鄭 揚(yáng),黃玉冰,黃文霞,李海濤

衰老是一種常見且不可避免的自然現(xiàn)象。臨床資料[1]顯示,衰老過程中心臟病的易感性增加,心臟主要出現(xiàn)左心室肥厚、心肌纖維化增加、心功能不全等變化,并引起一系列心血管疾病[2-3]。線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)偶聯(lián)(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes, MAMs)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體外膜之間的物理連接位點(diǎn),密切參與從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到線粒體的應(yīng)激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究[4]表明,在衰老過程中心臟和骨骼肌中MAMs結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,其完整性遭到破壞,MAMs相關(guān)蛋白表達(dá)減少。由此推測(cè),MAMs可能是衰老相關(guān)心肌損傷的一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。

消退素D1(ResolvinD1, RVD1)是一種源自omega-3多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)介質(zhì)。研究[5]表明,RVD1能夠減少血管緊張素Ⅱ引發(fā)的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),抑制心臟肥大、間質(zhì)和血管周圍纖維化以及高血壓的發(fā)生。然而,RVD1能否在衰老中對(duì)心肌組織起到保護(hù)作用目前尚不明確。因此,該研究通過觀察RVD1對(duì)自然衰老大鼠心肌組織的影響,探討衰老所致心肌受損的相關(guān)機(jī)制,以期為衰老相關(guān)心肌損傷的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用30只18月齡SD大鼠和10只6月齡SD大鼠,均為雄性,由海南藥物研究所有限責(zé)任公司提供[生產(chǎn)合格證號(hào):SCXK(瓊)2020-0007]。實(shí)驗(yàn)期間將大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)飼養(yǎng)室[使用合格證號(hào):SYXK(瓊)2022-0013],定期更換墊料,給予充足水源與飼料,溫度為22～24 ℃,相對(duì)濕度為45%～55%,光照/黑暗各12 h交替模擬正常晝夜。RVD1(美國(guó)ChemeGen公司,批號(hào):CY10936,純度:98%),心肌組織β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶生物公司),Masson試劑盒與TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(北京百奧博萊生物公司),HE染色試劑盒、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染料、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒、聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜及電化學(xué)發(fā)光分析(electrochemiluminescence,ECL)顯影液(上海碧云天生物研究所),免疫組化S-P法試劑盒(武漢伊萊瑞特生物公司),環(huán)氧樹脂812(eponate812,Epon812)(美國(guó)Ted Pella公司),醋酸雙氧鈾與枸櫞酸鉛(北京海德創(chuàng)業(yè)生物公司),放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay,RIPA)蛋白裂解液(上海貝博生物公司),兔抗大鼠微管相關(guān)蛋白3(microtubule associated protein 3,LC3)多克隆抗體、兔抗大鼠Beclin-1多克隆抗體、兔抗人p62多克隆抗體、兔抗人葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75(glucose-regulated proteins 75,GRP75)多克隆抗體、兔抗人電壓依賴性陰離子通道1(volt-dependent anion channel 1,VDAC1)多克隆抗體、兔抗人線粒體融合蛋白2(mitochondrial fusion protein 2,Mfn2)多克隆抗體、兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(英國(guó)Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組、給藥與處理 將30只18月齡SD大鼠按數(shù)字隨機(jī)表法分為模型組、低劑量RVD1組、高劑量RVD1組,每組10只,另取10只6月齡SD大鼠作為對(duì)照組。參考文獻(xiàn)[6]中的給藥劑量,低劑量RVD1組和高劑量RVD1組大鼠分別尾靜脈注射50、100 ng/ml RVD1,劑量為2 μl,每日1次,對(duì)照組和模型組同時(shí)注射等量PBS,持續(xù)干預(yù)21 d。末次給藥12 h后,處死各組大鼠并快速取出心臟組織,預(yù)冷的生理鹽水洗滌后,一部分置于4%多聚甲醛中固定,另一部分置于液氮中冷凍后存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2對(duì)-硝基苯酚法測(cè)定大鼠心肌組織β-半乳糖苷酶活性 取適量各組大鼠的心肌組織,按照組織質(zhì)量(g) ∶提取液體積(ml)為1 ∶10的比例加入提取液,置于冰上裂解30 min,離心機(jī)4 ℃ 12 000 r/min離心10 min,吸取上清液,使用β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組樣本內(nèi)β-半乳糖苷酶活性,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,按照樣本蛋白濃度計(jì)算酶活性。

1.2.3HE染色檢測(cè)大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化 將置于4%多聚甲醛固定好的各組大鼠心肌組織取出,浸入梯度乙醇中脫水,二甲苯中透明,并包埋在融化的石蠟中。將包埋好的蠟塊切成5 μm厚的組織切片,放于60 ℃烤箱烤干30 min,脫蠟水化,進(jìn)行HE染色。染色結(jié)束后,滴加中性樹膠封固,室溫晾干,光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織變化并拍照。

1.2.4Masson染色觀察大鼠心肌組織內(nèi)膠原沉積 取制備好的各組大鼠心肌組織切片,常規(guī)脫水透明,按照Masson染色試劑盒說明書步驟,加入Masson染色工作液室溫染色,浸洗干凈,滴加中性樹膠封固,室溫晾干,光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織膠原纖維沉積情況并拍照,鏡下藍(lán)染為膠原纖維沉積區(qū)域。Image J 軟件分析膠原纖維沉積情況,計(jì)算心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction,CVF),CVF=膠原藍(lán)染面積/組織總面積×100%。

1.2.5TUNEL染色檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞凋亡 取制備好的各組大鼠心肌組織切片,常規(guī)脫水透明,加入蛋白酶K修復(fù),破膜處理,采用TUNEL試劑盒檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡,加入TUNEL工作液染色,PBS清洗后,加入DAPI染細(xì)胞核,滴加抗熒光淬滅封片劑封固,室溫晾干,置于熒光顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞凋亡情況并拍照,鏡下綠色熒光標(biāo)記的細(xì)胞為TUNEL陽性,代表細(xì)胞凋亡,藍(lán)色熒光標(biāo)記的為細(xì)胞核,隨機(jī)選擇6個(gè)視野計(jì)數(shù),以TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目與總細(xì)胞數(shù)目之比記為TUNEL陽性細(xì)胞比例。

1.2.6免疫組化S-P法檢測(cè)大鼠心肌組織自噬標(biāo)志物L(fēng)C3表達(dá) 各組大鼠心肌組織切片經(jīng)脫水透明后,浸入修復(fù)液中微波爐加熱原修復(fù),3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,破膜處理后,雙蒸水清洗切片,以山羊血清室溫封閉30 min,加入稀釋后的兔抗大鼠LC3多克隆抗體(1 ∶200),4 ℃孵育過夜。棄一抗液,PBS清洗后甩干切片,加入稀釋后的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(1 ∶200),37 ℃孵育30 min,PBS清洗,使用即用型DAB 顯色,蘇木精復(fù)染,再次脫水透明,滴加中性樹膠封固,室溫晾干,光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織染色情況并拍照,鏡下棕色至棕褐色染色為L(zhǎng)C3蛋白陽性表達(dá),Image-Pro Plus軟件分析蛋白陽性表達(dá)區(qū)域占總區(qū)域比例,記為L(zhǎng)C3蛋白陽性率。

1.2.7透射電鏡觀察大鼠心肌組織內(nèi)MAMs形成 收集的各組大鼠心肌組織用3%戊二醛固定,1%鋨酸再固定,使用梯度酒精和丙酮對(duì)樣品進(jìn)行脫水,Epon812包埋,切成超薄切片,固定至銅網(wǎng),進(jìn)行醋酸雙氧鈾與枸櫞酸鉛染色,室溫下干燥過夜,透射電鏡下進(jìn)行成像并拍照,Image-Pro Plus軟件測(cè)量線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)偶聯(lián)與線粒體周長(zhǎng),分析線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)偶聯(lián)長(zhǎng)度占線粒體周長(zhǎng)比例。

1.2.8Western blot法測(cè)定大鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白與MAMs相關(guān)蛋白表達(dá) 從-80 ℃冰箱中取出各組大鼠心肌組織樣品,加入RIPA蛋白裂解液,研磨勻漿后,冰上靜置30 min,離心機(jī)4 ℃ 12 000 r/min離心15 min,取上清液即為樣本總蛋白,BCA法蛋白定量,獲得蛋白濃度。將蛋白煮沸變性,制備10%SDS-PAGE凝膠并待其凝固后,取等量30 μg蛋白加樣,電泳分離后切下目的條帶,電轉(zhuǎn)至PVDF膜。浸入5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,以減少非特異性結(jié)合。加入稀釋后的各一抗(1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜。棄一抗液,TBST洗膜,加入稀釋后的對(duì)應(yīng)二抗(1 ∶5 000),室溫孵育1 h。TBST再次洗膜,采用ECL顯影,凝膠成像顯影儀中成像并保存圖像,Image-Pro Plus軟件分析目的條帶灰度值,以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH的灰度比值來表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織β-半乳糖苷酶活性比較各組大鼠心肌組織β-半乳糖苷酶活性之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=264.127,P<0.001)。與對(duì)照組比較,模型組大鼠心肌組織β-半乳糖苷酶活性升高(P<0.05);與模型組比較,低劑量RVD1組與高劑量RVD1組大鼠心肌組織β-半乳糖苷酶活性降低(P<0.05),且高劑量RVD1組大鼠心肌組織β-半乳糖苷酶活性低于低劑量RVD1組(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)結(jié)果

2.2 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化情況比較HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)清晰,心肌細(xì)胞整齊排列,染色均勻;模型組大鼠心肌組織發(fā)生明顯損傷,心肌纖維排列紊亂且有斷裂,心肌細(xì)胞出現(xiàn)壞死、水腫現(xiàn)象;與模型組比較,低劑量RVD1組與高劑量RVD1組大鼠心肌纖維與心肌細(xì)胞形態(tài)明顯得到改善,此外,高劑量RVD1組大鼠心肌組織趨于對(duì)照組,未見明顯損傷。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化 HE ×100

2.3 各組大鼠心肌組織膠原纖維沉積情況比較Masson染色結(jié)果顯示,各組大鼠心肌組織CVF之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=314.259,P<0.001)。對(duì)照組大鼠心肌組織內(nèi)未見明顯藍(lán)染的膠原纖維沉積,而模型組大鼠心肌組織內(nèi)有大量藍(lán)染的膠原纖維沉積,CVF升高(P<0.05);與模型組比較,低劑量RVD1組與高劑量RVD1組大鼠心肌組織內(nèi)藍(lán)染的膠原纖維沉積均明顯減少,CVF降低(P<0.05),且高劑量RVD1組要CVF低于低劑量RVD1組(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織膠原沉積染色結(jié)果 Masson×100

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡比較TUNEL染色結(jié)果顯示,各組大鼠心肌組織TUNEL陽性細(xì)胞比例之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=478.841,P<0.001)。模型組大鼠心肌組織內(nèi)TUNEL陽性細(xì)胞比例(64.28±6.04)%多于對(duì)照組(2.16±0.22)%(P<0.05),心肌細(xì)胞凋亡明顯;與模型組比較,低劑量RVD1組與高劑量RVD1組大鼠心肌組織內(nèi)TUNEL陽性細(xì)胞比例(19.87±1.79)%、(12.30±1.16)%均減少(P<0.05),心肌細(xì)胞凋亡受到抑制;與低劑量RVD1組比較,高劑量RVD1組大鼠心肌組織內(nèi)TUNEL陽性細(xì)胞比例進(jìn)一步減少(P<0.05),心肌細(xì)胞凋亡更少。見圖4。

2.5 各組大鼠心肌組織內(nèi)自噬水平比較免疫組化S-P法結(jié)果顯示,各組大鼠心肌組織內(nèi)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3蛋白陽性率之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=288.645,P<0.001)。與對(duì)照組比較,模型組大鼠心肌組織內(nèi)LC3蛋白陽性率下降(P<0.05);與模型組比較,低劑量RVD1組與高劑量RVD1組大鼠心肌組織內(nèi)LC3蛋白陽性率增加(P<0.05),且高劑量RVD1組大鼠心肌組織內(nèi)LC3蛋白陽性率高于低劑量RVD1組(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組大鼠心肌組織自噬標(biāo)志物L(fēng)C3表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 S-P×100

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,各組大鼠心肌組織內(nèi)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1和p62蛋白相對(duì)表達(dá)量之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=56.241、89.472、132.418,均P<0.001)。與對(duì)照組比較,模型組大鼠心肌組織內(nèi)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下降,Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量下調(diào)而p62蛋白相對(duì)表達(dá)量上調(diào)(P<0.05);與模型組比較,低劑量RVD1組與高劑量RVD1組大鼠心肌組織內(nèi)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量上調(diào)而p62蛋白相對(duì)表達(dá)量下調(diào)(P<0.05);與低劑量RVD1組比較,高劑量RVD1組大鼠心肌組織內(nèi)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值進(jìn)一步升高,且Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量上調(diào)、p62蛋白相對(duì)表達(dá)量下調(diào)(P<0.05)。見圖6。

圖6 各組大鼠心肌組織內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

2.6 各組大鼠心肌組織內(nèi)MAMs變化情況比較透射電鏡觀察結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠心肌組織MAMs結(jié)構(gòu)疏松,占線粒體周長(zhǎng)百分比減少(P<0.05);與模型組比較,低劑量RVD1組與高劑量RVD1組MAMs結(jié)構(gòu)較為緊密,占線粒體周長(zhǎng)百分比增加(P<0.05);與低劑量RVD1組比較,高劑量RVD1組MAMs結(jié)構(gòu)更加緊密,占線粒體周長(zhǎng)百分比也增加(P<0.05)。見圖7。

圖7 各組大鼠心肌組織內(nèi)MAMs結(jié)構(gòu)變化觀察結(jié)果

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,各組大鼠心肌組織內(nèi)GRP75、VDAC1、Mfn2蛋白相對(duì)表達(dá)量之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=112.457、64.193、45.208,均P<0.001)。與對(duì)照組比較,模型組大鼠心肌組織中GRP75、VDAC1及Mfn2蛋白相對(duì)表達(dá)量下調(diào)(P<0.05);與模型組比較,低劑量RVD1組與高劑量RVD1組大鼠心肌組織中GRP75、VDAC1及Mfn2蛋白相對(duì)表達(dá)量上調(diào)(P<0.05);高劑量RVD1組大鼠心肌組織中GRP75、VDAC1及Mfn2蛋白相對(duì)表達(dá)量均要高于低劑量RVD1組(P<0.05)。見圖8。

圖8 各組大鼠心肌組織內(nèi)MAMs相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

3 討論

關(guān)于RVD1在心血管疾病中的保護(hù)作用已有報(bào)道,例如,Wang et al[7]研究表明RVD1改善了阿霉素誘導(dǎo)的小鼠心臟毒性,減少心肌細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與抑制炎癥、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān);Salas-Hernández et al[8]指出RVD1能夠抑制血管緊張素II誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞分泌細(xì)胞炎癥因子與細(xì)胞黏附蛋白,減輕心臟組織重塑,并有助于受損心臟組織的修復(fù)。該研究通過使用RVD1處理衰老大鼠后,檢測(cè)結(jié)果顯示,心肌組織內(nèi)β-半乳糖苷酶活性降低,心肌纖維與心肌細(xì)胞受損得到改善,藍(lán)染的膠原纖維沉積減少,由此說明,RVD1能夠有效改善衰老大鼠心肌受損現(xiàn)象。

自噬是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中的代謝途徑,通過溶酶體機(jī)制降解受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)。已知自噬在衰老的心肌組織中受到抑制,會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞穩(wěn)態(tài)降低,促使心肌細(xì)胞凋亡,相反,增強(qiáng)自噬有助于減緩衰老相關(guān)心肌細(xì)胞凋亡、心臟肥大及纖維化,延緩心臟衰老[9]。一旦自噬被激活,可溶性LC3-Ⅰ蛋白通過磷脂酰乙醇胺的共價(jià)偶聯(lián)形成LC3-Ⅱ,這對(duì)于自噬體的生成和伸長(zhǎng)至關(guān)重要,因此,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低則表明自噬受限[10]。該研究通過對(duì)衰老大鼠心肌組織進(jìn)行檢測(cè)顯示,LC3蛋白陽性率下降,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下降,Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量下調(diào),p62蛋白相對(duì)表達(dá)量上調(diào),TUNEL標(biāo)記的心肌細(xì)胞凋亡增加,以上結(jié)果說明衰老大鼠心肌組織內(nèi)自噬功能障礙,增加了心肌細(xì)胞凋亡。而RVD1處理的衰老大鼠心肌組織中LC3蛋白陽性率增加,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量上調(diào)而p62蛋白相對(duì)表達(dá)量下調(diào),TUNEL標(biāo)記的心肌細(xì)胞凋亡明顯減少,該結(jié)果顯示RVD1能夠提高衰老大鼠心肌組織內(nèi)自噬水平,抑制心肌細(xì)胞凋亡。

MAMs介導(dǎo)多種細(xì)胞功能,包括鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、脂質(zhì)代謝、未折疊蛋白反應(yīng)、線粒體動(dòng)力學(xué)、自噬等,這些都是心血管疾病的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素。此外,MAMs與衰老或衰老過程密切相關(guān),已知衰老性肌萎縮的發(fā)生與MAMs處鈣離子轉(zhuǎn)移異常、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等有關(guān),通過運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)MAMs能夠緩解衰老性肌萎縮[11]。有研究[12]表明,HIV-1病毒TAT蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞會(huì)破壞MAMs結(jié)構(gòu),引起活性氧(reactive oxygen species,ROS)積累及線粒體應(yīng)激,并改變MAMs相關(guān)蛋白表達(dá),從而導(dǎo)致大腦過早衰老。MAMs的形成依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體上的互補(bǔ)膜蛋白將兩個(gè)細(xì)胞器在特定位置連接在一起。因此,MAMs上某些蛋白質(zhì)的缺失或某些蛋白之間相互作用的中斷會(huì)導(dǎo)致MAMs結(jié)構(gòu)和功能的破壞。VDAC1通過GRP75與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的肌醇1,4,5-三磷酸1型受體相互作用,介導(dǎo)鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到線粒體上,這對(duì)于維持MAMs結(jié)構(gòu)與功能至關(guān)重要[13]。Mfn2在MAMs有定位,通過形成同源或異源二聚體將2個(gè)相鄰的線粒體與Mfn1連接起來來介導(dǎo)外線粒體膜融合,其功能喪失會(huì)降低線粒體融合效率并誘導(dǎo)線粒體碎裂,破壞MAMs[14]。該研究經(jīng)檢測(cè)顯示,衰老大鼠心肌組織MAMs結(jié)構(gòu)疏松,占線粒體周長(zhǎng)百分比減少,GRP75、VDAC1及Mfn2蛋白相對(duì)表達(dá)量也下調(diào),說明心肌組織內(nèi)MAMs結(jié)構(gòu)與功能受損。此外,經(jīng)過RVD1處理的衰老大鼠心肌組織MAMs結(jié)構(gòu)較為緊密,占線粒體周長(zhǎng)百分比增加,同時(shí),GRP75、VDAC1及Mfn2蛋白相對(duì)表達(dá)量也上調(diào),由此推測(cè),RVD1能夠調(diào)節(jié)衰老大鼠心肌組織內(nèi)MAMs,從而對(duì)心肌組織起到保護(hù)作用。