脅迫的特征波段, 具體方法如下:

設樣本量為N, 光譜信號包含M個變量, 由此構成樣本集的光譜矩陣XN×M。xj(XN×M第j個列向量)為初始向量,K為需要提取的變量數(shù)。 分別xj計算對剩余列向量xk(M-1)的投影Pxj, 見式(2)和式(3)

(2)

提取最大投影向量的光譜波段k(m)

k(m)=max(‖Pxj‖)

(3)

最終篩選出葡萄葉缺磷脅迫的特征波段為{k(m);m=1, …,M}。

特征波段的響應位置和程度會受到藍(紅)移和增色(減色)效應的影響, 從而與葡萄葉缺磷脅迫癥狀的對應關系呈較強的非線性。 支持向量機(SVM)可以通過高維映射分析葡萄葉缺磷脅迫與其光譜特征間的非線性映射關系, 進而構建準確穩(wěn)定的診斷模型。 由于SVM的引用核函數(shù)會影響其在高維空間的內(nèi)積運算方式以及對非線性關系的解析方向, 本研究分別構建了SVM在4種不同核函數(shù)驅(qū)動下的葡萄葉缺磷脅迫診斷模型, 核函數(shù)k(x,z)具體形式如下:

① 線性核函數(shù)(Linear)

k(x,z)=xz+c

(4)

式(4)中,x為特征波段向量,z為映射的特征向量,c為常數(shù)項。

② 多項式核函數(shù)(Poly)

k(x,z)=[(ax·z)+c]d

(5)

式(5)中,a為向量系數(shù)。

③ 徑向基核函數(shù)(RBF)

(6)

式(6)中,σ為方差。

④ 二層神經(jīng)網(wǎng)絡核函數(shù)(Sigmoid)

k(x,z)=tanh[b(x·z)-c]

(7)

式(7)中,b為向量系數(shù)。

1.4 模型性能評估標準

為了科學客觀地評估模型的性能, 確定最佳的“赤霞珠”葉片缺磷脅迫診斷方法, 本研究采用信噪比(SNR)篩選最佳的光譜預處理算法, 通過靈敏度(SEN)和準確率(CCR)判別SVM模型診斷葡萄葉缺磷脅迫的有效性。

① SNR可反映光譜信號中的噪聲比例, SNR越大, 說明光譜信號中的噪聲越少, SNR的計算公式如式(8)

(8)

式(8)中,n為樣本個數(shù),j表示第j個樣本;m為光譜信號長度,i表示光譜信號中的第i個波段變量;f表示原始光譜信號,f′表示預處理后的光譜信號。

② SEN和CCR可判別診斷模型的有效性, 計算公式如式(9)

(9)

式(9)中,TP為被正確分類的正例,FN為本來是正例, 錯分為負例,FP為本來是負例, 被錯分為正例。

2 結果與討論

2.1 葡萄葉光譜信息解析

由于鹵素燈光源在200～400 nm范圍不產(chǎn)生能量對扣, 導致光譜信號在此波段范圍存在嚴重波動, 因此本研究選取400～1 030 nm范圍的“赤霞珠”葡萄葉光譜信號為建模研究的自變量。 圖1(a, b, c)所示為“赤霞珠”葡萄葉缺磷脅迫早期、 末期典型癥狀及其光譜信號。 400～700 nm范圍內(nèi)正常葉片和缺磷脅迫葉片的光譜信號重合率較高。 正常葉片在550 nm處有明顯的反射峰, 此為葉綠素的綠色強反射峰區(qū); 而在600～700 nm范圍內(nèi)反射率較低, 在670 nm左右出現(xiàn)的反射谷有“紅谷”之稱。 缺磷脅迫的葉片在550 nm處沒有強反射峰, 但在640 nm處出現(xiàn)明顯的反射峰, 這一波段是紅光的“強活性帶”, 與葉片在缺磷脅迫下產(chǎn)生紅褐色病斑的癥狀相符。 700～750 nm波段范圍稱為“植被反射率紅邊”, 反映了水分、 營養(yǎng)、 葉片面積等特征; 當葉片存在營養(yǎng)不良或病蟲害時, 紅邊區(qū)域會趨近短波方向, 這與圖1(c)所示的情況一致。 750～1 030 nm范圍內(nèi)正常葉片和缺磷脅迫葉片的光譜信號差異性較大, 反映了葉片細胞間隙、 層數(shù)及含水率等信息。 葉片在缺磷脅迫下含水率減少, 細胞干癟引起間隙增大, 反射率升高, 與圖1(c)所示結果一致。

圖1 “赤霞珠”葡萄葉缺磷脅迫的典型病狀及光譜信號(a): 缺磷脅迫早期; (b): 缺磷脅迫末期; (c): 不同時期的光譜信號Fig.1 Typical symptoms and spectral signals of “Cabernet Sauvignon” grape leaves under phosphorus deficiency stress(a): Early stage of phosphorus deficiency stress; (b): At the end of phosphorus deficiency stress; (c): Spectral signals in different periods

2.2 異常樣本的剔除

對比S-G Smoothing、 MAS、 SNV和MSC等4種方法及其組合方法抑制“赤霞珠”葡萄葉光譜信號中基線抖動和散射噪聲等干擾的有效性, 結果如圖2所示。 圖2(a)為原始光譜信號, 曲線分散范圍較寬, 呈明顯的毛刺狀。 經(jīng)過S-G Smoothing[圖2(b)]和MAS[圖2(c)]平滑預處理后光譜信號的SNR分別為110.58和101.74, 曲線趨于平滑, 分散范圍不變; 經(jīng)過SNV[圖2(c)]和MSC[圖2(d)]散射校正預處理后光譜信號的SNR分別為40.01和77.00, 曲線的分散范圍被明顯壓縮, 毛刺狀更加嚴重, 缺磷脅迫葉片在550 nm處的反射峰被強化, 正常葉片與缺磷脅迫葉片在750～1 030 nm范圍的反射強度差異被弱化。 經(jīng)過平滑與散射校正的融合算法[圖2(f)-(i)]預處理后光譜信號的SNR分別為37.53、 82.97、 42.76和77.17, 曲線平滑且分散范圍窄, 反射率變化與散射校正的結果相近。 上述研究發(fā)現(xiàn), 基于S-G Smoothing預處理后光譜信號的SNR最高, 以其為校正集構建的缺磷脅迫診斷模型性能較其他預處理結果最佳, 因此確定S-G Smoothing為最佳的預處理方法。

圖2 光譜預處理結果分析(a): 原始光譜信號; (b): 卷積平滑; (c): 移動平均平滑; (d): 標準正態(tài)變換; (e): 多元散射校正; (f): 卷積平滑+標準正態(tài)變換; (g): 卷積平滑+多元散射校正; (h): 移動平均平滑+標準正態(tài)變換; (i): 移動平均平滑+多元散射校正Fig.2 Pretreatment analysis results of spectral(a): Original spectral signal; (b): S-G Smoothing; (c): MAS; (d): SNV; (e): MSC; (f): S-G Smoothing+SNV; (g) S-G Smoothing+MSC; (h): MAS+SNV; (i): MAS+MSC

通過PCA計算樣本光譜信號的各主成分, 并以95%置信空間為依據(jù)判別離群點, 結果如圖3所示。 PCA計算表明, 第一主成分(PC1)對光譜信號的表征率為65.1%, 第二主成分(PC2)對光譜信號的表征率為17.0%, 前兩個主成分的合計表征率高達82.1%, 有效整合了“赤霞珠”葡萄葉片光譜信號的重要信息。 基于PC1和PC2的載荷矩陣分別繪制正常、 缺磷脅迫初期、 末期“赤霞珠”葉片樣本的95%置信空間。 從圖2看可知, 正常葉片中2個樣本分布于95%置信空間外部, 缺磷脅迫初期和末期的葉片中分別有11個和9個樣本分布于95%置信空間外部。 因此, 上述22個樣本被判別為離群點, 不可用于構建“赤霞珠”葡萄葉缺磷脅迫的診斷模型。

圖3 基于PCA的異常樣本剔除Fig.3 Abnormal sample elimination based on PCA

2.3 葡萄葉缺磷脅迫的特征波段

通過SPA篩選“赤霞珠”葡萄葉缺磷脅迫在400～1 030 nm范圍光譜信號的響應波段, 結果如圖4(a, b)所示。 圖4(a)為設定選取變量個數(shù)迭代增長下, 光譜特征對葉片缺磷脅迫表征的均方根誤差(RMSE)。 當選取11個光譜特征變量時, 變量協(xié)同表征葉片缺磷脅迫表征的RMSE最小, 為0.47。 所篩選出的11個光譜特征變量為402.6、 404.6、 409、 411.5、 539.4、 691.9、 729.9、 838.7、 1 011.9、 1 017.5和1 020.5 nm。 其中539.4、 691.9和729.9 nm反映了葉片缺磷時葉綠素的應激變化; 1 011.9、 1 017.5和1 020.5 nm共同反映了磷素的含量變化, Li等[18]將其作為高光譜定量分析植物冠層磷素變化的重要波段。

圖4 基于SPA篩選的“赤霞珠”葡萄葉缺磷脅迫光譜特征(a): 特征變量數(shù)對應的RMSE值; (b): 光譜特征波段Fig.4 Spectral characteristics of Cabernet Sauvignon grapevine leaves under phosphorus deficiency stress based on SPA screening(a): RMSE value corresponding to the number of characteristic variables; (b): Spectral characteristic band

2.4 缺磷脅迫診斷模型的有效性

采用濃度梯度法(CG)將剔除異常值后的438個葉片樣本按照3∶1劃分為328個校正集和110個驗證集。 分別構建以Linear、 Poly、 RBF和Sigmoid為核函數(shù)的“赤霞珠”葡萄葉片缺磷脅迫SVM診斷模型, 模型性能評估如表1所示。

表1 不同核函數(shù)下SVM的最佳模型參數(shù)及缺磷脅迫診斷結果Table 1 Optimal model parameters of SVM under different kernel functions and diagnosis results of phosphorus deficiency stress

取最佳的懲罰因子(C)、 階數(shù)(d)、 系數(shù)(Gamma)時, 以Linear、 Poly和RBF為核函數(shù)構建的SVM模型訓練準確率均達到100%, Linear、 Poly核函數(shù)的SVM模型驗證準確率為97.83%, 優(yōu)于RBF核函數(shù)SVM模型。 對110個預測集葡萄葉樣本的缺磷脅迫診斷表明, Linear核函數(shù)的SVM模型將7個正常葉片誤判為缺磷早期, 對正常葉片診斷的SEN為81.08%, CCR為100%; 對缺磷脅迫早期葉片診斷的SEN為100%, CCR為84.78%; 對缺磷脅迫末期葉片診斷的SEN為100%, CCR為100%。 Poly核函數(shù)的SVM模型將10個正常葉片誤判為缺磷早期, 對正常葉片診斷的SEN為72.97%, CCR為100%; 對缺磷脅迫早期葉片診斷的SEN為100%, CCR為79.59%; 對缺磷脅迫末期葉片診斷的SEN為100%, CCR為100%。 RBF核函數(shù)的SVM模型對正常葉片診斷的SEN為64.86%, CCR為85.71%; 對缺磷脅迫早期葉片診斷的SEN為76.92%, CCR為52.63%; 對缺磷脅迫末期葉片診斷的SEN為58.82%, CCR為80%。 綜上分析, 以Linear為核函數(shù)構建的SVM模型對“赤霞珠”葡萄葉缺磷脅迫的診斷能力最佳。

采用便攜式光柵光譜儀實時采集植物葉片的VIS/NIR光譜, 會受到田間自然光照的影響, 導致光譜信號中產(chǎn)生基線抖動等干擾噪聲。 有研究分析了10種預處理的120種排列組合方法對玉米、 小麥等多種植物光譜信號的優(yōu)化結果, 研究發(fā)現(xiàn)S-G Smoothing可以有效提高光譜的信噪比, 減少雜散光引起的隨機噪聲。 利用Ocean Optics USB2000+光纖光譜儀分析并構建黃瓜白粉病的無損診斷方法研究中指出, 田間實時獲取的黃瓜葉片光譜信息需經(jīng)過S-G smoothing預處理, 才能作為白粉病診斷模型的輸入信號。 本研究獲取的“赤霞珠”葡萄葉片光譜信號也包含基線抖動噪聲, 在對比多種預處理方法后發(fā)現(xiàn), 基于S-G smoothing預處理構建的缺磷脅迫診斷模型性能最佳。

400～700 nm范圍的光譜信號反映了植物葉片中葉綠素的主要信息, Li等[19]通過光和色素對輻射能的選擇吸收實驗, 研究發(fā)現(xiàn)葉綠素a、 b的吸收特征谷分布于450和670 nm附近。 Li等[20]的研究證明植物葉片對光的反射率和折射率較差, 會引起葉綠素a、 b的吸收谷之間形成“綠峰”, 該峰值可直接反映葉綠素的含量。 “赤霞珠”葡萄葉片在受到缺磷脅迫時, 會引發(fā)葉綠素減少, 葉片出現(xiàn)紅褐色塊斑癥狀。 其光譜信號表現(xiàn)形式為610～700 nm范圍的反射率升高, “綠峰”不明顯。 這是由于紅橙光波為葉綠素吸收的“強活性帶”, 葉綠素的減少必然會導致該波段光的反射率升高[21]。

提取葡萄葉片缺磷脅迫的特征波段作為輸入變量, 可有效降低缺磷脅迫模型的時間復雜度和空間復雜度, 提高關鍵信息的權重。 SPA基于矢量空間共線性最小化法則對變量進行向前選擇, 有研究對比分析了SPA和其他3種特征提取方法, 基于SPA提取結果構建的葡萄葉氮素檢測模型性能最佳; Cuq等[15]采用SPA提取了葡萄葉鉀素相關的12個光譜特征變量, 開發(fā)了葡萄園冠層鉀素在線檢測系統(tǒng)。 本研究以RMSE為標準, 采用SPA提取了“赤霞珠”葡萄葉缺磷脅迫的11個特征變量, 對葡萄葉缺磷脅迫的早期、 末期都表征較好。 不同核函數(shù)賦予了SVM不同程度的非線性分析能力, Linear保留了SVM較強的線性關系分析能力; Poly適合于正交歸一化后的數(shù)據(jù); RBF增強了SVM分析非線性關系的能力, 但受核參數(shù)影響較大; Sigmoid可以加強SVM自學習的能力。 在“赤霞珠”葡萄葉缺磷脅迫的診斷模型構建中, 以Linear為核函數(shù)的SVM性能最佳, 這表明葡萄葉缺磷脅迫與光譜信號之間存在直接的線性關系。 Hernndez等[22]和Lu等[23]采用偏最小二乘線性回歸模型分別探究葡萄葉霜霉病和白粉病與光譜信號之間的線性關系, 都取得了較好診斷結果, 論證了葉面病害與光譜信息存在線性關系具有普適性。

3 結 論

基于微型光纖光譜儀采集“赤霞珠”葡萄葉缺磷脅迫不同時期的VIS/NIR光譜信號, 嘗試開發(fā)基于光譜技術的葡萄葉片缺磷脅迫快速無損診斷方法, 具體結論如下:

(1)研究篩選出的11個與“赤霞珠”葡萄葉缺磷脅迫相關的光譜特征變量, 其中539.4、 691.9和729.9 nm反映了葉片缺磷時葉綠素的應激變化; 1 011.9、 1 017.5和1 020.5 nm共同反映了磷素的含量變化。

(2)經(jīng)過S-G Smoothing預處理, 以Linear為核函數(shù)構建的SVM模型對“赤霞珠”葡萄葉缺磷脅迫診斷能力最佳, 對缺磷脅迫早期葉片診斷的SEN為100%, CCR為84.78%; 對缺磷脅迫末期葉片診斷的SEN為100%, CCR為100%, 為葡萄園病害防治與管理提供理論參考和技術依據(jù)。