陸艷婷，楊文新，劉超綱，俞法明，葉靖，陳金躍，王炳奎

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物與核技術(shù)利用研究所，浙江 杭州 310021)

電離輻射能量可使生物體各種分子發(fā)生電離和激發(fā)，這些分子通過一系列反應(yīng)產(chǎn)生活潑的自由原子和自由基，再與大分子物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)和酶等發(fā)生反應(yīng)，引起分子結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致生物體正常生化過程受到干擾，引發(fā)DNA堿基改變、各種細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)及其組成變化，產(chǎn)生基因突變，從而產(chǎn)生新的性狀或變異體。γ射線具有波長短、頻率高、能量高的特點(diǎn)，穿透力強(qiáng)，可使生物體內(nèi)細(xì)胞發(fā)生電離作用。

水稻的種植面積和產(chǎn)量分別占世界作物生產(chǎn)的1/5和1/4，是重要的糧食作物。好的品種對于水稻生產(chǎn)十分重要，種質(zhì)資源是水稻育種的關(guān)鍵，有效地開發(fā)和利用水稻種質(zhì)資源，才有可能取得品種的遺傳改良和育種的突破。近年來審定的品種較多，但同類型品種間的遺傳距離狹窄、遺傳差異相對較小[1-4]，成為水稻育種難以取得突破性進(jìn)展的原因之一。輻射誘發(fā)突變創(chuàng)制新種質(zhì)是解決這些問題的重要途徑之一。不同劑量的60Co-γ射線、重離子、UV-C等對農(nóng)作物的誘變效應(yīng)已有報(bào)道[5-9]，但至今未見137Cs-γ射線的不同劑量率輻射對水稻誘變效應(yīng)影響的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)以水稻種子為材料，開展了137Cs-γ射線的不同劑量率和不同劑量的輻射處理，以了解水稻種子對不同劑量率和不同劑量137Cs-γ射線輻射的敏感性和生理響應(yīng)，探究不同劑量率和不同劑量對水稻誘變效應(yīng)的影響，為水稻輻射誘變中提高有效誘變率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)選用的水稻品種為秈型水稻浙1613和粳型水稻浙粳100，秈型水稻浙1613種子含水量小于13.5%，粳型水稻浙粳100種子含水量小于14.5%，符合國家貯藏標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 輻射劑量率與劑量設(shè)計(jì)

輻射處理在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家水稻改良中心輻射育種研究室(浙江省輻照中心)進(jìn)行，放射源為137Cs；處理劑量率分別為10、60、250 Gy·h-1；劑量分別為150、250、350、400、450 Gy。用于測序的400 Gy不同劑量率各處理的種子量為100 g，其他各處理種子50 g，以無輻射處理(即0 Gy)為對照，劑量計(jì)與樣品并排排列，3次重復(fù)。

1.3 發(fā)芽試驗(yàn)

試驗(yàn)于2021—2022年在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所核技術(shù)利用研究室進(jìn)行。取12 cm×12 cm實(shí)驗(yàn)用種子發(fā)芽盒，底部放入3張濾紙，加入40 mL純凈水，每處理隨機(jī)選取飽滿的100粒水稻種子均勻放至各發(fā)芽盒中，種子之間保持足夠的距離，以保證種子都能充分接觸水分，吸水一致，生長良好，每處理設(shè)3次重復(fù)，隨機(jī)排列。在實(shí)驗(yàn)過程中隨時(shí)檢查，保持濾紙濕潤。發(fā)芽盒放入植物生長箱(型號：Binder KBW400；德國賓德有限責(zé)任公司)培養(yǎng)，設(shè)定溫度(30±2)℃。2 d時(shí)將已萌發(fā)(可見芽和根)的種子轉(zhuǎn)入96孔水培盒。培養(yǎng)液濃度為463.9 mg·L-1的Yoshida水稻營養(yǎng)液(干粉)，pH值為5.8±0.1，水培盒每5 d更換1次營養(yǎng)液。

1.4 成苗率與苗高

7 d時(shí)統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，21 d時(shí)統(tǒng)計(jì)成苗率。只長芽不發(fā)根或只發(fā)根不長芽的種子剔除。從每個(gè)種植箱內(nèi)隨機(jī)選取除四周位置外的10株幼苗跟蹤測量7、21 d時(shí)苗高、根長，并計(jì)數(shù)21 d的總根數(shù)。

1.5 基因測序

各取不同劑量率的400 Gy輻射處理的2 000株7 d時(shí)的幼苗等量葉片混合提取DNA，以不輻照為對照，委托北京諾禾致源科技股份有限公司測序。DNA樣品經(jīng)電泳檢測后通過Covaris破碎機(jī)隨機(jī)打斷為長度為350 bp的片段，構(gòu)建的文庫通過illumina HiSeqTMPE150進(jìn)行測序。3個(gè)不同劑量率處理及對照測序平均深度在(36.21～39.39)×，為了保證數(shù)據(jù)質(zhì)量，對測序得到的原始序列中含有帶接頭的、低質(zhì)量的信息進(jìn)行過濾，然后將過濾后的有效測序數(shù)據(jù)比對到R498參考基因組(http：//mbkbase.org)，比對結(jié)果去重復(fù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用SPSS和Excel軟件進(jìn)行所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析和顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻射劑量測量

對輻射的實(shí)際劑量進(jìn)行測定，不同劑量率下不同預(yù)設(shè)劑量的實(shí)測標(biāo)準(zhǔn)差在1.6～4.4 Gy，符合試驗(yàn)要求(表1)。

表1 輻照處理的劑量測定

2.2 不同劑量率輻射對水稻發(fā)芽率和成苗率的影響

由表2可見，不同輻射劑量處理對供試材料的發(fā)芽率和成苗率有明顯影響，隨著輻射劑量的增加，浙1613和浙粳100的種子發(fā)芽率和成苗率均下降。同一劑量處理下，不同劑量率輻射對浙1613的7 d發(fā)芽率沒有顯著影響；浙粳100在350、450 Gy輻射劑量處理時(shí)，不同劑量率下發(fā)芽率有顯著差異。250、350、450 Gy輻射劑量處理下，浙粳100的21 d成苗率有顯著差異。結(jié)果表明，較低劑量下不同劑量率輻射對成苗率沒有影響，但較高劑量處理時(shí)不同劑量率對成苗率有顯著影響。

表2 不同劑量率輻照對水稻成苗率的影響

2.3 不同劑量率輻射對水稻幼苗苗高的影響

對2個(gè)水稻品種在不同輻射條件處理后的苗高進(jìn)行測量，發(fā)現(xiàn)輻射處理抑制幼苗生長，且隨劑量增大抑制更加明顯(圖1)。浙1613經(jīng)10、60、250 Gy·h-1不同劑量率下的350 Gy輻射處理的21 d苗高分別為14.6、15.2、15.9 cm，較對照分別降低12.05%、8.43%、4.22%，10 Gy·h-1的低劑量率處理的苗高顯著低于250 Gy·h-1高劑量率處理的苗高；450 Gy的不同劑量率處理的苗高差異顯著性情況與350 Gy相一致。浙粳100在250、350 Gy輻射條件下，250 Gy·h-1處理的21 d苗高均顯著高于10 Gy·h-1處理，10、60、250 Gy·h-1劑量率的450 Gy輻射處理的21 d苗高分別為4.4、4.7、5.2 cm，較對照分別降低51.11%、47.77%、42.22%，250 Gy·h-1處理的21 d苗高顯著高于10、60 Gy·h-1處理。

同劑量不同劑量率柱子上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

由表3可見，不同輻射劑量對水稻根系生長影響顯著。隨著輻射劑量的增加，水稻根長降低，總根數(shù)隨之減少，品種間降幅略有差異，輻射處理明顯抑制幼苗的根系生長，且隨輻射劑量增大抑制更加明顯。與苗高的變化趨勢相似，較高輻射劑量處理時(shí)，高劑量率的處理根長和根系數(shù)均要高于低劑量率的。在450 Gy劑量處理下，浙粳100在高劑量率處理組的根長與根數(shù)高于低劑量率處理。

表3 同一劑量不同劑量率輻射對水稻根系生長的影響

2.4 高劑量輻射下不同劑量率對水稻農(nóng)藝性狀的影響

高劑量輻射處理影響種子苗床成苗率、大田成活率和結(jié)實(shí)率。如表4所示，10、60、250 Gy·h-1不同劑量率下450 Gy輻射處理對浙1613和浙粳100的苗床成苗率、大田成活率和株高的影響明顯。450 Gy輻射處理下的不同劑量率處理對浙1613的分蘗數(shù)、有效穗、穗長影響不明顯，而對浙粳100影響較大。450 Gy高劑量輻射處理明顯降低水稻的實(shí)粒數(shù)、總粒數(shù)和結(jié)實(shí)率。劑量率越高，浙1613的每穗實(shí)粒數(shù)下降越顯著，而浙粳100在各劑量率下的影響都特別明顯。浙1613的總粒數(shù)在3個(gè)不同劑量率下差異不明顯，但浙粳100在3個(gè)不同劑量率之間差異較大。不同劑量率對結(jié)實(shí)率的影響與實(shí)粒數(shù)相一致。株高是重要的植物形態(tài)學(xué)指標(biāo)，較高劑量輻射下水稻受影響較為明顯，3個(gè)不同劑量率的水稻成株后株高均下降，且浙粳100受影響較大。

表4 高劑量條件下不同劑量率輻射對水稻生長的影響

2.5 不同劑量率的輻射對基因組誘變程度的影響

3個(gè)不同劑量率處理對水稻種子發(fā)芽率影響不顯著，但對水稻后期生長造成一定的影響。為評估不同劑量率的輻射對基因組誘發(fā)突變程度的影響，對3個(gè)不同劑量率400 Gy輻射處理的浙1613全基因組測序，評估發(fā)生變異的概率。

通常認(rèn)為變異位于外顯子區(qū)域或剪接位點(diǎn)可能會(huì)引起功能變異，根據(jù)全基因組InDel和SNP變異檢測結(jié)果，10、60、250 Gy·h-1劑量率處理的樣品獲得標(biāo)記的個(gè)數(shù)分別為1 140 624個(gè)(其中，Indel為174 813個(gè)，SNP為965 811個(gè))、1 141 426個(gè)(其中，Indel為174 365個(gè)，SNP為967 061個(gè))和1 139 980個(gè)(其中，Indel為174 292個(gè)，SNP為965 688個(gè))。與對照比對發(fā)現(xiàn)存在變異的位點(diǎn)分別為75 262個(gè)(其中，Indel為27 183個(gè)，SNP為48 079個(gè))、77 143個(gè)(其中，Indel為27 315個(gè)，SNP為49 828個(gè))和81 056個(gè)(其中，Indel為28 015個(gè)，SNP為53 041個(gè))，其中，位于外顯子區(qū)域或可變剪接位點(diǎn)的變異分別為2 869(其中，Indel為514個(gè)，SNP為2 355個(gè))、3 010個(gè)(其中，Indel為505個(gè)、SNP為2 505個(gè))、和3 363個(gè)(其中，Indel為540個(gè)，SNP為2 823個(gè))，分別占總變異位點(diǎn)的3.81%、3.90%、4.15%，占總位點(diǎn)的0.25%、0.26%、0.30%，即3個(gè)不同劑量率處理后可能發(fā)生變異的概率分別為0.25%、0.26%、0.30%，表明不同劑量率處理誘發(fā)的基因組變異存在差異(圖2)，且隨劑量率的增加而增加。

圖2 不同劑量率處理對水稻幼苗全基因組可能變異的概率估算

3 小結(jié)與討論

當(dāng)前，種業(yè)“卡脖子”技術(shù)受到黨和國家領(lǐng)導(dǎo)人及學(xué)術(shù)界的高度重視，也受到浙江省政府以及省內(nèi)外種業(yè)和農(nóng)學(xué)界高度重視[10-11]，如何突破種業(yè)“卡脖子”技術(shù)，需要在育種技術(shù)上積極探索。水稻的自然變異率約二十萬分之一，長期以來的實(shí)踐表明，輻射誘變的變異率可達(dá)千分之幾，這與本試驗(yàn)根據(jù)全基因測序估算的3個(gè)不同劑量率間的可能變異率在0.25%～0.30%相吻合，說明輻射處理可以在相對較短的時(shí)間內(nèi)培育出特異的種質(zhì)資源，輻射誘變育種是作物育種取得突破的重要途徑之一[1，12-13]，因此，有必要對各種作物種子的輻射誘變效應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)研究。

全基因測序可以評估輻射誘導(dǎo)基因組發(fā)生變異的概率。林兆松等[13]認(rèn)為秈稻的半致死劑量為350～450 Gy，因此，本試驗(yàn)設(shè)置400 Gy輻射劑量來開展10、60、250 Gy·h-13個(gè)不同劑量率的試驗(yàn)，以評估在半致死劑量水平上不同劑量率對全基因組發(fā)生變異概率的影響。測序結(jié)果顯示，不同劑量率對于DNA的堿基插入、缺失等影響未達(dá)到顯著水平，但變異概率仍有比較明顯的差異。γ輻照導(dǎo)致的堿基排列差異直接導(dǎo)致基因的改變，從而導(dǎo)致性狀的改變。相同劑量下，較低劑量率處理意味著輻射處理的時(shí)間延長，植株成株后株高較低，而高劑量輻射采用低劑量率處理也無明顯的負(fù)面效應(yīng)；高劑量率處理時(shí)間短，植株結(jié)實(shí)率較低，變異率較高。因此，實(shí)際操作中可根據(jù)實(shí)際情況選擇高劑量率或低劑量率。目前，科技部已經(jīng)推出“主要農(nóng)作物種質(zhì)定向誘變技術(shù)”重大專項(xiàng)研究。在進(jìn)行不同劑量對水稻不同品種類型輻射誘變效應(yīng)研究的基礎(chǔ)上，開展不同劑量率的誘變效應(yīng)研究，結(jié)合基因組學(xué)的方法進(jìn)行評估，可以深入地了解γ射線輻射的誘變效應(yīng)機(jī)理，為輻射誘變提供更多支撐。

本研究表明，137Cs-γ射線對水稻種子具有較強(qiáng)的誘變效應(yīng)，不同遺傳背景的品種之間對輻射敏感性表現(xiàn)出一定的差異。較高劑量輻射下，低劑量率(10 Gy·h-1)的處理，對浙1613和浙粳100水稻種子的成苗率影響顯著；350 Gy和450Gy較高劑量處理，劑量率為250 Gy·h-1的浙1613和浙粳100苗高均高于10和60 Gy·h-1處理；450 Gy輻射劑量處理下，60和250 Gy·h-1處理的浙粳100根長與根數(shù)高于10 Gy·h-1處理。較高劑量下，低劑量率處理對2個(gè)品種的株高影響更明顯，但高劑量率對結(jié)實(shí)率影響更大。全基因測序評估可能變異率結(jié)果顯示，不同劑量率處理誘發(fā)的基因組變異存在差異，且隨劑量率增加而增加。

總之，在較高劑量輻射處理后，低劑量率與高劑量率間的輻射效應(yīng)差異較大。結(jié)合形態(tài)學(xué)與基因組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)較高劑量輻射下，低劑量率處理水稻成株后株高下降，高劑量率處理結(jié)實(shí)率大幅下降，變異概率增加。這些結(jié)果對于進(jìn)一步提升水稻輻射誘變育種技術(shù)，為新品種的繁育提供更為豐富的突變材料具有積極的意義。