方福如, 蔡濤

(湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)院,湖南 衡陽 421001)

肝纖維化是復(fù)雜的病理生理過程。當(dāng)肝臟受到病毒、酒精、藥物等各種損傷性刺激時(shí),肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過多沉積,破壞肝臟原有的結(jié)構(gòu)和功能。肝纖維化可發(fā)展為肝硬化、門靜脈高壓甚至肝細(xì)胞癌[1]。及時(shí)的干預(yù)和抗纖維化治療,可使肝纖維化逆轉(zhuǎn)[2],從而可以大大地降低肝硬化、肝癌的發(fā)生。

肝纖維化是世界范圍內(nèi)的衛(wèi)生難題[3],探索肝纖維化的有效治療方法迫在眉睫,近年來,國內(nèi)外學(xué)者致力于此方面的研究[4],但引發(fā)肝纖維化的機(jī)制非常復(fù)雜,故針對(duì)病因的治療非常困難,根據(jù)不同情況定制肝纖維化患者的個(gè)性化治療尤為重要,不同藥物聯(lián)合治療肝纖維化成為未來肝纖維化治療的主導(dǎo)趨勢(shì)。西醫(yī)的針對(duì)病因治療的方法可以在一定程度上抑制肝纖維化[5]。但是,肝纖維化機(jī)制一旦啟動(dòng),往往呈主動(dòng)性進(jìn)展,單一的病因治療并不能完全抑制炎癥,效果局限[6],因此針對(duì)纖維組織增生與降解的抗肝纖維化治療非常必要。

近年來的研究和應(yīng)用實(shí)踐已經(jīng)表明,中醫(yī)藥在治療肝病尤其是防治肝纖維化領(lǐng)域顯示出較大的療效優(yōu)勢(shì)。Huang等[7]通過研究發(fā)現(xiàn)陽桃根提取物能改善四氯化碳誘導(dǎo)大鼠的肝纖維化,Liu等[8]研究發(fā)現(xiàn)疏肝活血化瘀方通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1/Smad信號(hào)通路減輕四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化。木香有行氣止痛、溫中和胃之功效,木香或木香配伍中藥臨床上可用于治療消化系統(tǒng)疾病[9]。木香為疏肝和胃顆粒的主藥之一,其主要活性成分為去氫木香內(nèi)酯(Dehydrocostus Lactone,DHL)[10]。去氫木香內(nèi)酯是倍半萜類化合物,具有抗炎[11]、抗腫瘤[12]以及抗菌[13]等藥理活性,已引起人們的關(guān)注[14]。有研究表明,去氫木香內(nèi)酯具有抑制肝癌的作用[15,16]。孫文利等[17]證明,去氫木香內(nèi)酯可以減輕大鼠肝臟壞死性病理改變,對(duì)大鼠肝臟損傷有較好的保護(hù)作用。但是去氫木香內(nèi)酯抗肝纖維化的作用及其相關(guān)機(jī)制方面尚未見報(bào)道。

因此,本研究擬通過探索去氫木香內(nèi)酯對(duì)四氯化碳造模建立的肝纖維化小鼠的抗纖維化保護(hù)作用,為肝纖維化的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

40只6～8周齡 C57BL/6J雄性小鼠,SPF級(jí),購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 藥品與試劑

去氫木香內(nèi)酯、四氯化碳、橄欖油由麥克林公司提供;天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒購于南京建成生物工程研究所,伊紅、蘇木素、天狼星紅染色試劑盒均來自上海威奧生物科技有限公司;α-SMA抗體、CollagenⅠ抗體來源于美國Proteintech Group公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)

分組:將40只雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為4組,分別為對(duì)照組、模型組、DHL低劑量組(5 mg/kg)、DHL高劑量組(20 mg/kg),每組10只。造模:腹腔注射溶液,每周2次,持續(xù)8周;對(duì)照組:腹腔注射橄欖油溶液(5 mL/kg);模型組:腹腔注射20%的CCl4橄欖油溶液,給藥體積(5 mL/kg)。干預(yù):于腹腔注射造模第5周進(jìn)行分組干預(yù),DHL低劑量組灌胃5 mg/kg劑量的藥物,DHL高劑量組灌胃20 mg/kg劑量的藥物,每天1次,持續(xù)4周;對(duì)照組、模型組給予等容量的生理鹽水。最后一次給藥后,禁食24 h,麻醉處死,眼眶取血。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 肝臟組織外觀及肝體比

觀察肝臟外觀形態(tài)、組織彈性、表面質(zhì)感等;稱量小鼠體重、肝臟體重,根據(jù)公式(肝體比=肝重/體重×100%)計(jì)算出肝體比并進(jìn)行比較。

1.4.2 檢測(cè)血清肝功能

最后一次給藥后,禁食24 h,麻醉處死后,采血后靜置分離獲取血清,采用全自動(dòng)生化免疫分析儀檢測(cè)血清中ALT和AST的含量。

1.4.3 肝臟組織病理學(xué)觀察

取肝右葉同一部位新鮮組織,常規(guī)固定、石蠟包埋后,采用蘇木精伊紅(HE)染色。經(jīng)烤片、切片脫蠟、蘇木素染色、伊紅染色、梯度酒精脫水、中性樹膠封片后,光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟組織病理形態(tài)變化。

1.4.4 天狼星紅膠原染色

取肝右葉同一部位新鮮組織,常規(guī)固定、石蠟包埋后,采用天狼星紅染色。經(jīng)烤片、切片脫蠟至水、天狼星紅染色液染色、沖洗、吹干、透明、封片,光學(xué)顯微鏡觀察各組小鼠肝組織中膠原纖維沉積情況。

1.4.5 免疫組化(IHC)染色檢測(cè)α-SMA、Collagen Ⅰ在小鼠肝臟的表達(dá)情況

取肝右葉同一部位新鮮組織,常規(guī)固定、石蠟包埋后,組織切片,經(jīng)烤片、切片脫蠟、熱修復(fù)抗原、滅活內(nèi)源性酶、孵育一抗(α-SMA、CollagenⅠ)、孵育二抗、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、各級(jí)酒精脫水、中性樹膠封片、顯微鏡觀察α-SMA以及CollagenⅠ在各組小鼠肝臟的表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用IBM SPSS Statistics 25.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝臟組織外觀

肝臟組織外觀(圖1)顯示,對(duì)照組小鼠肝臟組織表面光滑、呈紅褐色;模型組小鼠肝臟面不光滑、表面顆粒多、呈灰黃色;與模型組比較,低、高劑量組小鼠肝臟表面欠光滑、有些許顆粒,顏色偏紅。

圖1 對(duì)照組、模型組、DHL低劑量組、DHL高劑量組肝臟形態(tài)Figure 1 Liver morphology of control group, model group, DHL low dose group and DHL high dose group

2.2 肝體比與肝功能

與對(duì)照組相比,CCl4模型組的肝體比、ALT、AST明顯升高(P<0.05),提示CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型造模成功;與模型組比較,DHL低劑量組、HL高劑量組肝體比、ALT、AST明顯下降(P<0.05),且高劑量組各指標(biāo)差異較低劑量組更明顯(P<0.05),有劑量依賴性,見表1。

表1 小鼠肝體比與肝功能指標(biāo)比較Table 1 Comparison of liver body ratio and liver function indexes in mice

2.3 HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果如圖2所示。對(duì)照組肝組織中央靜脈位于肝小葉的中部,肝細(xì)胞核大而圓,連接緊密,以中央靜脈為中心,放射狀排列,少量炎癥細(xì)胞浸潤;CCl4誘導(dǎo)的模型組肝細(xì)胞排列紊亂,肝組織中央靜脈周圍可見較多纖維組織增生,甚至形成假小葉;DHL低劑量及高劑量組小鼠肝臟組織病理改變均有不同程度的改善。

圖2 各組小鼠肝組織HE染色結(jié)果(400×)Figure 2 HE staining results of liver tissues of mice in each group(400×)

2.4 天狼星紅染色結(jié)果

天狼星紅染色結(jié)果如圖3所示。與對(duì)照組相比,模型組膠原纖維表達(dá)面積顯著增加,去氫木香內(nèi)酯低劑量組、高劑量組小鼠肝臟組織膠原表達(dá)有明顯改善,高劑量組更為明顯。

圖3 各組小鼠肝組織天狼星紅染色結(jié)果(400×)Figure 3 The results of Sirius scarlet staining in the liver tissues of mice in each group(400×)

2.5 IHC檢測(cè)α-SMA、CollagenⅠ在小鼠肝臟的表達(dá)情況

(1)α-SMA抗體染色結(jié)果(圖4):與對(duì)照組相比,模型組小鼠肝組織中α-SMA蛋白表達(dá)增加,去氫木香內(nèi)酯低劑量組、高劑量組肝組織中α-SMA蛋白表達(dá)出現(xiàn)了不同程度的下降。

圖4 各組小鼠肝組織α-SMA抗體染色結(jié)果(400×)Figure 4 Staining results of α-SMA antibody in liver tissues of mice in each group(400×)

(2)CollagenⅠ抗體染色結(jié)果(圖5):與對(duì)照組相比,模型組小鼠肝組織中CollagenⅠ蛋白表達(dá)增加,去氫木香內(nèi)酯低劑量組以及高劑量組肝組織中CollagenⅠ蛋白表達(dá)出現(xiàn)不同程度的下降。

圖5 各組小鼠肝組織CollagenⅠ抗體染色結(jié)果(400×)Figure 5 Staining results of CollagenⅠantibody in liver tissues of mice in each group (400×)

3 討論與結(jié)論

肝纖維化是由各種慢性肝病所致細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積的病理過程,早期有效的干預(yù)可使肝纖維化逆轉(zhuǎn),這亦是預(yù)防慢性肝病進(jìn)展為肝硬化、肝癌的關(guān)鍵。病因的治療可在一定程度上減輕對(duì)肝臟的損傷,但是肝纖維化機(jī)制一旦啟動(dòng),往往呈主動(dòng)性進(jìn)展,單一的病因治療不能完全抑制炎癥,效果有限,因此,針對(duì)纖維組織的增生和降解的抗肝纖維化治療是非常必要的[6]。

本研究發(fā)現(xiàn),去氫木香內(nèi)酯能夠降低CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化水平,改善其肝功能。去氫木香內(nèi)酯作為木香的成分之一,可能為肝纖維化的治療提供一種新的治療方法。CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化是肝纖維化研究中常用的模型,研究中模型組的肝體比、ALT、AST明顯升高,病理可見肝細(xì)胞排列紊亂,肝組織中央靜脈周圍可見較多纖維組織增生,甚至形成假小葉,膠原纖維表達(dá)面積顯著增加,均提示CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型造模成功。DHL低劑量組、DHL高劑量組肝體比、ALT、AST明顯下降(P<0.05),且高劑量組各指標(biāo)差異較低劑量組更明顯(P<0.05);各劑量組小鼠肝臟組織病理變化得到明顯的改善,肝組織中α-SMA蛋白、CollagenⅠ蛋白表達(dá)出現(xiàn)不同程度的下降;均提示去氫木香內(nèi)酯能夠改善CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝功能和纖維化水平,具有保護(hù)作用。

目前,研究表明,肝星狀細(xì)胞(Hepatic Stellate Cell,HSC)的激活是肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展的中心環(huán)節(jié),各種損傷因素導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞的增殖和活化[18];活化的肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,分泌α-SMA,導(dǎo)致大量ECM的合成增加;產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix,ECM),而CollagenⅠ是HSCs活化后釋放的最主要的細(xì)胞外基質(zhì)[19]。本研究通過免疫組化染色探究了DHL對(duì)小鼠肝組織中CollagenⅠ、α-SMA的影響,結(jié)果顯示,模型組小鼠肝組織中CollagenⅠ、α-SMA蛋白的表達(dá)水平均較對(duì)照組顯著升高,提示小鼠肝纖維化模型建模成功。

傳統(tǒng)治療肝纖維化的研究中表明,TGF-β1是促進(jìn)肝纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞因子,可通過多種途徑刺激肝星狀細(xì)胞活化,促進(jìn)肝纖維化[20],同時(shí),TGF-β1的釋放會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)炎癥的發(fā)展、抑制免疫反應(yīng);Smad蛋白是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵下游信號(hào)分子,TGF-β通過提高Smad2/3的磷酸化水平促進(jìn)肝纖維化[21]。去氫木香內(nèi)酯對(duì)肝星狀細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞周期是否有影響,其中的內(nèi)在分子機(jī)制如何,是否通過調(diào)控TGF-β1/Smad2/Smad3信號(hào)通路防治肝纖維化的發(fā)生發(fā)展,是我們深入探索的方向,有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,去氫木香內(nèi)酯對(duì)四氯化碳造模建立的肝纖維化小鼠具有抗纖維化作用。本研究從肝臟生化、病理、免疫組化的層面進(jìn)一步證明去氫木香內(nèi)酯對(duì)肝纖維化的改善作用,為肝纖維化的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為肝纖維化的研究提供理論依據(jù)。