劉琳 任燕 陳茂盛 王敏敏

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是由多種疾病引起的慢性腎臟結(jié)構(gòu)與功能不可逆損害的共同終點(diǎn)。CKD 的共同病理表現(xiàn)是腎臟纖維化，其特點(diǎn)是腎小球硬化、腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化[1]。在各種病因?qū)е碌腃KD 背景下，腎小管上皮細(xì)胞合成細(xì)胞因子、活性氧等大量炎癥產(chǎn)物，招募炎癥細(xì)胞至腎間質(zhì)并啟動(dòng)與間質(zhì)成纖維細(xì)胞的相互作用。隨著間質(zhì)纖維化的發(fā)展，損傷的腎小管上皮細(xì)胞失去再生能力并發(fā)生凋亡從而導(dǎo)致腎小管萎縮和無(wú)功能腎小球的形成[2]。目前延緩腎臟纖維化的治療手段十分有限。2007 年Rinn 等[3]首先通過(guò)微陣列分析發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）Hotair 位于第12條染色體上，長(zhǎng)度約為2.2 kb。Hotair 參與調(diào)控多種生物學(xué)行為，如細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞遷移、上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、腫瘤進(jìn)展等[4]。Yu 等[5]研究表明Hotair 在肝纖維化中表達(dá)增加，可能參與肝纖維化的調(diào)控，但是其在腎臟纖維化中的作用還不是十分清楚。表觀遺傳修飾在腎臟纖維化中發(fā)揮重要作用[6]。多梳抑制復(fù)合體2（polycomb repressive complex 2，PRC2）是一種重要的染色質(zhì)修飾復(fù)合物，由包括胚胎外胚層發(fā)育蛋白（embryonic ectoderm development，EED）、Zeste12 同源物抑制因子（suppressor of Zeste 12 homolog，SUZ12）、Zeste增強(qiáng)子同源物2（enhancer of Zeste homolog 2，EZH2）的核心亞基及其他輔助因子組成[7]。既往研究發(fā)現(xiàn)Hotair 可與PRC2 及賴氨酸特異性去甲基化酶1（histone lysine-specific demethylase 1，LSD1）結(jié)合，從而作為分子支架協(xié)調(diào)PRC2 和LSD1 靶向染色質(zhì)進(jìn)行表觀遺傳調(diào)控[8]。本研究通過(guò)在CKD 小鼠模型中干擾lncRNA Hotair 的表達(dá)，以探究其在腎臟纖維化中的作用及機(jī)制，為尋找新的腎臟纖維化治療方法提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF 級(jí)C57BL/6J 小鼠36 只，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。小鼠予12 h光照-12 h黑夜循環(huán)，自由飲食和飲水，隔日換墊料。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)（批準(zhǔn)文號(hào)：2017KT041）。

1.2 試劑和儀器 RNA 提取試劑盒（貨號(hào)：AG21024）購(gòu)自中國(guó)艾科瑞生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：R333）購(gòu)自南京諾唯贊公司；qRT-PCR 試劑盒（貨號(hào)：RK21203）購(gòu)自武漢ABclonal 公司。SUZ12（貨號(hào)：ab175187，兔抗）、LSD1（貨號(hào)：ab129195，兔抗）、EZH2（貨號(hào)：ab307646，兔抗）、EED（貨號(hào)：ab240650，兔抗）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）（貨號(hào)：ab5831，兔抗）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）（貨號(hào)：ab231303，兔抗）、膠原蛋白1A1（collagen Ⅰα1，COL1A1）（貨號(hào)：ab260043，兔抗）、膠原蛋白4A1（collagen Ⅳα1，COL4A1）（貨號(hào)：ab6586，兔抗）抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（貨號(hào)：AF7021，兔抗）和羊抗兔二抗（貨號(hào)：S0001）均購(gòu)自美國(guó)Affinity 公司；肌酐檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：EKF60677）購(gòu)自加拿大Biomatik 公司；尿素氮檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：BC1535）購(gòu)自中國(guó)索萊寶公司。Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；VeritiPro PCR 儀和ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems 公司；DM IL LED 倒置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica 公司；FluorChem E 成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Techne公司。

1.3 方法

1.3.1 模型制備、分組與處理 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、CKD 組、CKD+短發(fā)夾RNA-對(duì)照（hort hairpin RNA-control，sh-Ctrl）組、CKD+短發(fā)夾RNA-Hotair（short hairpin RNA-Hotair，sh-Hotair）組4 組，每組9 只。對(duì)照組喂食正常飼料，CKD 組、CKD+sh-Ctrl 組、CKD+sh-Hotair 組均予0.2%腺嘌呤飼料喂養(yǎng)造模，造模6 周后進(jìn)行下一步處理。CKD+sh-Ctrl 組和CKD+sh-Hotair 組分別予尾靜脈注射100 μL（1011基因拷貝）包裝了對(duì)照shRNA 和HotairshRNA 的腺相關(guān)病毒，對(duì)照組和CKD 組予尾靜脈注射100 μL 0.9%氯化鈉注射液。

1.3.2 標(biāo)本留取 小鼠造模6 周后開始每周測(cè)量1 次體重，觀察8 周后予水合氯醛麻醉，經(jīng)心臟取血0.8～1.0 mL，室溫析出血清后，3 000 r/min 離心10 min，取上層血清。頸椎脫位法處死小鼠后進(jìn)行解剖，迅速取出小鼠腎臟，去除腎包膜。取1/4 腎組織清洗后以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片行后續(xù)HE 染色和Masson 染色。取1/4 腎組織，將腎皮質(zhì)液氮冷凍研磨提取RNA。另1/2 腎組織，取腎皮質(zhì)保存于-80 ℃冰箱提取蛋白行后續(xù)檢測(cè)。

1.3.3 肌酐水平檢測(cè) 根據(jù)肌酐檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行如下操作：配置標(biāo)準(zhǔn)品，加入酶標(biāo)板。取5 μL 小鼠血清加入待測(cè)樣品孔中。每孔加入225 μL 酶A 溶液，混合均勻后于37 ℃孵育5 min，酶標(biāo)儀讀取546 nm處的吸光度A1。每孔加入75 μL 酶B 溶液，37 ℃孵育5 min，酶標(biāo)儀讀取546 nm處的吸光度A2。肌酐水平（μmol/L）=樣品（A2-A1）/標(biāo)準(zhǔn)品（A2-A1）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 尿素氮水平檢測(cè) 根據(jù)尿素氮檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行如下操作：配置尿素氮標(biāo)準(zhǔn)品，將標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)血清樣品加入離心管，分別加入試劑一60 μL 和試劑二110 μL，混勻后于37 ℃孵育10 min。隨后每孔加入試劑三120 μL 和試劑四90 μL，混勻后于37 ℃孵育30 min，加入蒸餾水90 μL。從上述反應(yīng)液中吸取200 μL于酶標(biāo)板測(cè)定630 nm 處吸光度。根據(jù)試劑盒提供公式計(jì)算尿素氮水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.3.5 Hotair 及PRC2 復(fù)合物（EZH2、SUZ12、EED）、LSD1 mRNA 表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR 法。取腎皮質(zhì)按照RNA 提取試劑盒說(shuō)明書提取RNA，使用NanoDrop 測(cè)定RNA 的濃度與純度。此后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用qRT-PCR 試劑盒進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)Hotair 及其他基因的表達(dá)，以GAPDH 為內(nèi)參。 反應(yīng)體系為：2×SYBR Green Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL，共20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，隨后95 ℃5 s 變性，60 ℃30 s 擴(kuò)增，共循環(huán)40 次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算Hotair及其他基因mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.6 PRC2 復(fù)合物、LSD1 及腎皮質(zhì)纖維化相關(guān)蛋白COL1A1、COL4A1、α-SMA 和E-cadherin 表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot 法。取保存的腎皮質(zhì)稱量后加入裂解液，冰上超聲破碎組織，13 000 r/min 離心5 min，取上清液行BCA 蛋白定量。以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳法分離目的蛋白，300 mA 恒流下轉(zhuǎn)膜90 min至聚偏二氟乙烯膜，3%BSA 封閉1 h 后按說(shuō)明書稀釋倍數(shù)加入對(duì)應(yīng)的SUZ12、LSD1、EZH2、EED、α-SMA、E-cadherin、COL1A1、COL4A1 和GAPDH 抗體，4 ℃過(guò)夜孵育。洗滌3 次后于相應(yīng)的二抗中孵育1 h 后再次洗滌3 次，隨后進(jìn)行顯影，得到對(duì)應(yīng)條帶，并使用Image J 軟件評(píng)估各個(gè)泳道的灰度值。蛋白相對(duì)表達(dá)水平=各組灰度值/對(duì)照組平均灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0 和SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干擾lncRNA Hotair 對(duì)CKD 小鼠體重與腎功能的影響 與對(duì)照組比較，CKD 組和CKD+sh-Ctrl 組小鼠的體重隨年齡增長(zhǎng)顯著降低，血清肌酐和尿素氮水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。與CKD+sh-Ctrl 組比較，CKD+sh-Hotair 組小鼠體重有明顯升高（均P＜0.01），但仍低于對(duì)照組；血清肌酐和尿素氮水平均降低（均P＜0.01），但仍高于對(duì)照組，見圖1。

圖1 干擾lncRNA Hotair 對(duì)CKD 小鼠體重與腎功能的作用（A：4 組小鼠體重的變化；B：4 組小鼠肌酐水平比較；C：4 組小鼠尿素氮水平比較）

2.2 干擾lncRNA Hotair 對(duì)CKD 小鼠模型腎臟形態(tài)及組織學(xué)的影響 與對(duì)照組比較，CKD 組小鼠腎臟明顯萎縮，而CKD+sh-Hotair 組小鼠的腎臟大小及形態(tài)有明顯改善，見圖2A（插頁(yè)）。HE 染色和Masson 染色顯示CKD 組小鼠腎組織部分小管擴(kuò)張，腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎間質(zhì)纖維化，而CKD+sh-Hotair 組較CKD+sh-Ctrl 組明顯改善，見圖2B-C（插頁(yè)）。

圖2 干擾lncRNA Hotair 對(duì)CKD 小鼠模型腎臟形態(tài)及組織學(xué)的影響（A：4 組小鼠腎臟形態(tài)；B：4 組小鼠腎臟HE 染色；C：4 組小鼠腎臟Masson 染色）

2.3 4 組小鼠腎皮質(zhì)lncRNA Hotair 表達(dá)水平比較與對(duì)照組比較，CKD 組小鼠腎皮質(zhì)lncRNA Hotair 表達(dá)水平升高（P＜0.01）。與CKD+sh-Ctrl 組比較，CKD+sh-Hotair 組小鼠腎皮質(zhì)lncRNA Hotair 表達(dá)水平降低（P＜0.01），敲低效果滿意，見圖3。

圖3 4 組小鼠腎皮質(zhì)lncRNA Hotair 表達(dá)水平比較

2.4 干擾lncRNA Hotair對(duì)腎皮質(zhì)纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，CKD 組小鼠腎皮質(zhì)COL1A1、COL4A1、α-SMA 蛋白表達(dá)水平均升高，而E-cadherin蛋白表達(dá)水平下降。與CKD+sh-Ctrl 組比較，CKD+sh-Hotair 組小鼠腎皮質(zhì)COL1A1、COL4A1、α-SMA 蛋白表達(dá)水平均下降，E-cadherin 蛋白表達(dá)水平恢復(fù)，見圖4。

圖4 干擾lncRNA Hotair 對(duì)腎皮質(zhì)纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

2.5 干擾lncRNA Hotair 對(duì)PRC2 復(fù)合物和LSD1 的影響 與對(duì)照組比較，CKD 組小鼠腎皮質(zhì)LSD1、EZH2、EED mRNA 和蛋白表達(dá)水平均升高，而SUZ12 mRNA和蛋白表達(dá)水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。與CKD+sh-Ctrl 組比較，CKD+sh-Hotair 組小鼠腎皮質(zhì)LSD1、EZH2、EED mRNA 和蛋白表達(dá)水平均降低，SUZ12 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見圖5。

圖5 干擾lncRNA Hotair 對(duì)PRC2 和LSD1 的影響（A：4 組小鼠腎皮質(zhì)SUZ12 mRNA 表達(dá)水平比較；B：4 組小鼠腎皮質(zhì)LSD1 mRNA表達(dá)水平比較；C：4 組小鼠腎皮質(zhì)EZH2 mRNA 表達(dá)水平比較；D：4 組小鼠腎皮質(zhì)EED mRNA 表達(dá)水平比較；E：4 組小鼠腎皮質(zhì)SUZ12、LSD1、EZH2、EED 蛋白表達(dá)的電泳圖）

3 討論

lncRNA 是一類長(zhǎng)度超過(guò)200 nt 的非編碼RNA 分子，通過(guò)介導(dǎo)染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、蛋白的翻譯和翻譯后的蛋白修飾等發(fā)揮作用[9]。目前已發(fā)現(xiàn)多種lncRNA 參與調(diào)控糖尿病腎病[10-11]、間質(zhì)性腎炎[12]、急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）[13]等疾病的腎臟纖維化過(guò)程。lncRNA Hotair 在多種癌癥[14-15]和心臟[16]、肝臟纖維化[5]中表達(dá)上調(diào)，已被證明是一種潛在的治療靶點(diǎn)，但是其在腎臟纖維化中的作用仍有待進(jìn)一步探索。

本研究構(gòu)建了腺嘌呤誘導(dǎo)的CKD 小鼠模型[17]，發(fā)現(xiàn)Hotair 表達(dá)上調(diào)，與Zhou 等[18]在UUO 小鼠模型中發(fā)現(xiàn)Hotair 表達(dá)上調(diào)相一致。通過(guò)尾靜脈注射腺相關(guān)病毒敲低Hotair，腎纖維化病理及生化指標(biāo)均顯著改善，且可減少細(xì)胞外基質(zhì)蛋白COL1A1、COL4A1 和α-SMA的表達(dá)，說(shuō)明其在腎纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

此前研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳修飾在腎臟纖維化中發(fā)揮重要作用[6]。PRC2 是一種重要的染色質(zhì)修飾復(fù)合物，由包括EED、SUZ12、EZH2 的核心亞基及其他輔助因子組成[7]。PRC2 可以在組蛋白H3 的27 位賴氨酸上沉積一個(gè)或多個(gè)甲基（分別為H3K27me1、H3K27me2和H3K27me3），并通過(guò)適當(dāng)?shù)幕虺聊瑏?lái)發(fā)揮功能[7]。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)Hotair 可招募PRC2 至靶基因，從而通過(guò)促進(jìn)甲基化使基因沉默[14]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)Hotair 的5'端與PRC2 結(jié)合，而3'端與LSD1 結(jié)合，從而作為分子支架協(xié)調(diào)PRC2 和LSD1 靶向染色質(zhì)，偶聯(lián)組蛋白H327位賴氨酸甲基化和4 位賴氨酸去甲基化[8]。EZH2 在糖尿病腎病[19-20]、高尿酸誘導(dǎo)的CKD 腎臟纖維化[21]中發(fā)揮重要作用。EZH2 在UUO 小鼠模型和CKD 患者培養(yǎng)的腎成纖維細(xì)胞中高表達(dá)，可通過(guò)下調(diào)Smad7 和PTEN的表達(dá)激活促纖維化信號(hào)通路[22]。在AKI 向CKD 轉(zhuǎn)變的過(guò)程中，抑制EZH2 可減輕EMT 并阻斷M2 巨噬細(xì)胞極化來(lái)改善AKI 后腎臟纖維化[23]。本研究發(fā)現(xiàn)EZH2、EED、LSD1 在腺嘌呤誘導(dǎo)的CKD 小鼠腎組織中也高表達(dá)，與其他研究結(jié)果一致，并且敲低Hotair 能部分抑制其表達(dá)并緩解腎臟纖維化，說(shuō)明Hotair 可能通過(guò)其分子支架作用調(diào)控表觀遺傳修飾在CKD 纖維化進(jìn)程中發(fā)揮作用。

綜上所述，lncRNA Hotair 在CKD 小鼠模型中表達(dá)升高，敲低Hotair 可緩解腎臟纖維化，可能與Hotair 作為PRC2 和LSD1 的分子支架介導(dǎo)的表觀遺傳修飾相關(guān)，本研究為腎臟纖維化的治療提供了新的思路和潛在靶點(diǎn)。