鄭秀良,陳明月,喬亞琴,沈海濤,路 燕

對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen, APAP)作為一種解熱鎮(zhèn)痛類藥物,自問(wèn)世以來(lái),已在全球范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用,并因其易獲取性,往往導(dǎo)致有意或者無(wú)意識(shí)的超劑量服用,導(dǎo)致肝臟損害,嚴(yán)重者可出現(xiàn)急性肝衰竭[1]。隨著人們對(duì)APAP致肝臟損害的深入研究,人們對(duì)其致病機(jī)制了解的越來(lái)越透徹,包括線粒體的氧化應(yīng)激、自噬、無(wú)菌性炎癥等[2-4]。在無(wú)菌性炎癥的肝損傷中,過(guò)量的APAP導(dǎo)致肝細(xì)胞廣泛壞死,引起高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1, HMGB1)、組蛋白等內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)的釋放,從而活化Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)并與其結(jié)合,激活下游的炎癥信號(hào)通路,導(dǎo)致炎癥介質(zhì)釋放引起肝臟損害[4]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)是TLRs家族的一員,可識(shí)別包括病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)和DAMPs等在內(nèi)的配體,并活化下游信號(hào)通路激活機(jī)體自身固有免疫[5]。HMGB1是介導(dǎo)TLR4活化的內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)分子[6]。TLR4被HMGB1活化后可經(jīng)髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)依賴途徑激活核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB),產(chǎn)生白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和IL-6等炎癥細(xì)胞因子,從而引起非酒精性脂肪肝、肝缺血-再灌注損傷等[7-8]。但TLR4在APAP致急性肝損傷中的作用研究甚少,因此,該研究擬通過(guò)腹腔注射APAP構(gòu)建急性藥物性肝損傷動(dòng)物模型,并利用TLR4抑制劑瑞沙托維(resatorvid,TAK-242)初步揭示TLR4在APAP致小鼠急性肝損傷早期中的作用。為今后TLR4是否可以在藥物性肝損傷中成為一個(gè)治療靶點(diǎn)而提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 58只6～8周齡SPF級(jí)雄性ICR小鼠購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證編號(hào):SCXK(浙) 2019-0001;使用許可證編號(hào):SYXK(皖) 2017-006]。所有小鼠于實(shí)驗(yàn)前1周放置于溫度22～26 ℃、濕度40%～60%的環(huán)境中光/暗交替各12 h,且可自由獲取水和食物。

1.1.2主要藥物與試劑 對(duì)乙酰氨基酚(APAP)、TAK-242購(gòu)自上海MedChemExpress公司;DMSO購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;ALT檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;TLR4抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;NF-κB抗體購(gòu)自美國(guó)proteintech公司;HMGB1、β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司;RT-qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海新貝生物科技有限公司;引物由上海生工生物工程股份有限公司合成;免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 將58只雄性ICR小鼠隨機(jī)劃分為7組,其中對(duì)照組(正常對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、抑制劑對(duì)照組)每組6只,實(shí)驗(yàn)組(APAP 4 h組、APAP+TAK-242 4 h組、APAP 12 h組、APAP+TAK-242 12 h組)每組10只。在禁食12 h后,將APAP(300 mg/kg)腹腔注入到實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi),TAK-242(3 mg/kg)于APAP注射前3 h進(jìn)行腹腔注射,其中APAP溶液用生理鹽水配制,TAK-242溶液用0.5% DMSO配制。正常對(duì)照組小鼠腹腔注射與APAP組等體積生理鹽水,抑制劑對(duì)照組小鼠注射與APAP+TAK-242組小鼠等體積TAK-242溶液,溶劑對(duì)照組小鼠注射與抑制劑對(duì)照組等體積的溶劑。在APAP處理后不同時(shí)間點(diǎn)(0、4、12 h)剖殺小鼠。

1.2.2血清ALT水平的測(cè)定 通過(guò)血清ALT水平評(píng)價(jià)小鼠肝損傷情況,根據(jù)ALT檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行血清ALT水平的測(cè)量。

1.2.3肝組織病理學(xué)檢查 將肝臟組織用石蠟包埋后制成5 μm厚的切片,切片于脫蠟水化后用蘇木精-伊紅染液著色,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察,Image-Pro Plus軟件對(duì)其圖像進(jìn)行組織病理學(xué)分析。

1.2.4蛋白質(zhì)免疫印跡 肝臟組織蛋白用RIPA裂解液提取并采用BCA法檢測(cè)其濃度,經(jīng)SDS-PAGE分離及PVDF膜電轉(zhuǎn)移。用5%脫脂牛奶封閉后用相應(yīng)的一抗孵育,并置于4 ℃冰箱冷藏過(guò)夜。次日,用相對(duì)應(yīng)的二抗常溫孵育1 h,然后用化學(xué)發(fā)光顯影儀曝光和拍照,利用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。

1.2.5RT-qPCR 應(yīng)用TRIzol試劑對(duì)肝組織進(jìn)行RNA的分離,利用FlexCycler多功能PCR儀使其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。cDNA在LightCycle-480 PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃、30 s,95 ℃、10 s,60 ℃、30 s,循環(huán)45次。最后通過(guò)分析熔解曲線判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性,2-ΔΔCt法分析目的基因相對(duì)比值。相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。

1.2.6免疫組織化學(xué)染色 肝臟組織切片脫蠟水化后進(jìn)行過(guò)氧化物酶的阻斷及抗原修復(fù)。然后將其與稀釋后的HMGB1抗體(1 ∶200)孵育過(guò)夜。次日,將切片與相對(duì)應(yīng)的二抗進(jìn)行孵育,DAB顯色,蘇木精染色15 s、PBS返藍(lán)、梯度乙醇脫水、二甲苯透明及中性樹膠封片,顯微鏡下觀察并拍照,利用Image-Pro Plus軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。

1.2.7酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) ELISA法測(cè)定肝臟組織IL-6含量。樣本含量的測(cè)量及計(jì)算遵循使用說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 溶劑和抑制劑對(duì)正常小鼠肝臟的影響溶劑對(duì)照組、抑制劑對(duì)照組及正常對(duì)照組的小鼠血清ALT水平、肝指數(shù)均未見(jiàn)明顯差異(F=0.758、2.211,均P>0.05)。見(jiàn)表2。溶劑對(duì)照組和抑制劑對(duì)照組與正常對(duì)照組相比,HE染色均未見(jiàn)明顯的肝臟組織病理學(xué)變化。見(jiàn)圖1。

圖1 溶劑和抑制劑對(duì)小鼠肝臟組織的影響 HE×100

表2 溶劑和抑制劑對(duì)小鼠血清ALT、肝指數(shù)的影響

2.2 抑制TLR4對(duì)小鼠肝臟TLR4的影響與正常對(duì)照組相比,APAP 4 h組小鼠肝臟TLR4的表達(dá)量上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.319,P<0.05)。而APAP+TAK-242 4 h及12 h組小鼠肝臟的TLR4均較同時(shí)間點(diǎn)APAP組表達(dá)量下調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.379、3.724,均P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 抑制TLR4對(duì)小鼠肝臟TLR4的影響

2.3 抑制TLR4對(duì)APAP誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的影響APAP 4 h和12 h組的小鼠血清ALT水平及肝指數(shù)與正常對(duì)照組相比均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=27.674、24.387,均P<0.01);進(jìn)一步分析顯示APAP+TAK-242 4 h組與APAP 4 h組相比,其血清ALT水平和肝指數(shù)均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.419、5.957,P<0.05,P<0.01)。HE染色顯示正常對(duì)照組小鼠肝臟組織大小形態(tài)均正常,無(wú)明顯的炎癥及壞死。APAP 4 h組小鼠肝臟組織出現(xiàn)腫大充血,APAP 12 h組出現(xiàn)典型的小葉中心性壞死。APAP+TAK-242 4 h和12 h組均較同時(shí)間點(diǎn)APAP組肝臟組織壞死程度減輕。見(jiàn)表3、4和圖3。

圖3 抑制TLR4對(duì)APAP誘導(dǎo)的小鼠肝臟組織的影響 HE×100

表3 APAP對(duì)小鼠血清ALT、肝指數(shù)和肝臟組織的影響

表4 抑制TLR4對(duì)APAP肝損傷小鼠血清ALT、肝指數(shù)和肝臟組織的影響

2.4 抑制TLR4對(duì)肝臟HMGB1和NF-κB蛋白表達(dá)的影響肝臟IHC結(jié)果顯示APAP 4 h和12 h組的HMGB1蛋白含量均高于正常對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=83.945,P<0.01);而APAP+TAK-242 4 h和12 h組的HMGB1的蛋白含量均較同時(shí)間點(diǎn)APAP組降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.561、5.022,均P<0.01)。見(jiàn)圖4A、B。Western blot分析顯示,APAP 4 h組HMGB1、NF-κB的蛋白含量高于正常對(duì)照組,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.445、-2.994,均P<0.05);相較于APAP 4 h 組,APAP+TAK-242 4 h組的HMGB1、NF-κB的蛋白含量在肝臟中的表達(dá)均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.113、4.506,均P<0.05);APAP+TAK-242 12 h組的HMGB1的蛋白含量較同時(shí)間點(diǎn)APAP組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.462,P<0.01)。見(jiàn)圖4C-E。

圖4 抑制TLR4對(duì)肝臟HMGB1和NF-κB蛋白表達(dá)的影響

圖5 抑制TLR4下調(diào)炎癥因子MCP-1、IL-1β、TNF-α、IL-6在肝臟中的表達(dá)

2.5 抑制TLR4影響炎癥因子MCP-1、IL-1β、TNF-α、IL-6在肝臟中的表達(dá)各組小鼠肝臟MCP-1、IL-1β、TNF-α 和IL-6基因水平用RT-qPCR檢測(cè),ELISA法檢測(cè)各組小鼠肝組織IL-6含量。結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,APAP 4 h組的肝臟MCP-1、IL-1β、TNF-α 和IL-6基因水平及肝組織IL-6的含量均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.935、-8.931、-2.300、-7.307、-6.026,P<0.05,P<0.01);見(jiàn)圖5A-E。APAP 12 h組的肝組織IL-6含量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-6.168,P<0.01)。見(jiàn)圖5E。與APAP 4 h組相比,APAP+TAK-242 4 h組的MCP-1、IL-1β、TNF-α 和IL-6基因水平及組織IL-6的含量在肝臟中的表達(dá)均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.855、11.196、3.071、8.364、2.277,P<0.05,P<0.01);見(jiàn)圖5A-E。APAP+TAK-242 12 h組與APAP 12 h組相比,其MCP-1、IL-1β 和TNF-α 的基因水平在肝臟中的表達(dá)均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.941、3.194、3.751,P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)圖5A-C。

3 討論

藥物性肝損傷是由藥物本身或其代謝產(chǎn)物所致的肝臟損害。目前許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)一些常引起肝損傷的藥物做了大量研究,其中以APAP致肝臟損害的機(jī)制研究最為深入。目前研究[5,9]表明,服用過(guò)量的APAP可形成APAP蛋白加合物,引起氧化應(yīng)激、MPTP開放,從而導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死。壞死的肝細(xì)胞釋放DAMPs,并與TLR4結(jié)合,從而活化下游的炎癥信號(hào)通路,激活NF-κB,導(dǎo)致炎性細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6等炎癥介質(zhì)加重肝損傷。

該研究通過(guò)腹腔注射APAP成功建立小鼠急性肝損傷模型,肝臟受損導(dǎo)致內(nèi)源性配體DAMPs的釋放,并與TLR4結(jié)合,激活下游的炎癥信號(hào)通路,導(dǎo)致炎性介質(zhì)的釋放,從而引起急性肝損傷。研究表明ICR小鼠經(jīng)腹腔注射APAP后其血清ALT水平、肝指數(shù)升高,肝組織病理學(xué)顯示肝小葉中心性壞死。而抑制TLR4可在小鼠肝損傷早期降低血清ALT水平和肝指數(shù),減輕肝組織病理?yè)p傷。

APAP誘導(dǎo)肝組織損傷后,壞死的肝細(xì)胞釋放內(nèi)源性配體DAMPs,DAMPs結(jié)合TLRs激活先天免疫系統(tǒng),導(dǎo)致炎癥因子釋放,引起肝損傷[9]。有研究[10]表明抑制TLR4可通過(guò)對(duì)TLR4/NF-κB、TLR4/HMGB1等信號(hào)通路的抑制來(lái)降低炎癥反應(yīng)從而對(duì)肝臟具有保護(hù)作用;敲除TLR4則可通過(guò)對(duì)TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的抑制,來(lái)減少炎癥反應(yīng),達(dá)到減輕肝損傷的目的[11]。在該研究中,經(jīng)TAK-242處理后的小鼠肝組織中的TLR4、HMGB1、NF-κB的蛋白含量均降低。這些結(jié)果表明TLR4的抑制可減輕APAP所致的急性肝損傷,其機(jī)制可能在于抑制了TLR4/HMGB1信號(hào)通路的活化。

部分研究[12-14]表明TLR4通路的激活可引起肌肉、骨關(guān)節(jié)、血管平滑肌等組織產(chǎn)生炎癥細(xì)胞,引起IL-1β、TNF-α和IL-6等炎癥因子的釋放,從而對(duì)組織造成損傷;而抑制或敲除TLR4則能使組織減少上述炎癥因子的釋放,減輕損傷。在該研究中,APAP活化TLR4信號(hào)通路促進(jìn)炎癥因子(MCP-1、IL-1β、TNF-α 和IL-6)在肝組織中的分泌,而抑制TLR4則能下調(diào)上述炎癥因子水平。以上結(jié)果表明肝臟損傷的減輕可能是通過(guò)抑制TLR4下游的炎癥信號(hào)通路來(lái)下調(diào)炎癥因子,降低肝臟炎癥反應(yīng)。

綜上所述,該研究通過(guò)對(duì)ICR小鼠進(jìn)行體內(nèi)注射APAP溶液來(lái)構(gòu)建急性藥物性肝損傷模型并利用TLR4抑制劑(TAK-242)初步揭示TLR4在 APAP致小鼠急性肝損傷早期中的作用。結(jié)果顯示,抑制TLR4能降低APAP致急性肝損傷早期小鼠的血清ALT活力和肝指數(shù)、減輕肝臟組織病理?yè)p傷改變。同時(shí),抑制TLR4可以抑制肝臟TLR4/HMGB1通路的激活,使TLR4、HMGB1和NF-κB的蛋白含量降低,并下調(diào)炎癥因子(MCP-1、IL-1β、TNF-α 和IL-6)在肝組織中的表達(dá),從而減輕APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷。本研究?jī)H初步闡明抑制TLR4可能通過(guò)抑制TLR4下游的炎癥信號(hào)通路對(duì)APAP致小鼠急性肝損傷早期階段有一定的保護(hù)作用,但對(duì)其在整個(gè)肝損傷階段是否具有持續(xù)減輕肝損傷的作用還尚未清楚,有待進(jìn)一步探究。