孟智敏,劉川川,計亞亞,朱 青,尹鳳嬌,張瑞霞,巴應(yīng)貴

糖尿病腎病已成為終末期腎病的主要病因,也是糖尿病患者中最嚴重的并發(fā)癥之一,對人們的健康構(gòu)成了極大的威脅[1]。青海地區(qū)屬于中國糖尿病腎病的高發(fā)地區(qū)之一,而本地區(qū)高原低氧環(huán)境對該病的病理特征有明顯影響。有研究[2]表明,糖尿病腎病患者的腎臟足細胞數(shù)量顯著減少。足細胞焦亡是糖尿病腎病炎癥性足細胞損傷的主要形式之一,而且與糖尿病腎病進展至終末期腎病密切相關(guān)[3]。抑制足細胞損傷是預(yù)防糖尿病腎病蛋白尿和腎小球硬化的關(guān)鍵[4]。因此,探索細胞焦亡在足細胞損傷中的發(fā)生機制以采取有效的措施去減少足細胞損傷,從而減緩糖尿病腎病的發(fā)展,該研究將以此為切入點進行實驗設(shè)計。

1 材料與方法

1.1 材料大鼠腎小球足細胞購自北京BNCC公司,DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、細胞裂解液購自武漢PROCELL公司,D-無水葡萄糖購自北京索萊寶公司,BCA蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光液購自美國Thermo Scientific公司,PVDF膜購自美國Millipore生物公司,核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)、消皮素D(gasdermin,GSDMD)、白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18一抗購自武漢ABclonal公司,CCK-8試劑盒購自武漢Elabscience公司,EdU試劑盒購自上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1細胞的培養(yǎng)及干預(yù) 將大鼠足細胞復(fù)蘇后用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當細胞貼滿培養(yǎng)皿底部80%～90%時即可進行傳代,進行干預(yù)培養(yǎng)。將大鼠足細胞隨機分為4組,正常對照組(NC組):21%氧濃度,5.5 mmol/L D-葡萄糖);高糖組(HG組):21%氧濃度,30 mmol/L D-葡萄糖;低氧組(HO組):1%氧濃度,5.5 mmol/L D-葡萄糖;低氧高糖組(HOHG組):1%氧濃度,30 mmol/L D-葡萄糖。

1.2.2EdU法檢測細胞增殖情況 將細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板,放入培養(yǎng)箱中,每組3個復(fù)孔進行干預(yù)培養(yǎng)。在48 h后,按照EdU說明書的指示,將終濃度為10 μmol/L的EdU添加到每個孔中,并將其放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),2 h后取出,按照說明書的步驟進行后續(xù)操作。在熒光顯微鏡下,隨機抽取6個不同視野做樣本,并對每組細胞進行拍照,以計算出陽性細胞在總細胞中的比例,將其各組進行比較。

1.2.3透射電鏡下觀察細胞器的改變 細胞經(jīng)不同條件處理后,收集細胞沉淀,經(jīng)PBS緩沖液洗滌2次后,10 000 r/min離心5 min后去上清液,于細胞沉淀中加入1.5 ml 2.5%戊二醛緩沖液(pH=7.25),4 ℃固定24 h。接下來用1%鋨酸溶液固定細胞2 h。洗滌后,用1%醋酸鋰溶液處理30 min。之后使用無菌去離子水清洗,在連續(xù)梯度的乙醇中進行徹底脫水3次后進行滲透和包埋。使用高精度的超薄切片機進行切割,使用醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色后在透射電鏡下觀察并拍照。

1.2.4蛋白質(zhì)印記分析 收集細胞,冰上裂解30 min,通過BCA蛋白定量試劑盒對蛋白樣品的具體濃度進行檢測。將制備好的蛋白樣品進行電泳、轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出PVDF膜,配置5%的脫脂牛奶,將PVDF膜正面朝上室溫封閉1 h。TBST清洗3遍后將PVDF膜與NLRP3(1 ∶1 000)、Caspase-1(1 ∶1 500)、GSDMD(1 ∶1 500)、Pro-IL-1β(1 ∶1 500)、IL-1β(1 ∶1 500)、IL-18(1 ∶1 500)和β-actin(1 ∶1 000)抗體在4 ℃冰箱中進行孵育過夜。TBST清洗3次。將PVDF膜與HRP Goat anti-Rabbit IgG(1 ∶5 000)室溫孵育1 h。TBST清洗3次。暗室條件下,將孵育好的PVDF膜平鋪于顯色板,滴加ECL顯影劑,使用化學發(fā)光儀進行印記檢測。

2 結(jié)果

2.1 EdU檢測細胞增殖為明確大鼠腎小球足細胞增殖情況,于高糖、低氧等不同條件下培養(yǎng)大鼠腎小球足細胞,使用EdU染色法對大鼠腎小球足細胞進行染色。結(jié)果顯示,與NC組相比,HG組、HO組及HOHG組的腎小球足細胞增殖能力明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(F=13.45,P<0.05)。見圖1。

2.2 電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)透射電鏡結(jié)果顯示高糖低氧環(huán)境均使大鼠腎小球足細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常。細胞核(N)呈不規(guī)則形;部分線粒體(Mi)出現(xiàn)腫脹;部分粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(RER)擴張呈囊狀;高爾基體擴張;胞質(zhì)中出現(xiàn)自噬和空泡;細胞膜受損,表面有微絨毛,焦亡趨勢明顯,其中組間比較結(jié)果顯示HOHG組出現(xiàn)自噬和空泡數(shù)量更多,焦亡情況更明顯。提示低氧、高糖、低氧聯(lián)合高糖條件促進大鼠腎小球足細胞焦亡的發(fā)生。見圖2。

圖2 電鏡下觀察細胞超微結(jié)構(gòu)變化 ×25 000

2.3 細胞焦亡相關(guān)蛋白的表達水平

2.3.1NLRP3-Caspase-1-GSDMD信號通路蛋白的表達水平 各組干預(yù)處理 48 h 后,用Western blot技術(shù)檢測NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白的表達情況。結(jié)果顯示,與NC組相比,HG組、HO組及HOHG組NLRP3、Caspase-1、GSDMD的蛋白表達水平出現(xiàn)明顯上調(diào),其中HOHG組蛋白的表達量增加最為顯著,差異有統(tǒng)計學意義(F=16.27,P<0.05;F=32.64,P<0.05;F=44.51,P<0.05)。見圖3。

圖3 NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達情況

2.3.2Pro-IL-1β、IL-1β、IL-18蛋白表達水平 各組干預(yù)處理 48 h后,用Western blot技術(shù)檢測Pro-IL-1β、IL-1β、IL-18蛋白的表達情況。結(jié)果顯示,與NC組相比,HG組、HO組及HOHG組Pro-IL-1β、IL-1β、IL-18的蛋白表達水平出現(xiàn)明顯上調(diào),其中HOHG組蛋白的表達量增加最為顯著,差異有統(tǒng)計學意義(F=41.09,P<0.05;F=34.33,P<0.05;F=68.93,P<0.05)。見圖4。

圖4 IL-1β、IL-18蛋白表達情況

3 討論

有研究[5]表明高原地區(qū)2型糖尿病腎病早期即會出現(xiàn)明顯的蛋白尿、血尿,后期腎小球濾過率急劇下降并發(fā)癥多且嚴重。在高原地區(qū),最顯著的地域特征是低氧環(huán)境,這種環(huán)境會導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子的表達增加,進而影響葡萄糖攝取和糖酵解等代謝過程,以產(chǎn)生低氧適應(yīng)。此外,糖尿病腎病患者體內(nèi)的高糖環(huán)境也會通過多種途徑上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子的表達,進而加速糖尿病腎病的發(fā)展[6]。長期慢性低氧會導(dǎo)致腎纖維化、糖尿病腎病、高血壓腎病等[7]。

足細胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)是足細胞損傷發(fā)生的典型機制[8]。足細胞損傷和糖尿病腎病關(guān)系密切,其中NLRP3炎癥小體對促炎因子的作用在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用,NLRP3的激活會加速糖尿病腎病患者的腎損傷[9]。國外有研究[10]表明足細胞容易受到各種有害刺激影響,包括缺氧。在該研究中,同樣也可以表明與對照組相比,低氧組、高糖組、低氧高糖組都出現(xiàn)了焦亡相關(guān)蛋白表達的增加,另外研究表明相比較低氧高糖單因素,低氧高糖復(fù)合因素對細胞的影響更為明顯。國外有研究[11]表明,糖尿病腎病患者腎臟足細胞中Caspase的表達水平和GSDMD的裂解水平顯著升高,同時伴有足突消失和融合以及炎癥細胞因子增加。結(jié)果顯示,Caspase和GSDMD介導(dǎo)的細胞焦亡被激活并參與高血糖條件下的足細胞丟失和糖尿病腎病的發(fā)展。這與該研究一致,在該研究中,相比較對照組,低氧組和高糖組中NLRP3、Caspase-1、GSDMD的表達顯著增加,尤其低氧高糖復(fù)合因素對足細胞損傷最明顯,焦亡相關(guān)蛋白的表達增加更為顯著。

該研究表明,高糖和低氧雙重因素都可促進IL-1β炎癥因子的表達。IL-1β是一種強大的促炎細胞因子,可促進宿主的免疫反應(yīng),進而有效地抵抗外界的感染和損傷,其前體形式Pro-IL-1β是一種無活性的物質(zhì),低氧時Caspase-1表達增高其可通過切割Pro-IL-1β使其成為成熟的IL-1β,成熟后的IL-1β會從細胞中迅速分泌[12]。IL-18具有與IL-1β相似的空間結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),也是參與細胞焦亡的重要炎癥因子。國外有研究[13]表明低氧應(yīng)激通過激活NLRP3使Caspase-1、GSDMD顯著增加進而促使炎癥細胞因子IL-1β、IL-18顯著增加,是促使細胞焦亡的重要因素,這與該研究一致。

該實驗通過電鏡觀察到自噬現(xiàn)象增多包括線粒體自噬。線粒體自噬作為一種應(yīng)對線粒體損傷的應(yīng)激反應(yīng)機制,可以被誘導(dǎo)出現(xiàn)在各種病理過程中,例如氧化應(yīng)激、低氧和炎癥[14]。有研究[15]顯示高葡萄糖可通過誘導(dǎo)細胞中的氧化應(yīng)激和線粒體損傷抑制細胞的增殖并促進細胞凋亡和自噬的發(fā)生。此外還有研究[16]表明,NLRP3激活可誘導(dǎo)線粒體損傷,導(dǎo)致其Parkin依賴性線粒體自噬。線粒體自噬會通過產(chǎn)生大量的mtROS誘導(dǎo)NLRP3激活[17]。NLRP3、Caspase-1可引起細胞焦亡導(dǎo)致線粒體損傷,損傷的線粒體可被線粒體自噬消除使線粒體自噬增多,說明線粒體自噬和細胞焦亡相互作用,線粒體自噬可代償細胞焦亡引起的線粒體損傷。

該研究表明低氧聯(lián)合高糖環(huán)境對大鼠腎小球足細胞焦亡的發(fā)生有一定的影響。低氧聯(lián)合高糖條件可激活NLRP3-Caspase-1-GSDMD信號通路蛋白表達,結(jié)合EdU結(jié)果,提示了細胞焦亡參與高糖及低氧誘導(dǎo)的足細胞損傷。造成這一結(jié)果可能與多種因素相關(guān),結(jié)合電鏡結(jié)果,對于該信號通路與足細胞損傷的關(guān)系,該課題組趨向于低氧、高糖條件通過該信號通路促使足細胞發(fā)生焦亡現(xiàn)象。由此可見,是否可以通過調(diào)控細胞焦亡延緩糖尿病腎病病程進展,可以作為之后研究的方向,細胞焦亡使足細胞損傷在糖尿病腎病合并低氧環(huán)境的發(fā)病機制中具有重要作用,在未來,調(diào)控NLRP3-Caspase-1-GSDMD信號通路減少足細胞損傷可能為糖尿病腎病的防治提供新的治療策略和靶點。