周勤，徐丹彬，方麗，葉琪明，繆強(qiáng)，萬華建，邱春英，王漢榮*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 杭州 310021；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所，浙江 杭州 310021；3.杭州市富陽區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江 杭州 311499；4.杭州市西湖區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，浙江 杭州 310013；5.杭州市蕭山區(qū)農(nóng)林業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 杭州 311200)

蝴蝶蘭為蘭科蝴蝶蘭屬植物，原產(chǎn)地為熱帶、亞熱帶地區(qū)，素有“洋蘭皇后”的美譽(yù)[1]。20世紀(jì)90年代末，蝴蝶蘭作為一款高檔花卉從中國臺(tái)灣引入大陸，其葉片寬厚碧綠、花色多彩俏麗、花型優(yōu)美大氣，符合國人喜慶、熱鬧、團(tuán)圓等傳統(tǒng)氣氛，結(jié)合其花期長等優(yōu)點(diǎn)，成為年宵花和禮品花的首選[2]，廣受消費(fèi)者的喜愛。近年來，隨著蝴蝶蘭趨向于平價(jià)化，浙江省蝴蝶蘭年交易量基本穩(wěn)定在500萬株左右，銷售額達(dá)上億元，并有不斷發(fā)展的趨勢(shì)。但蝴蝶蘭在栽培過程中容易發(fā)生一種病害，肉質(zhì)葉的基部發(fā)黑變褐導(dǎo)致莖基部腐爛，花農(nóng)稱該病為黑頭病。目前，不同蝴蝶蘭品種黑頭病的發(fā)生差異較大，易感品種的病株率為5%～50%，催花抽梗后發(fā)病尤為嚴(yán)重。由于該病發(fā)病初期不易被發(fā)現(xiàn)，一旦發(fā)現(xiàn)難以防控，且發(fā)病速度迅猛，花農(nóng)損失較大，成為遏制蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸之一。

為了促進(jìn)蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)的快速健康發(fā)展，2021年浙江省啟動(dòng)了農(nóng)業(yè)重大技術(shù)協(xié)同推廣計(jì)劃項(xiàng)目，項(xiàng)目組調(diào)查了杭州蘭派農(nóng)業(yè)科技有限公司、杭州百盛精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)有限公司和浙江啟美生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司等杭州市主要蝴蝶蘭生產(chǎn)企業(yè)的黑頭病發(fā)生情況和品種抗性等，鑒定了引起黑頭病的主要病原，并提出預(yù)防蝴蝶蘭黑頭病發(fā)生的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)和技術(shù)方法，為蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展提供切實(shí)有效的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病樣的采集

2021年11月，在杭州蘭派農(nóng)業(yè)科技有限公司、杭州百盛精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)有限公司和浙江啟美生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司等蝴蝶蘭種植基地分別采集數(shù)十個(gè)蝴蝶蘭黑頭病樣品，對(duì)莖基部的典型病斑用蔡氏光學(xué)顯微鏡AX10鏡檢，并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病原的分離純化

采集黑頭病的典型病樣，并用組織分離方法進(jìn)行分離純化。病健組織切成5 mm×5 mm的小塊，并用70%乙醇消毒40 s，用無菌水沖洗3次，再用無菌濾紙吸干水分后，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上，于25 ℃霉菌培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)5 d。將獲得的不同菌落的菌絲塊置于新的PDA培養(yǎng)基進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)。培養(yǎng)至產(chǎn)孢后，單孢純化獲得不同菌株，并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 致病性測(cè)定

將獲得的不同分離菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，用5 mm打孔器從菌落邊緣打出菌碟，避開葉片主脈放置在健康的蝴蝶蘭品種LL29葉片上(4～5片葉)。以PDA培養(yǎng)基空白塊為對(duì)照，保濕48 h，于25 ℃光照培養(yǎng)箱(12 h光照/12 h黑暗)培養(yǎng)，每天觀察病斑的形成和癥狀特征。

1.4 分子鑒定系統(tǒng)性分析

采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取分離物的基因組DNA，核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)擴(kuò)增通用引物ITS1/ITS4[3]、甘油-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因內(nèi)含子引物GDF1/GDR1[4]、肌動(dòng)蛋白(Actin，ACT)引物ACT-512F/ACT-783R[5]、延遲因子(translation elongation factor 1-alpha，TEF)引物EF1-728F/EF1-986R[5]和β微管蛋白(β-tubulin，tub2)引物BT-2a/BT-2b[6]由北京擎科生物有限公司合成。炭疽菌以ITS+Act+GAPDH+Tub的順序，鐮刀菌以ITS+TEF的順序進(jìn)行排列，將獲得的各基因串聯(lián)成數(shù)據(jù)集，采用最大似然法(maximum likelihood，ML)，利用軟件Mega 7.0將分離到的菌株分別與已發(fā)表的10個(gè)炭疽病菌菌株和18個(gè)鐮刀菌菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)定Bootstrap為1 000。

1.5 黑頭病的品種抗性調(diào)查

調(diào)查了杭州蘭派農(nóng)業(yè)科技有限公司、杭州百盛精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)有限公司和浙江啟美生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司等蝴蝶蘭種植基地中的21個(gè)蝴蝶蘭品種的黑頭病發(fā)生率，篩選出抗性品種。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原診斷和癥狀描述

觀察蝴蝶蘭苗期、抽梗期和開花期的黑頭病病癥，并對(duì)這些病斑進(jìn)行植物病理學(xué)的鏡檢、組織分離、病原純化鑒定以及致病性測(cè)定后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑頭病可以細(xì)分為2類病癥，由不同的病原真菌侵染引起，分別為炭疽類(Colletotrichumsp.)[7]和鐮刀類(Fusariumsp.)，即蝴蝶蘭黑頭病是由炭疽類真菌引起的炭疽病和鐮刀菌類真菌引起的枯萎病2種病害組成。

炭疽病病斑常在莖基部出現(xiàn)，最初為褪綠或褐色小點(diǎn)，后變?yōu)閳A形或不規(guī)則形黑色病斑，病斑后期變?yōu)榛野咨袝r(shí)有輪紋，病部密生小黑點(diǎn)，濕度高時(shí)小黑點(diǎn)可分泌出猩紅色黏孢子團(tuán)，或產(chǎn)生規(guī)則排列的白色絨毛狀小點(diǎn)。病斑擴(kuò)展至整個(gè)葉柄主脈時(shí)葉片發(fā)黃或枯死，枯死的老葉正反兩面均可見密生小黑點(diǎn)。該病也在葉面上發(fā)生，可形成略凹陷的針點(diǎn)狀小斑點(diǎn)(圖1)。

圖1 由虎頭蘭刺盤孢侵染引起的蝴蝶蘭黑頭病的田間典型癥狀

枯萎病初發(fā)時(shí)病部為水漬狀褪綠病斑，后發(fā)展成半圓形或不規(guī)則形，病斑黑色，略凹陷，病部葉片常發(fā)紅或發(fā)黃。濕度高時(shí)，病部可出現(xiàn)白色霉層，發(fā)病莖部脆弱，易折斷。最后病斑擴(kuò)展整個(gè)葉基部，葉片斷裂、脫落，病斑繼續(xù)向上向下蔓延，直至整株枯死。該癥狀蝴蝶蘭苗期、催花和開花等階段均可發(fā)病(圖2)。

圖2 由茄病鐮孢侵染引起的蝴蝶蘭黑頭病的田間典型癥狀

2.2 病原鑒定

根據(jù)蝴蝶蘭苗期、抽梗期和開花期發(fā)生的黑頭病病癥，我們發(fā)現(xiàn)黑頭病由炭疽類和鐮刀菌類2種病原真菌侵染形成。這2種病害癥狀和發(fā)生條件都非常相似，較難分辨。采用組織分離法從這2種蝴蝶蘭病樣中分離獲得數(shù)十個(gè)不同的分離物菌株。將這些分離物置于新鮮PDA培養(yǎng)基上于25 ℃黑暗培養(yǎng)。

炭疽類病原菌呈放射狀生長，初生菌絲白色，短絨毛狀，后變深橄欖色至黑灰色。該菌在PDA固體培養(yǎng)基上不易產(chǎn)孢，在液體PDA中25 ℃培養(yǎng)5 d可產(chǎn)生少量分生孢子。分生孢子透明，桿形，14.3～19.8 μm×5.0～5.4 μm。在寄主植物上可產(chǎn)生大量近球形黑色孢子器，嵌于葉組織內(nèi)，具一個(gè)孔口，有的有剛毛。有性形態(tài)子囊孢子，桿狀，單孢，透明，1～2個(gè)油球，或油球不明顯。從菌落形態(tài)上初步判斷為虎頭蘭刺盤孢[7]。

鐮刀菌類在培養(yǎng)基上呈放射狀生長，白色絨毛狀，菌落背面為土黃色；產(chǎn)生大量的卵形小型分生孢子，8.0～16.0 μm×2.5～4.0 μm，以及少量馬特型大型分生孢子，兩端較鈍，基部細(xì)胞有足跟，3～5隔，23.1～58.4 μm×3.0～6.0 μm。根據(jù)菌落形態(tài)初步判斷為茄病鐮孢[8]。

2.3 致病性測(cè)定

將2種病原分離物培養(yǎng)5 d后接種至健康的蝴蝶蘭植株上，接種4 d后2種分離物的接種處均產(chǎn)生病斑。炭疽類分離物接種后產(chǎn)生的病斑為深褐色，病健交界清晰，有少許黃暈，病斑略凹陷，有時(shí)有輪紋。茄病鐮刀菌分離物接種后最初產(chǎn)生水浸狀淡褐色病斑，后期病斑顏色略變深，隨著病斑的擴(kuò)展，病健交界模糊，周圍葉肉或整個(gè)葉片明顯變黃或變紅。這2種病原分離物對(duì)蝴蝶蘭均有較強(qiáng)的致病性。而對(duì)照植株無病斑。根據(jù)柯赫氏法則，從接種部位重新分離出了對(duì)應(yīng)的相同病原物，因此，確認(rèn)這2種病原分別為蝴蝶蘭黑頭病的2種病原菌(圖3)。

A—虎頭蘭刺盤孢接種后7 d；B—茄病鐮孢接種后7 d；C—空白對(duì)照。

2.4 蝴蝶蘭黑頭病的分子鑒定

使用Mega 7.0軟件，采用鄰接法拼接序列，將典型病原菌菌株的ITS rDNA基因、肌動(dòng)蛋白基因(ACT)、微管蛋白基因(Tub)和甘油磷酸脫氫酶基因(GAPDH)序列和翻譯延長因子(TEF)與GenBank中的Colletotrichum屬和Fusarium屬菌株構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，分別以C.gloeosporioidesCBS112999和GibberellazeaeNRRL 29169為外組，結(jié)果表明，炭疽類菌株與已報(bào)道的盤長孢狀刺盤孢C.orchidearum類群構(gòu)成了明顯的分支，并且相似性達(dá)到99%，鐮刀類菌株與F.solani類聚，且相似性達(dá)到了98%。

圖4 虎頭蘭刺盤孢和茄病鐮孢的序列進(jìn)化樹

因此，根據(jù)形態(tài)和分子鑒定結(jié)果，確診造成蝴蝶蘭黑頭病的炭疽類病原菌為虎頭蘭刺盤孢(ColletotrichumorchidearumAlleschf.Cymbidii Allesch)[9]，造成蝴蝶蘭黑頭病的鐮刀類病原菌為茄病鐮孢(Fusariumsolanif.sp.Fabae Yu et C.T.Feng)。

3 虎頭蘭刺盤孢和茄病鐮孢引起的蝴蝶蘭黑頭病的發(fā)生率

從杭州蘭派農(nóng)業(yè)科技有限公司、杭州百盛精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)有限公司和浙江啟美生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司等蝴蝶蘭基地分別采集黑頭病樣品數(shù)十份，鏡檢并分離培養(yǎng)病原物。發(fā)現(xiàn)由C.orchidearum引起的黑頭病發(fā)生率最大，為62.5%以上，而由F.solani引起的黑頭病的發(fā)生率在14.8%～37.5%(表1)。其中F.solani引起的黑頭病主要發(fā)生在蝴蝶蘭苗期，其發(fā)生的比例明顯高于成株期。個(gè)別樣品的病斑則由其他病原引起，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

表1 虎頭蘭刺盤孢和茄病鐮孢引起的蝴蝶蘭黑頭病的發(fā)生率

4 蝴蝶蘭品種對(duì)黑頭病的抗性差異

2021年11月，隨機(jī)調(diào)查了21個(gè)蝴蝶蘭品種的黑頭病發(fā)生情況(表2)，發(fā)現(xiàn)5個(gè)大花型中，金橘、仙桃、富樂夕陽的發(fā)病率為0，無黑頭病，為抗性品種。而16個(gè)中小花型中僅紅粉佳人、雪玉未發(fā)生黑頭病，其余品種均有不同程度的病害發(fā)生。

表2 蝴蝶蘭品種黑頭病發(fā)現(xiàn)情況調(diào)查

5 蝴蝶蘭黑頭病的發(fā)生流行規(guī)律

在溫室大棚內(nèi)，由虎頭蘭刺盤孢和茄病鐮孢引起的蝴蝶蘭黑頭病具有相似的發(fā)生和流行規(guī)律，其主要以菌絲體和分生孢子器在病原組織內(nèi)越冬，經(jīng)農(nóng)事操作和水滴氣流的傳播擴(kuò)散。在蝴蝶蘭整個(gè)生產(chǎn)過程均可發(fā)病，植株在傷口、高溫高濕、澆水過量或當(dāng)頭淋澆、排水通風(fēng)不暢等情況下容易被誘發(fā)。

蝴蝶蘭黑頭病中，由虎頭蘭刺盤孢侵染引起的炭疽類黑頭病占多數(shù)，由茄病鐮孢引起的鐮刀類黑頭病占小部分?；㈩^蘭刺盤孢以傷口侵入為主，具有較長時(shí)間的潛伏期，周年發(fā)病?？蓮臍馍蚧ü３槌鲈谌~柄上形成傷口入侵，為病害發(fā)生高峰期，該時(shí)期為預(yù)防炭疽病的關(guān)鍵時(shí)期。茄病鐮孢從肉質(zhì)根系或傷口侵入，植株長勢(shì)弱、基質(zhì)帶菌和通風(fēng)排水不暢等情況下易誘發(fā)病害，以苗期發(fā)病為主。蝴蝶蘭黑頭病3—10月均可發(fā)生，春秋季棚內(nèi)溫濕度高，為黑頭病發(fā)生的主要時(shí)期，提早做好病害的預(yù)防，控溫通氣，降低棚內(nèi)濕度，是防控病害的關(guān)鍵。

6 蝴蝶蘭黑頭病的綜合防治技術(shù)

6.1 選用抗病品種

從杭州市3家蝴蝶蘭生產(chǎn)企業(yè)調(diào)查情況看，目前生產(chǎn)上常用的蝴蝶蘭品種中易感品種為雙色鳥、三色鳥、甜格格、LL29、大黃蜂、明日之星等，在生產(chǎn)中需謹(jǐn)慎使用。

6.2 把好基質(zhì)和種植關(guān)

基質(zhì)材料需充分消毒滅菌，減少病原菌的攜帶。蝴蝶蘭小苗換盆時(shí)要淺栽，裸露莖基，基質(zhì)切勿沒過植株莖基部。

6.3 正確澆水和通風(fēng)

換盆后一個(gè)月內(nèi)應(yīng)控制水分，養(yǎng)護(hù)過程忌大水漫灌，或從當(dāng)頭灌澆，需從花盆邊緣澆入。選擇晴天澆水，每次澆透水后打開風(fēng)扇增加空氣流通，降低局部濕度。

6.4 及時(shí)清理病源

平時(shí)加強(qiáng)巡園，及時(shí)清除植株上的老葉、病葉、枯枝、凍害或灼傷的葉片，隔離或清除傳染源。發(fā)現(xiàn)病葉應(yīng)剪除，在傷口涂抹殺菌劑。若發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，則整株清除。

6.5 合理施肥和溫濕度管理

施肥遵循“少量多次、薄肥勤施”的原則，出瓶后5～7個(gè)月適當(dāng)降低氮肥比例，催花前1個(gè)月開始提高磷鉀比例；苗期溫度26～30 ℃，催花期溫度18～25 ℃；濕度60%～80%為宜，環(huán)境濕度達(dá)到90%以上時(shí)，開啟內(nèi)循環(huán)，加強(qiáng)空氣流動(dòng)。

6.6 減少傷口產(chǎn)生

裝箱前需控水，防止因基質(zhì)過濕引起紙箱潮濕變軟，造成紙箱塌陷，壓傷植株。在運(yùn)輸過程中需輕拿輕放，防止出現(xiàn)大量傷口。

6.7 適時(shí)化學(xué)防治

以防為主。換盆前后噴灑廣譜性殺菌劑，第一次澆灌肥水可與廣譜性殺菌藥物同時(shí)施用，如亮盾(精甲·咯菌腈)懸浮種衣劑2 000倍液，之后每2周噴施1次廣譜性殺菌劑；抽梗時(shí)蝴蝶蘭莖基部產(chǎn)生較大傷口，易感品種在長出花梗過程中易出現(xiàn)發(fā)病高峰期，催花前后為防控關(guān)鍵期，可用450 g·L-1咪鮮胺微乳劑1 000倍液、30%吡唑醚菌酯乳油2 000倍液、25%苯醚溴菌清可濕性粉劑600倍液中的1～2種藥劑，5～7 d噴1次，連噴3次。各種藥劑要交替使用，以防病菌產(chǎn)生抗藥性。換盆或運(yùn)輸蘭株前后可噴藥1次，進(jìn)行預(yù)防。