劉 藝,李金城,周昱慧,何海蘭,郭靈麗, 2,郝小惠, 2,王宏麗, 2,劉和亮,2

矽肺是由于接塵工人長期吸入大量游離二氧化硅粉塵引起的,以矽結(jié)節(jié)的形成和彌漫性纖維化為主要病變的世界范圍內(nèi)嚴重的職業(yè)病[1],該疾病致死率高且尚無有效的治愈手段。因此,開展矽肺的分子機制研究,對完善矽肺治療和提供干預(yù)措施有著重要的理論和現(xiàn)實意義[2]。課題組前期研究[3]表明,矽肺患者巨噬細胞內(nèi)發(fā)生脂滴沉積形成泡沫細胞。該研究表明巨噬細胞攝取脂質(zhì)會增加轉(zhuǎn)化生長因子的分泌,從而促進肺纖維化進程。因此,阻止巨噬細胞脂質(zhì)攝取可能會減輕矽肺纖維化反應(yīng),但其具體的調(diào)控機制還有待進一步探索。A類清道夫受體1(macrophage scavenger receptor 1,MSR1)在矽肺患者的巨噬細胞中,MSR1的表達水平隨著矽肺期別的增高而有增加趨勢,巨噬細胞對SiO2納米顆粒的攝取和炎癥因子的分泌因沉默MSR1而受到強烈抑制[4],但MSR1在矽肺脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)中是否發(fā)揮了關(guān)鍵調(diào)控作用還不清楚。因此,該研究擬在小鼠矽肺模型中探究MSR1發(fā)揮的具體作用,并在巨噬細胞系小鼠單核巨噬細胞(mouse mononuclear macrophages cells,RAW264.7)中加以驗證,以期為尋找矽肺干預(yù)和治療的靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料SPF級C57BL/6雄性小鼠(北京華阜康生物科技股份有限公司);RAW264.7細胞(美國ScienCell生物技術(shù)公司);DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司);二氧化硅(silicon dioxide,SiO2)(粒徑0.5～10.0 μm)(美國Sigma公司);兔多克隆抗體巨噬細胞MSR1(美國ABclonal公司);兔多克隆抗體腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α(上海Arigo公司);兔多克隆抗體白介素(interleukin,IL)-1β(美國ABclonal公司);兔多克隆抗體IL-6(杭州華安公司);HRP標記羊抗小鼠IgG二抗、HRP標記羊抗兔IgG二抗、β-肌動蛋白(β-actin)抗體(英國Abcam公司);ECL顯色液(北京普利萊公司);PV6000通用型兩步法免疫組化試劑(北京中杉公司);油紅O染料(美國Sigma公司);化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(XRS+,美國Bio-Rad公司)。

1.2 實驗動物及分組SPF級C57BL/6雄性小鼠24只,6～8周齡,20～25 g/只(北京華阜康生物科技股份有限公司)均在華北理工大學(xué)SPF級實驗動物中心飼養(yǎng),溫度23 ℃,相對濕度45%～50%,晝夜交替12 h,自主飲水及進食,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行試驗。該研究經(jīng)華北理工大學(xué)實驗動物倫理委員會審查批準(SQ2022128)。隨機分組為生理鹽水對照組和SiO2染毒組小鼠,每組各6只,采用一次性氣管滴注法在小鼠氣管內(nèi)灌注50 μl粒徑為0.5～10.0 μm(100 mg/ml)SiO2懸濁液制備矽肺小鼠模型,生理鹽水對照組給予同樣體積的生理鹽水,在灌注后7、14、28 d取小鼠肺組織。

1.3 細胞培養(yǎng)和處理小鼠巨噬細胞RAW264.7在37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),細胞培養(yǎng)貼壁后,實驗分組為:① 對照組:10%FBS-DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng);② SiO2組:2%FBS-DMEM高糖+50 μg/ml的SiO2混懸液培養(yǎng);③ siRNA-MSR1組:取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞接種于6孔板,轉(zhuǎn)染MSR1的小干擾RNA,用轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基進行培養(yǎng);④ siRNA-MSR1+SiO2刺激組:轉(zhuǎn)染24 h后加入SiO2混懸液培養(yǎng)。

1.4 免疫組織化學(xué)染色石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,用枸櫞酸鈉緩沖液進行抗原修復(fù),3%H2O2內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑常溫孵育15 min,血清封閉后滴加兔抗MSR1(1 ∶100),4 ℃暗盒過夜后滴加二抗37 ℃孵育30 min,DAB顯色,蘇木精染色30 s,脫水透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察MSR1的表達。

1.5 免疫印跡法提取肺組織和細胞蛋白,BCA試劑盒測定蛋白濃度,取15 μg蛋白進行電泳和轉(zhuǎn)膜,一抗4 ℃過夜,二抗搖床孵育2 h。使用ECL發(fā)光試劑應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)檢測信號,計算目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 矽肺小鼠模型的成功建立HE染色結(jié)果顯示,對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常,肺泡結(jié)構(gòu)完整;染毒7 d組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)輕微破壞;染毒14 d組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)有破壞,出現(xiàn)炎細胞聚集;染毒28 d組小鼠肺組織內(nèi)有大量炎細胞浸潤,肺泡壁增厚,形成以巨噬細胞和成纖維細胞為主的細胞結(jié)節(jié)。VG染色結(jié)果顯示,對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整,間質(zhì)未見膠原沉積;隨著染毒時間的延長,膠原分布明顯增多,形成細胞性結(jié)節(jié),肺組織發(fā)生纖維化病變,與HE結(jié)果保持一致,矽肺小鼠模型建立成功。見圖1。

圖1 小鼠肺組織病理學(xué)染色 ×200

2.2 小鼠模型肺組織脂質(zhì)蓄積油紅O染色結(jié)果如圖2所示,染毒組小鼠肺組織出現(xiàn)橙紅色脂滴,隨著染毒時間的延長,肺組織脂滴蓄積情況逐漸加重。與對照組比較,染毒28 d組小鼠肺組織橙紅色脂滴顆粒蓄積更明顯。

圖2 小鼠肺組織油紅O染色結(jié)果 ×400

2.3 小鼠模型肺組織炎癥反應(yīng)Western blot結(jié)果如圖3所示,與對照組比較,染毒7 d組和染毒14 d組的TNF-α的表達升高(P<0.05),而染毒28 d組顯著升高(P<0.01);IL-6的表達變化與TNF-α相似,隨著染毒時間的延長,IL-6的表達持續(xù)升高;IL-1β在染毒組小鼠肺組織中表達上調(diào),與對照組比較,染毒28 d組IL-1β的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖3 Western blot檢測小鼠肺組織炎性因子的表達

2.4 MSR1在模型肺組織的表達變化Western blot結(jié)果如圖4所示,與對照組比較,染毒14 d組的MSR1表達升高(P<0.05),染毒28 d組的MSR1的表達顯著升高(P<0.01)。此外,對矽肺小鼠模型肺組織進行免疫組織化學(xué)染色,結(jié)果如圖5所示,MSR1棕黃色染色顆粒主要表達于細胞質(zhì),以巨噬細胞著色為主,肺間質(zhì)居多。與對照組比較,MSR1在染毒組小鼠肺組織中表達上調(diào)。

圖4 Western blot檢測MSR1在小鼠肺組織的表達情況

圖5 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 ×400

2.5 敲低MSR1抑制巨噬細胞對SiO2的刺激反應(yīng)Western blot結(jié)果如圖6A所示,與對照組比較,SiO2組巨噬細胞RAW264.7中MSR1的表達升高(P<0.05), siRNA-MSR1組中MSR1的表達下降(P<0.05);與siRNA-MSR1組比較,siRNA-MSR1+SiO2刺激組巨噬細胞的MSR1的表達升高(P<0.05)。油紅O染色結(jié)果如圖6B所示,SiO2組巨噬細胞RAW264.7細胞形態(tài)變圓,細胞核增大呈藍色,位于胞質(zhì)一側(cè),胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)橙紅色脂滴。與SiO2組比較,siRNA-MSR1+SiO2刺激組細胞胞質(zhì)中橙紅色脂滴減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。同時,siRNA-MSR1組細胞內(nèi)紅色脂滴與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖6。ELISA結(jié)果如表1所示,與對照組比較,SiO2組細胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量升高(P<0.05), siRNA-MSR1組TNF-α、IL-6、IL-1β的含量降低(P<0.05)。其中siRNA-MSR1+SiO2刺激組的炎性因子的含量低于SiO2組,TNF-α、IL-6和IL-1β的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 細胞培養(yǎng)基上清液中炎癥因子的含量

圖6 小鼠單核巨噬細胞對SiO2的刺激反應(yīng)

3 討論

矽肺是全球最嚴重的職業(yè)性肺纖維化疾病之一,是由于長期接觸SiO2粉塵引起的,有明顯的肺部炎癥和纖維化的慢性間質(zhì)性肺疾病,該疾病具有進行性、不可逆性等特點[5]。目前盡管工人在作業(yè)時采取了預(yù)防措施,但矽肺的發(fā)病率仍然居高不下,在發(fā)展中國家尤其嚴重。在矽肺發(fā)病進程中肺內(nèi)巨噬細胞對SiO2顆粒的攝取可能導(dǎo)致其崩解壞死,釋放的SiO2顆粒被更多的巨噬細胞吞噬,周而復(fù)始導(dǎo)致持續(xù)的炎癥和纖維化[2]。在結(jié)晶SiO2引起的纖維性肺泡炎模型中,肺泡內(nèi)巨噬細胞和中性粒細胞蓄積引起持續(xù)的毒性和炎癥反應(yīng)[6],巨噬細胞和促炎細胞因子如TNF-α以及這些細胞產(chǎn)生的IL-1β在暴露于SiO2后的早期炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用[7]。此外,已有研究[3]表明脂質(zhì)代謝在矽肺的發(fā)病機制中具有重要作用,脂質(zhì)代謝失衡導(dǎo)致大量泡沫細胞形成可能是矽肺病程發(fā)展的一個重要因素。代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示無論是矽肺早期炎癥期還是進展期,發(fā)生改變的主要代謝產(chǎn)物是脂質(zhì)和類脂化合物[8]。在特發(fā)性肺纖維化相關(guān)研究中表明介導(dǎo)特發(fā)性肺纖維化重塑的特定代謝途徑包括鞘脂代謝途徑[9],鞘脂代謝途徑中相關(guān)酶的變化可能參與調(diào)控矽肺的發(fā)病進程。因此,脂質(zhì)代謝在矽肺纖維化發(fā)展過程中可能起重要作用。為闡明脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)在矽肺發(fā)病過程中發(fā)揮的作用,課題組前期通過在矽肺和纖維化相關(guān)數(shù)據(jù)庫篩選高表達的細胞因子,結(jié)果顯示MSR1在矽肺中高表達的同時也可介導(dǎo)脂質(zhì)代謝。MSR1是一種以同源三聚體形式存在的Ⅰ型跨膜糖蛋白,屬于受體超家族,參與調(diào)節(jié)和維持正常脂質(zhì)代謝。已有研究[10]表明巨噬細胞表面的MSR1可以不受膽固醇的負反饋對ox-LDL進行攝取從而形成富含脂質(zhì)的泡沫細胞。在小鼠體內(nèi)高表達MSR1基因有助于清除體內(nèi)載脂蛋白,降低膽固醇[11]。但目前MSR1在矽肺發(fā)病過程中對脂質(zhì)代謝及分泌炎性因子的調(diào)控作用機制尚不明確。

炎癥和纖維化是矽肺的典型病理特征[12]。在SiO2誘導(dǎo)的小鼠矽肺模型中矽肺小鼠肺組織中纖維化和炎癥增強,這與之前報道[13]一致,提示造模成功。此外,研究表明,SiO2進入肺內(nèi)后,肺內(nèi)巨噬細胞首先做出應(yīng)答,免疫組織化學(xué)染色和Western blot結(jié)果顯示矽肺小鼠肺組織MSR1表達升高,且與染毒時間存在相關(guān)性。在SiO2刺激的巨噬細胞中也顯示了相似的現(xiàn)象,提示MSR1在矽肺的進展中可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。油紅O染色顯示在矽肺小鼠肺組織中脂質(zhì)蓄積增加,Western blot結(jié)果顯示矽肺小鼠肺組織中炎性因子表達上調(diào),提示脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)可能在矽肺的病程進展中發(fā)揮重要作用。而有研究[14]表明MSR1的表達與肝臟富含脂質(zhì)的泡沫樣巨噬細胞的發(fā)生相關(guān),但在矽肺脂質(zhì)代謝中的調(diào)控機制尚不清楚。為探究MSR1對SiO2刺激的巨噬細胞中脂質(zhì)蓄積和炎癥反應(yīng)的影響,該研究在RAW264.7細胞中沉默MSR1的表達,結(jié)果顯示SiO2刺激RAW264.7細胞后,MSR1的表達升高,轉(zhuǎn)染MSR1的小干擾RNA后其表達受到抑制。而抑制MSR1減輕了SiO2誘導(dǎo)的脂質(zhì)蓄積和炎癥反應(yīng)的增強,提示MSR1參與了SiO2對肺組織和細胞內(nèi)脂質(zhì)成分的調(diào)控以及介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

綜上所述,該研究表明MSR1可能在矽肺小鼠模型脂質(zhì)異常蓄積和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵調(diào)控作用,MSR1可能是干預(yù)矽肺病程進展的潛在治療靶點。具體分子調(diào)控機制及調(diào)控通路的研究值得今后進一步探索。