王謠，丁航，李聰，鄧清超

(長江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434002)

稻瘟菌(Magnaportheoryzae)是一種絲狀子囊真菌(Filamentous fungus)，其無性態(tài)為灰梨孢菌(Pyriculariaoryzae)，屬半知菌門(Deuteromycotina)梨孢屬(Pyricularia)；有性態(tài)稻瘟菌屬于子囊菌屬(Ascomycete)[1-2]為人工培養(yǎng)形式，目前在自然界中并未被發(fā)現(xiàn)。稻瘟病是世界上危害糧食作物水稻的重要病害，發(fā)病癥狀不一，其發(fā)生不受地域、季節(jié)的影響[3]，對全球的糧食安全生產(chǎn)造成極大威脅[4-5]。稻瘟病的防治措施主要包括化學(xué)藥劑防治、抗病品種選育等[6]。其中化學(xué)藥劑防治是最快、最直接的方法，但其對環(huán)境危害也是最大的，稻瘟病菌在與抗病品種互作中容易變異產(chǎn)生新小種，使得長期種植單一抗病品種往往在幾年后其抗病效果在自然界中會降低[7]。綜上所述，大力發(fā)展可替代的安全防控措施勢在必行，生物防治是稻瘟病防控研究和實(shí)踐的一個(gè)重要發(fā)展方向[8]。真菌病毒在植物真菌病害的生物防治方面所具有的實(shí)踐價(jià)值已日益凸顯，真菌營養(yǎng)體不親和性是影響弱毒相關(guān)真菌病毒生物防治應(yīng)用的最主要因素。弱毒病毒在降低宿主的致病力方面起到了重要作用，是真菌病害自然降低的主要機(jī)制之一，在植物病害生物防治方面有著重要的應(yīng)用價(jià)值。稻瘟菌中Partitiviridae科相關(guān)弱毒病毒Magnaportheoryzaepartitivirus 2 strain YC13(MoPV2-YC13)能顯著降低稻瘟菌分生孢子產(chǎn)量，降低了對活體大麥的致病性[9]；Chrysoviridae科病毒MOCV1會引起稻瘟菌菌絲生長形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)異常，黑色素減少，生長速率下降，分枝明顯增多，同時(shí)出現(xiàn)產(chǎn)孢減少，氣生菌絲形成受阻等不正常狀態(tài)[10-11]。

真菌營養(yǎng)體親和性(vegetative compatibility，簡稱VC)指同一種真菌的不同菌株之間菌絲能夠相互融合，進(jìn)而交換細(xì)胞質(zhì)或核物質(zhì)的特性。通常將具有相互親和能力的真菌菌株定義為一個(gè)營養(yǎng)體親和群(vegetative compatibility group，VCG)[12-13]，屬于同一VCG的菌株相互能夠在細(xì)胞融合后形成穩(wěn)定的異核體；而屬于不同VCG的菌株間在細(xì)胞融合時(shí)就會發(fā)生營養(yǎng)體不親和 (vegetative incompatibility，VIC)反應(yīng)，不能形成異核體并引發(fā)程序性的細(xì)胞死亡 (programmed cell death，PCD)[14-17]。VIC作為真菌的一種自我-非自我的識別機(jī)制[16]，阻止了異核體的形成從而抑制了一些侵染性有害因子，如真菌病毒、變異線粒體和超數(shù)染色體等在真菌種群內(nèi)的傳播與擴(kuò)散[17-19]。真菌病毒在田間傳播難易程度與種群營養(yǎng)體親和群(VCG)數(shù)量多少有關(guān)，VCG數(shù)量越多真菌病毒就越難傳播。低毒力病毒CHV1侵染板栗疫病菌(Cryphonectriaparasitica)能夠引起板栗疫病菌毒力的下降，例如在防治歐洲板栗疫病時(shí)CHV1對栗疫病的生物防治已經(jīng)取得了很大成功[20]，而在北美CHV1卻沒有成功防治板栗疫病，其中一個(gè)原因就是北美洲栗疫病菌的種群VCG比較復(fù)雜[16]。

本研究旨在通過不同菌株間進(jìn)行VIC測定，明確小田塊中稻瘟菌群體VCG的復(fù)雜程度，以評估用弱毒真菌病毒在小田塊內(nèi)防控稻瘟病的效率與可行性。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2021年9月于位于恩施市白果鄉(xiāng)兩河村的湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院所屬50 m×60 m的試驗(yàn)田中，間隔10 m以上采集水稻穗頸瘟病樣，經(jīng)單孢分離獲得本實(shí)驗(yàn)所用菌株ES31～ES76。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌分離、純化

取水稻穗頸瘟病樣，剪成約1.5 cm長的小段，放入鋪菌培養(yǎng)皿中的濾紙上進(jìn)行保濕培養(yǎng)，28 ℃黑暗培養(yǎng)18 h，通過體式顯微鏡可以觀察到病斑部位產(chǎn)生大量稻瘟菌分生孢子。將單個(gè)病樣的分生孢子抖落于水瓊脂培養(yǎng)基平板(d=9 cm)上，28 ℃培養(yǎng)1 d，在體式顯微鏡下觀察并用毛細(xì)管灼燒拉成的細(xì)針挑取水瓊脂培養(yǎng)基平板上單個(gè)分生孢子萌發(fā)形成的微菌落，轉(zhuǎn)移至新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)平板(d=6 cm)上進(jìn)行純化培養(yǎng)。每個(gè)病樣挑取6個(gè)單孢菌株，在PDA平板上生長出來的單孢菌株在其菌落直徑達(dá)到3 cm左右，可從中選取1個(gè)菌株進(jìn)行保藏。

1.2.2 稻瘟菌營養(yǎng)體不親和性測定

真菌菌株間的營養(yǎng)體不親和VIC檢測主要是采用對峙培養(yǎng)法(barrage test)[21]。參試菌株在PDA培養(yǎng)基上(d=6 cm)活化3 d后，于菌落邊緣切取2 mm×2 mm的幼嫩菌絲塊轉(zhuǎn)移到新的PDA培養(yǎng)基上(d=9 cm)進(jìn)行對峙培養(yǎng)，接種的兩菌絲塊之間相隔0.50～0.75 cm，每個(gè)組合進(jìn)行3次重復(fù)并對培養(yǎng)皿進(jìn)行密封處理。28 ℃黑暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～5 d之后，觀察PDA培養(yǎng)基(d=9 cm)上兩菌落交界處是否產(chǎn)生拮抗反應(yīng)(barrage formation)，即是否出現(xiàn)一條肉眼可見的白色抗衡帶。若兩菌株間的菌落交界處沒有明顯的抗衡帶，即兩菌株菌絲完全融合并且能夠正常生長，則兩菌株為營養(yǎng)體親和(VC)；反之，則兩菌株為營養(yǎng)體不親和(VIC)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

通過Excel對所有參試菌株組合的VIC測定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對菌株之間親和的比例以及營養(yǎng)體親和群的劃分進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟菌不同菌株間對峙培養(yǎng)的表型

本實(shí)驗(yàn)通過對不同菌株間兩兩進(jìn)行對峙培養(yǎng)(barrage test)[21]，觀察記錄到配對培養(yǎng)結(jié)果顯示為親和與不親和兩種。親和型反應(yīng)現(xiàn)象表現(xiàn)為Ⅰ型，在兩菌株交界處的菌絲完全融合且正常生長，沒有形成抗衡帶，其中A1、A2、A3分別為對峙培養(yǎng)的培養(yǎng)皿的正反兩面，以及透光條件下的反面；而不親和反應(yīng)現(xiàn)象存在兩種主要類型：Ⅱ型，兩菌株菌絲交界的地方產(chǎn)生一條清晰的白色抗衡帶，B1、B2、B3分別為對峙培養(yǎng)的培養(yǎng)皿的正反面，以及透光條件下的反面；Ⅲ型，兩菌株菌絲交界的地方形成一條清晰的白色抗衡帶，且菌落顏色較淺的菌株在靠近抗衡帶附近的菌絲顏色也會加深，C1、C2、C3分別為對峙培養(yǎng)的培養(yǎng)皿的正反面，以及透光條件下的反面(圖1)。

2.2 稻瘟菌營養(yǎng)體不親和性測定

將46個(gè)菌株分別進(jìn)行兩兩配對之后，對所有觀察到的對峙培養(yǎng)反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，發(fā)現(xiàn)在1 058個(gè)(46×46)配對組合中，大多數(shù)配對組合(818對)表現(xiàn)為VIC，占配對組合總數(shù)的77.3%，表現(xiàn)為VC的配對組合數(shù)量較少(240對)，占配對組合總數(shù)的22.7%。

對數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析，根據(jù)VCG的定義，可將 46個(gè)稻瘟菌菌株中的20個(gè)歸入16個(gè)互不親和的VCG中(表1)，其余的26個(gè)菌株由于與多個(gè)VCG的全部或部分成員親和，不能歸入任何VCG之中(表2)。需要注意的是，即使是屬于同一VCG的兩個(gè)菌株，與其他菌株的VC反應(yīng)也并不完全相同，比如菌株ES31、ES45同屬于親和群1，ES45與ES30、ES31、ES33、ES36親和，但是ES31只與ES45、ES55親和。

表1 參試稻瘟菌株的VCG分析

表2 與多個(gè)VCG的全部或部分成員親和的菌株

3 討論

本文借鑒了前人的研究方法，在稻瘟菌上建立了一種鑒定營養(yǎng)體親和性的方法即對峙培養(yǎng)法(barrage test)[21]，并利用該方法對小田塊中稻瘟菌群體的營養(yǎng)體親和群復(fù)雜度進(jìn)行了分析和評估。本實(shí)驗(yàn)分離得到了46株稻瘟病病株，經(jīng)過VIC測定和VCG分析后發(fā)現(xiàn)了16個(gè)互不親和的VCG，且其中12個(gè)VCG都只有一個(gè)成員，另外4個(gè)VCG也只有2個(gè)菌株，且2個(gè)同屬于一個(gè)VGC的菌株與其他菌株的VC反應(yīng)并不完全相同；另外26個(gè)菌株能夠與兩個(gè)以上的VCG的全部或部分成員親和，不應(yīng)劃分入任何VCG中。參試的46個(gè)菌株中，任何兩個(gè)菌株與其他菌株的VC反應(yīng)都不完全相同。本研究顯示，即使在小田塊中，稻瘟菌群體也有著非常復(fù)雜的VCG結(jié)構(gòu)。

稻瘟菌復(fù)雜的種群遺傳結(jié)構(gòu)，是其具有快速變異性和高度環(huán)境適應(yīng)性的原因和基礎(chǔ)。鄧云等[22]用抗性基因分子標(biāo)記檢測福建省稻瘟病生理小種優(yōu)勢種群，分析致病率，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)布局優(yōu)化方案。劉偉等[23]利用已知水稻鑒別品種對遼寧省野生稻瘟病菌進(jìn)行生理小種鑒定，發(fā)現(xiàn)稻瘟病菌群體的生理小種結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜；李海倫等[24]采用群體遺傳學(xué)的方法，也發(fā)現(xiàn)在特定小環(huán)境中的稻瘟菌群體多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在水稻上分離得到的稻瘟菌群體。本研究從VCG的角度出發(fā)，從另一個(gè)側(cè)面也印證了之前的諸多研究，證明了即使在小田塊中，稻瘟菌群體也有著非常復(fù)雜的遺傳結(jié)構(gòu)。

不同VCG菌株間的VIC反應(yīng)會嚴(yán)重限制真菌病毒的水平傳播，影響弱毒相關(guān)真菌病毒對稻瘟病的生物防治效率。真菌病毒通常缺少體外傳播途徑，只能通過孢子釋放進(jìn)行垂直傳播或通過菌株間的菌絲融合進(jìn)行水平傳播，VIC成為影響弱毒相關(guān)病毒傳播和生物防治效率的最主要因素[18，25-27]。選擇了實(shí)驗(yàn)室的帶毒稻瘟菌株與本實(shí)驗(yàn)中的46個(gè)菌株采用對峙培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)帶毒菌株與本實(shí)驗(yàn)中的菌株均不親和，且病毒均未發(fā)生傳遞，再次證明了真菌病毒在不同營養(yǎng)體親和群間不易傳播。實(shí)驗(yàn)室中其他菌株與帶毒稻瘟菌株進(jìn)行對峙培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)病毒傳遞成功的兩菌落接觸區(qū)出現(xiàn)扇變。本研究還發(fā)現(xiàn)，參試的約半數(shù)菌株可以與多個(gè)VCG的部分或全部成員親和，推測野生稻瘟菌群體中存在vic基因自然缺失的突變體[28]，或存在由非等位的vic基因控制的VIC反應(yīng)[29]。

本文在前期研究中初步發(fā)現(xiàn)在自然環(huán)境中的稻瘟菌群體可能有著非常復(fù)雜的VCG，病毒在不同VCG間很難發(fā)生水平傳播。本研究為后續(xù)評估稻瘟病發(fā)生地區(qū)采用真菌病毒生物防治的難易程度提供一定的理論基礎(chǔ)以及為后續(xù)鑒定稻瘟菌親和性功能基因提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對在恩施地區(qū)實(shí)驗(yàn)田塊(0.27 hm2)中分離得到了46株的稻瘟病病株，將采集分離得到的稻瘟病病株經(jīng)過VIC測定和VCG分析后發(fā)現(xiàn)，結(jié)果顯示，在恩施田塊采集的稻瘟菌菌株中有16個(gè)互不親和的VCG，并且多數(shù)VCG只包含1到2個(gè)菌株。這表明即使在小田塊中，稻瘟菌群體也比較復(fù)雜。雖然用于進(jìn)行VCG測定的稻瘟菌菌株的數(shù)量仍然較少，而且只選擇了恩施稻瘟菌監(jiān)測苗圃，但也能說明稻瘟菌群體的VCG復(fù)雜度高，VCG間的VIC反應(yīng)在將來也許對弱毒相關(guān)病毒進(jìn)行生物防治應(yīng)用有不小的阻礙。在后續(xù)研究中將擴(kuò)大研究范圍對更多不同地域的稻瘟菌群體的VCG復(fù)雜性進(jìn)行分析，完善研究內(nèi)容，以期能夠?qū)ξ覈牡疚辆后w的VCG復(fù)雜程度有一個(gè)更為完整和準(zhǔn)確的評估。