黃建成,李紅英,劉 佳,李青泉,張會(huì)軍,李小兵

近年,各種心臟病的發(fā)病率和病死率持續(xù)上升,已成為人類健康的頭號(hào)殺手,如先天性心臟病和缺血性心臟病。及時(shí)恢復(fù)心臟供血是預(yù)防心臟病最有效的手段,但恢復(fù)供血后,心臟反而加重?fù)p傷的現(xiàn)象稱為缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)損傷[1]。炎癥、自噬、細(xì)胞凋亡、鈣超負(fù)荷、神經(jīng)體液激活和氧化應(yīng)激等被認(rèn)為是I/R損傷的主要原因[2]。因此,深入探討心肌I/R損傷,尋找新的戰(zhàn)略或藥物具有重要意義。微小RNA(microRNA,miRNA)參與心肌I/R損傷的病理生理學(xué),其中,miR-26a與心肌細(xì)胞密切相關(guān)[3]。敲低miR-26a可顯著降低I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡,改善大鼠心臟功能[4]。miR-26a-3p對(duì)急性胰腺炎胰腺細(xì)胞增殖和凋亡有調(diào)控作用[5],但關(guān)于心臟I/R損傷的作用未見報(bào)道。結(jié)合生物信息學(xué)軟件的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)存活素(Survivin)可能是miR-26a-3p的靶基因。Survivin作為凋亡抑制蛋白,參與I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[6]。該實(shí)驗(yàn)以大鼠心肌細(xì)胞(H9c2)為對(duì)象, 用缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模擬I/R損傷,探討miR-26a-3p對(duì)心肌I/R損傷的影響和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料H9c2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù);Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan miRNA定量PCR試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)、TB Green? Fast qPCR Mix購(gòu)自日本TAKARA公司;miR-26a-3p inhibitor及其陰性對(duì)照inhibitor NC、miR-26a-3p mimics及其陰性對(duì)照mimics NC、Survivin基因siRNA干擾質(zhì)粒(si-Survivin)及其陰性對(duì)照si-NC均購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)購(gòu)自美國(guó)MCE公司;Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體、B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體、活化型半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)抗體、Survivin抗體和GAPDH抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;Annexin V-FITC/ PI熒光雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;Dual-Lumi雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及心肌細(xì)胞H/R損傷模型建立 將復(fù)蘇的H9c2細(xì)胞培養(yǎng)于高糖細(xì)胞培養(yǎng)基(含100 U/L青霉素、100 U/L鏈霉素、10%胎牛血清)中,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),進(jìn)行細(xì)胞傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9c2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至70%融合度后,放入37 ℃含94%N2、5%CO2和1%O2的培養(yǎng)箱內(nèi)缺氧培養(yǎng)6 h,再放置在37 ℃含95%O2和5%CO2的培養(yǎng)箱進(jìn)行復(fù)氧培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9c2細(xì)胞使用胰酶消化后接種于6孔板中(4×105個(gè)/孔),細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí),根據(jù)Lipofectamin?2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將miR-26a-3p inhibitor及其陰性對(duì)照inhibitor NC、Survivin基因siRNA干擾質(zhì)粒(si-Survivin)及其陰性對(duì)照si-NC共轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞中,分為inhibitor NC組、inhibitor組、inhibitor+si-NC組和inhibitor+si-Survivin組,另設(shè)置空白對(duì)照組(blank組)。轉(zhuǎn)染48 h后,qRT-PCR和Western blot檢測(cè)驗(yàn)證細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3分組處理 (1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9c2細(xì)胞進(jìn)行H/R干預(yù),分組如下:常氧組:95%O2、5%CO2條件下培養(yǎng);H6R2組:缺氧6 h復(fù)氧2 h;H6R4組:缺氧6 h復(fù)氧4 h;H6R8組:缺氧6 h復(fù)氧8 h;H6R12組:缺氧6 h復(fù)氧12 h。(2)經(jīng)試驗(yàn)(1)確定最佳復(fù)氧時(shí)間后,將轉(zhuǎn)染后的H9c2細(xì)胞進(jìn)行H/R干預(yù),分組如下:對(duì)照組(Control):未經(jīng)轉(zhuǎn)染的H9c2細(xì)胞在95%O2、5%CO2條件下培養(yǎng);缺氧/復(fù)氧組(H/R):未經(jīng)轉(zhuǎn)染的H9c2細(xì)胞進(jìn)行缺氧6 h復(fù)氧4 h;H/R+inhibitor NC組:轉(zhuǎn)染miR-26a-3p inhibitors NC的H9c2細(xì)胞進(jìn)行缺氧6 h復(fù)氧4 h;H/R+inhibitor組:轉(zhuǎn)染miR-26a-3p inhibitor的H9c2細(xì)胞進(jìn)行缺氧6 h復(fù)氧4 h;H/R+inhibitor+si-NC組:轉(zhuǎn)染miR-26a-3p inhibitor和si-Survivin-NC的H9c2細(xì)胞進(jìn)行缺氧6 h復(fù)氧4 h;H/R+inhibitor+si-Survivin組:轉(zhuǎn)染miR-26a-3p inhibitor和si-Survivin的H9c2細(xì)胞進(jìn)行缺氧6 h復(fù)氧4 h。

1.2.4CCK-8檢測(cè) 在96孔板中接種100 μl/孔的細(xì)胞懸液(2×107個(gè)/L),另設(shè)空白組接種培養(yǎng)基溶液,每組3重復(fù)。分組處理后,每孔加入10 μl CCK-8溶液,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h;用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度值(OD)。細(xì)胞增殖活性以細(xì)胞存活率表示,細(xì)胞存活率(%)=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)×100%。

1.2.5比色法檢測(cè) 分組處理后,分別收集細(xì)胞上清液和細(xì)胞懸液(1×108個(gè)/L),按照試劑盒說明書檢測(cè)各組細(xì)胞中SOD活性、MDA含量及上清液中LDH釋放量。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)檢測(cè) 分組處理后收集細(xì)胞沉淀,分別加入TRIzol試劑提取總RNA,經(jīng)分光光度計(jì)鑒定,總RNA濃度和純度合格。qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-26a-3p的表達(dá):按照TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取2 μg cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增條件按照TaqMan miRNA定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行,反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35個(gè)循環(huán);qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中Survivin的表達(dá):根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)說明書進(jìn)行操作合成cDNA,按照TB Green?Fast qPCR Mix說明書以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)條件:94 ℃ 30 s,94 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。引物序列:miR-26a-3p引物F:5′-CTAGCG-CGATGCCGAACGTG-3′,R:5′-GCGTGAACGGCCGTGACG-3′;Survivin引物F:5′-GCATGGGTGCCCCG-ACG TTG-3′,R:5′-GCTCCGGCCAGAGGCTCAA-3′;U6引物F:5′-GAACGTGCCGGGCGTGCAG-3′,R:5′-GGTGAACGCCGTGGACGCC-3′;β-actin引物F:5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′,R:5′-GGGCAC-GAAGGCTCATCATT-3′。miR-26a-3p以U6為內(nèi)參,Survivin以β-actin為內(nèi)參,采用2-△△Ct法計(jì)算miR-26a-3p和Survivin mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7Western blot檢測(cè) 分組處理后收集細(xì)胞沉淀,進(jìn)行蛋白提取并定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜,進(jìn)行5%脫脂奶粉封閉1 h,加入一抗Survivin抗體(1 ∶1 000)、Bax抗體(1 ∶1 000)、Bcl-2抗體(1 ∶1 000)、cleaved caspase-3抗體(1 ∶1 000)和GAPDH抗體(1 ∶1 000),于4 ℃孵育過夜。加入以辣根酶標(biāo)記的二抗(1 ∶10 000)室溫振蕩孵育1 h,使用混合發(fā)光液曝光顯色,放入凝膠成像儀成像,采用Image J軟件計(jì)算蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參蛋白,計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白的灰度值/內(nèi)參蛋白的灰度值。

1.2.8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 使用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化收集分組處理后的細(xì)胞,取5×105個(gè)重懸細(xì)胞,加入500 μl稀釋的1×Annexin V Binding Buffer工作液重懸細(xì)胞,再依次加入 5 μl Annexin V-FITC和10 μl碘化丙啶染色液渦旋混勻,室溫避光孵育20 min,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。在散點(diǎn)圖上,細(xì)胞凋亡率(%)=晚期凋亡及壞死的細(xì)胞百分率(Q2-2)+早期凋亡細(xì)胞百分率(Q2-4)。

1.2.9雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) Survivin蛋白由BIRC5基因編碼,查找BIRC5基因序列,利用Target Scan Human 7.1在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-26a-3p和Survivin的靶向結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)序列,設(shè)計(jì)合成野生型Survivin-3′-UTR(Survivin- WT)及突變型Survivin-3′-UTR(Survivin-MUT)片段序列,構(gòu)建Survivin-WT和Survivin-MUT熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將miR-26a-3p mimics、mimics NC、Survivin-WT質(zhì)粒和Survivin-MUT質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9c2細(xì)胞中,共分為4組,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48 h后,加入Cell Lysis Buffer重懸細(xì)胞,收集細(xì)胞裂解物,按照雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作,并使用酶標(biāo)儀分別檢測(cè)螢火蟲和海腎熒光素酶報(bào)告基因活性,相對(duì)熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 H/R誘導(dǎo)對(duì)心肌細(xì)胞增殖活性的影響與常氧組比較,不同復(fù)氧時(shí)間組H9c2細(xì)胞增殖活性降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=196.149,P<0.001),且隨著復(fù)氧時(shí)間的增加,H9c2細(xì)胞增殖活性呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)。與常氧組比較,不同復(fù)氧時(shí)間組H9c2細(xì)胞上清液中LDH釋放量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=870.111,P<0.001),隨著復(fù)氧時(shí)間的增加,H9c2細(xì)胞上清液中LDH釋放量呈現(xiàn)升高后降低的趨勢(shì),而H6R8與H6R12比較,細(xì)胞增殖活性[(72.67±3.06)%vs(69.00±2.65)%]和LDH釋放量[(72.02±1.90)U/Lvs(74.47±3.31)U/L]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。選擇缺氧6 h復(fù)氧4 h作為心肌細(xì)胞H/R損傷模型誘導(dǎo)條件。見圖1。

圖1 不同時(shí)間復(fù)氧處理對(duì)H9c2心肌細(xì)胞的影響

2.2 H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-26a-3p和Survivin表達(dá)水平與常氧組比較,不同復(fù)氧時(shí)間組H9c2細(xì)胞Survivin mRNA和蛋白表達(dá)水平降低,而miR-26a-3p表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FSurvivin mRNA=71.481,FSurvivin蛋白=179.429,FmiR-26a-3p=15.691,均P<0.001)。此外,隨著復(fù)氧時(shí)間的增加,Survivin mRNA和蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì),而miR-26a-3p表達(dá)水平呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),而H6R8與H6R12比較,Survivin mRNA[(0.40±0.10)vs(0.38±0.06)]和蛋白表達(dá)水平[(0.36±0.06)vs(0.33±0.05)]及miR-26a-3p表達(dá)水平[(5.93±0.95)vs(6.08±1.02)]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 不同時(shí)間復(fù)氧處理時(shí)H9c2心肌細(xì)胞中miR-26a-3p和Survivin表達(dá)水平

2.3 抑制miR-26a-3p表達(dá)對(duì)H/R干預(yù)下心肌細(xì)胞增殖活性的影響Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示(圖3A),各組Survivin 蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

圖3 抑制miR-26a-3p表達(dá)對(duì)H/R干預(yù)下H9c2心肌細(xì)胞中Survivin蛋白表達(dá)水平和增殖活性的影響

(F=81.775,P<0.001)。與blank組(0.15±0.04)或inhibitor: NC組(0.16±0.08)比較,inhibitor組細(xì)胞中Survivin 蛋白表達(dá)水平(1.14±0.13)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);與inhibitor組比較,inhibitor+si-Survivin組細(xì)胞中Survivin 蛋白表達(dá)水平(0.43±0.10)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),而inhibitor+si-NC組(0.13±0.11)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CCK-8結(jié)果顯示(圖3B),各組H9c2細(xì)胞增殖活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=252.637,P<0.001)。與Control組[(100.00±0.00)%]比較,H/R組H9c2細(xì)胞增殖活性[(48.03±2.00)%]降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);與H/R組比較,H/R+inhibitor組H9c2細(xì)胞增殖活性[(83.80±1.94)%]升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),而H/R+inhibitor NC組[(48.22±1.80)%]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與H/R+inhibitor組比較,H/R+inhibitor+si-Survivin組H9c2細(xì)胞增殖活性[(69.31±3.51)%]降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),而H/R+inhibitor+si-NC組[(85.51±2.97)%]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 抑制miR-26a-3p表達(dá)對(duì)H/R干預(yù)下心肌細(xì)胞SOD、MDA及LDH水平的影響各組SOD、MDA和LDH水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FSOD=16.184,FMDA=21.495,FLDH=573.514,P<0.001)。與Control組比較,H/R組H9c2細(xì)胞SOD活性降低,MDA含量和LDH釋放量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001);與H/R組比較,H/R+inhibitor組H9c2細(xì)胞SOD活性升高,MDA含量和LDH釋放量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001),而H/R+inhibitor NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與H/R+inhibitor組比較,H/R+inhibitor+si-Survivin組H9c2細(xì)胞SOD活性降低,MDA含量和LDH釋放量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.01、P<0.001),而H/R+inhibitor+si-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 抑制miR-26a-3p表達(dá)對(duì)H/R干預(yù)下H9c2心肌細(xì)胞SOD、MDA及LDH水平的影響

2.5 抑制miR-26a-3p表達(dá)對(duì)H/R干預(yù)下心肌細(xì)胞凋亡的影響各組細(xì)胞凋亡率及cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F細(xì)胞凋亡率=968.422,Fcleaved caspase-3=52.139,FBcl-2=76.854,FBax=32.703,P<0.001)。與Control組比較,H/R組H9c2細(xì)胞凋亡率及Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平升高,而Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001);與H/R組比較,H/R+inhibitor組H9c2細(xì)胞凋亡率及Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平降低,Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001),而H/R+inhibitor NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與H/R+inhibitor組比較,H/R+inhibitor+si-Survivin組H9c2細(xì)胞凋亡率及Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平降低,Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001),而H/R+inhibitor+si-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 抑制miR-26a-3p表達(dá)對(duì)H/R干預(yù)下H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響

2.6 miR-26a-3p與Survivin的靶向關(guān)系qRT-PCR結(jié)果(圖6A)顯示,與blank組或inhibitor NC組比較,inhibitor組細(xì)胞中miR-26a-3p表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1.00±0.04)/(1.00±0.04)vs(6.54±1.03),F=85.809,P<0.001]。Western blot結(jié)果(圖6B)顯示,與blank組或inhibitor NC組比較,inhibitor組細(xì)胞中Survivin蛋白表達(dá)水平顯著升高[(0.97±0.09)/(0.99±0.05)vs(3.87±0.53),F=86.894,P<0.001]。Target Scan 7.1在線網(wǎng)站顯示(圖6C),Survivin 3′-UTR區(qū)域存在與miR-26a-3p結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果顯示(圖6D),轉(zhuǎn)染miR-26a-3p mimics可降低Survivin-WT熒光素酶活性[(0.98±0.04)vs(0.26±0.06),F=339.234,P<0.001],但對(duì)Survivin-MUT熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1.00±0.00)vs(0.99±0.02),P>0.05]。結(jié)果提示miR-26a-3p可靶向調(diào)控Survivin表達(dá)。

圖6 miR-26a-3p靶向調(diào)控Survivin表達(dá)

3 討論

心肌I/R損傷可造成心肌細(xì)胞壞死、凋亡,脂質(zhì)過氧化物增加和自由基大量生成,而細(xì)胞凋亡是I/R損傷的重要發(fā)病機(jī)制[7]。該研究表明,經(jīng)H/R干預(yù)的H9c2細(xì)胞大量釋放LDH,細(xì)胞增殖活性降低,提示心肌細(xì)胞受損。隨著復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng),心肌細(xì)胞受損情況有所改善,但無法達(dá)到正常狀態(tài),說明I/R引起的損傷具有不可逆性。進(jìn)一步研究表明,受損的心肌細(xì)胞中miR-26a-3p高表達(dá),Survivin低表達(dá)。推測(cè)miR-26a-3p與Survivin可能參與心肌細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。

多項(xiàng)研究[8-9]表明miRNA在I/R損傷中通過調(diào)控下游靶基因,影響心肌細(xì)胞凋亡,進(jìn)而加重或減輕再灌注損傷。miR-26a-3p作為miRNA家族的一員,主要參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病,具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡和海馬體炎癥反應(yīng)的作用[10-11]。但miR-26a-3p針對(duì)I/R損傷的研究鮮有報(bào)道。該研究表明,下調(diào)miR-26a-3p表達(dá),可升高H/R干預(yù)下H9c2心肌細(xì)胞細(xì)胞增殖活性和SOD活性,降低MDA含量和LDH釋放量。提示抑制miR-26a-3p表達(dá)可減輕氧化應(yīng)激,提高細(xì)胞活力,改善受損心肌細(xì)胞。

Survivin是一種在進(jìn)化上高度保守的真核蛋白,具有抗細(xì)胞凋亡、抑制過度自噬、促進(jìn)遷移和血管生成等作用[12]。cleaved caspase-3作為caspase-3活化形式,是參與細(xì)胞凋亡的重要蛋白酶[13]。Bcl-2和Bax相互關(guān)聯(lián)并相互制約,共同作用于下游caspase-3,調(diào)控細(xì)胞凋亡[14]。Survivin可減輕心肌I/R損傷,通過激活Survivin調(diào)控Bcl-2和Bax表達(dá),達(dá)到抗凋亡的作用[15]。該研究表明,H/R組心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞凋亡;經(jīng)miR-26a-3p inhibitor處理后,Survivin呈高表達(dá),細(xì)胞內(nèi)Bax和cleaved caspase-3蛋白水平降低,Bcl-2蛋白水平升高,細(xì)胞凋亡減輕。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,miR-26a-3p可靶向負(fù)調(diào)控Survivin。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-26a-3p與Survivin的關(guān)系,將H/R干預(yù)的心肌細(xì)胞經(jīng)miR-26a-3p inhibitor和si-Survivin共同處理后,結(jié)果顯示Survivin缺失可明顯逆轉(zhuǎn)miR-26a-3p inhibitor對(duì)心肌細(xì)胞損傷的改善。提示,miR-26a-3p可通過靶向負(fù)調(diào)控Survivin抑制心肌細(xì)胞凋亡。