王琳琳,李志鵬,劉翠蘭,韓小麗,郭寶珠,劉 華,劉圣君

糖尿病腎病是糖尿病常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一,其特征為白蛋白尿排泄持續(xù)性增加,隨病程進(jìn)展,會(huì)發(fā)展為終末期腎病。據(jù)調(diào)查[1]顯示,2017年中國(guó)成年人群糖尿病的患病率為12.8%,近年來(lái)其發(fā)病率持續(xù)增加,糖尿病腎病發(fā)病率也隨之增加[2]。因此,加強(qiáng)糖尿病腎病的防治有著重要意義。既往已有多項(xiàng)研究[3-5]報(bào)道長(zhǎng)期、規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)可改善糖尿病腎病患者的糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗,在一定程度上抑制腎臟損傷。低溫下有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)可改善慢性腎臟病3期患者腎功能,降低腎臟預(yù)后不良事件發(fā)生率[6],但關(guān)于其機(jī)制鮮有報(bào)道。此外,對(duì)于糖尿病腎病,低溫下有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)的效果及短期預(yù)后效應(yīng)也鮮有研究報(bào)道。該研究在低溫下進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù),探究其對(duì)糖尿病腎病小鼠和患者腎臟代謝的影響及短期預(yù)后效應(yīng),以期為低溫下有氧運(yùn)動(dòng)治療糖尿病腎病提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物 40只SPF級(jí)雄性DBA/2J小鼠,6～8周齡,體質(zhì)量20～22 g,購(gòu)自河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)SYXK(冀)2019-004],室溫22～24 ℃,相對(duì)濕度40%～50%,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。該研究獲該學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):HBNU20200130022092)。

1.1.2病例資料 前瞻性入組河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院2020年6—11月的194例糖尿病腎病患者。納入標(biāo)準(zhǔn):① 有糖尿病史,且滿足以下任意一條:隨機(jī)尿白蛋白/肌酐比值(urine albumin/creatinine ratio,UACR)≥30 mg/g或隨機(jī)尿白蛋白排泄率≥30 mg/24 h,且此后3～6個(gè)月的3次檢查中2次達(dá)到或超過(guò)臨界值;估算的腎小球?yàn)V過(guò)率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)<60 ml/(min·1.73 m2)3個(gè)月以上;病理改變符合糖尿病腎病;② 糖尿病腎病G3A3期;③ 年齡>18歲。排除標(biāo)準(zhǔn):① 既往有自身免疫性疾病或惡性腫瘤;② 肢體殘疾影響運(yùn)動(dòng);③ 中途退出研究;④ 伴其他原發(fā)或繼發(fā)性腎小球疾病。該研究遵守《赫爾辛基宣言》,獲該院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),受試者均簽署知情同意書。

1.1.3主要試劑與儀器 鏈脲佐菌素、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司,放射免疫沉淀裂解液、二辛可寧酸試劑及化學(xué)底物發(fā)光液均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2,NRF2)、血紅素氧合酶1(heme oxygenase 1,HO-1)、三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體及二抗均購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司,7020型全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自北京日立有限公司,KW-PT型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)機(jī)購(gòu)自南京卡爾文生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1糖尿病腎病小鼠模型制備、成模標(biāo)準(zhǔn)、分組及干預(yù)方案 采用腹腔注射鏈脲佐菌素法(40 mg/kg,連續(xù)5次)構(gòu)建糖尿病腎病模型[7]。糖尿病模型成模標(biāo)準(zhǔn)為隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L,糖尿病腎病模型成模標(biāo)準(zhǔn)為糖尿病模型成模4周后24 h尿蛋白>30 mg[7]。40只小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、低溫組、運(yùn)動(dòng)組和低溫運(yùn)動(dòng)組,每組8只。除正常組外均造糖尿病腎病模型,此外,運(yùn)動(dòng)組和低溫運(yùn)動(dòng)組分別在22～24 ℃和3～5 ℃環(huán)境下給予為期8周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù),每天1次,每次1 h,每周連續(xù)5 d,速度25 m/min。低溫組僅在運(yùn)動(dòng)組和低溫運(yùn)動(dòng)組運(yùn)動(dòng)時(shí)給予3～5 ℃環(huán)境干預(yù)。期間未給予藥物干預(yù)。

1.2.2糖尿病腎病小鼠生化指標(biāo)檢測(cè) 于末次干預(yù)后,斷尾法收集血液,用生化分析儀檢測(cè)小鼠的空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、血肌酐(serum creatinine,Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和24 h尿蛋白水平。

1.2.3糖尿病腎病小鼠腎臟組織形態(tài)觀察 斷尾后,斷頭處死小鼠,分離出腎臟組織,用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋后依次切片、脫蠟、水化和HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟病變情況,主要包含腎組織輪廓清晰程度,腎小球和腎小管形態(tài)等。每張腎臟病理圖像隨機(jī)選取3個(gè)非重疊視野,參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行半定量評(píng)分,總分5分,評(píng)分越高表明腎臟損傷越嚴(yán)重。

1.2.4蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)糖尿病腎病小鼠腎臟組織中NRF2和HO-1水平 取1.2.3中腎臟組織,用放射免疫沉淀裂解液提取腎臟組織中蛋白,用二辛可寧酸法定量;10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳,電壓120 V至溴酚藍(lán)跑出膠面,電流300 mA轉(zhuǎn)膜2 h,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h;一抗(NRF2和HO-1稀釋比分別為1 ∶500和1 ∶2 000,GAPDH稀釋比1 ∶5 000)4 ℃孵育過(guò)夜;二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h;化學(xué)底物發(fā)光液顯影。

1.2.5受試者分組及干預(yù)方案 根據(jù)患者自身情況給予降糖、降壓及糾正脂代謝紊亂等基礎(chǔ)治療,此外,在不改變?cè)猩盍?xí)慣的情況下,遵循患者個(gè)人意愿,根據(jù)低溫有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)頻次將患者分為運(yùn)動(dòng)組(1次/周)、運(yùn)動(dòng)組(≥2次/周)和對(duì)照組(0次/周)。運(yùn)動(dòng)組于2020年12月—2021年3月行低溫有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù),運(yùn)動(dòng)方式為滑冰,運(yùn)動(dòng)前進(jìn)行15 min熱身,然后運(yùn)動(dòng)1 h,受試者根據(jù)自身情況調(diào)整速度和強(qiáng)度,每周至少1次,干預(yù)4個(gè)月。

1.2.6受試者信息收集 收集年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)(body mass index,BMI)、吸煙史、糖尿病病程、糖化血紅蛋白(glycated hemoglobin A1c,HbA1c)、冠心病史、高血壓史、是否應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin-converting enzyme inhibitor,ACEI)/血管緊張素受體阻滯劑(angiotensin II receptor blocker,ARB)、二甲雙胍和鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抑制劑(sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor,SGLT2i)類藥物、干預(yù)前后的Scr、BUN、尿酸(uric acid,UA)、UACR和eGFR等信息。

1.2.7受試者隨訪 于低溫有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)結(jié)束后用電話和復(fù)診方式隨訪1年,每1～3月隨訪1次,將Scr水平翻倍、進(jìn)展為糖尿病腎病G4期或發(fā)生不良心腦血管事件(包含急性冠脈綜合征、心力衰竭、靶血管血運(yùn)重建及缺血性腦卒中等)定義為預(yù)后不良[9]。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病腎病小鼠的FBG、Scr、BUN和24 h尿蛋白水平與正常組比較,模型組的FBG、Scr、BUN和24 h尿蛋白水平均升高(P<0.05)。與模型組比較,運(yùn)動(dòng)組和低溫運(yùn)動(dòng)組的FBG、Scr、BUN和24 h尿蛋白水平均降低(P<0.05)。與低溫組和運(yùn)動(dòng)組比較,低溫運(yùn)動(dòng)組的FBG、Scr、BUN和24 h尿蛋白水平均降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 糖尿病腎病小鼠的FBG、Scr和BUN水平

2.2 糖尿病腎病小鼠的腎臟病變情況正常組的組織輪廓清晰,腎小球、腎小管形態(tài)規(guī)則。與正常組比較,模型組的腎小球肥大,腎小管上皮細(xì)胞存在不同程度的壞死,細(xì)胞排列混亂。與模型組比較,運(yùn)動(dòng)組和低溫運(yùn)動(dòng)組的組織形態(tài)均有不同程度改善。與低溫組和運(yùn)動(dòng)組比較,低溫運(yùn)動(dòng)組的腎小球肥大和腎小管擴(kuò)張程度均減輕。見(jiàn)圖1。正常組、模型組、低溫組、運(yùn)動(dòng)組和低溫運(yùn)動(dòng)組的腎臟損傷評(píng)分[0分、(4.13±0.84)分、(4.00±0.93)分、(2.75±0.46)分和(1.25±0.46)分]差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=28.988,P<0.001)。與正常組比較,模型組的腎臟損傷評(píng)分升高(P<0.05)。與模型組比較,運(yùn)動(dòng)組和低溫運(yùn)動(dòng)組的腎臟損傷評(píng)分均降低(P<0.05)。與低溫組和運(yùn)動(dòng)組比較,低溫運(yùn)動(dòng)組的腎臟損傷評(píng)分降低(P<0.05)。

圖1 糖尿病腎病小鼠的腎臟病變情況 HE×400

2.3 糖尿病腎病小鼠的NRF2和HO-1水平比較正常組、模型組、低溫組、運(yùn)動(dòng)組和低溫運(yùn)動(dòng)組的NRF2(1.00±0.03、0.35±0.01、0.32±0.05、1.42±0.05和1.84±0.07)和HO-1(1.00±0.03、0.56±0.01、0.49±0.05、1.15±0.04和1.40±0.04)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(WelchF=2 642.449、1 093.935,均P<0.001)。與正常組比較,模型組的NRF2和HO-1水平均降低(P<0.05)。與模型組比較,低溫組的HO-1水平降低,運(yùn)動(dòng)組和低溫運(yùn)動(dòng)組的NRF2和HO-1水平均升高(P<0.05)。與低溫組或運(yùn)動(dòng)組比較,低溫運(yùn)動(dòng)組的NRF2和HO-1水平均升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 糖尿病腎病小鼠的NRF2和HO-1水平

2.4 糖尿病腎病患者的臨床資料運(yùn)動(dòng)組(1次/周)、運(yùn)動(dòng)組(≥2次/周)和對(duì)照組的年齡、性別構(gòu)成、BMI、吸煙史、糖尿病病程、HbA1c、冠心病占比、高血壓占比、應(yīng)用ACEI/ARB、二甲雙胍和SGLT2i類藥物占比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 糖尿病腎病患者的臨床資料

2.5 糖尿病腎病患者的腎功能指標(biāo)低溫有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)前,運(yùn)動(dòng)組(1次/周)、運(yùn)動(dòng)組(≥2次/周)和對(duì)照組的Scr、BUN、UA、UACR和eGFR水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低溫有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后,運(yùn)動(dòng)組(1次/周)和運(yùn)動(dòng)組(≥2次/周)的BUN和UACR水平均較干預(yù)前降低(P<0.05);對(duì)照組的Scr、BUN和UACR水平均較干預(yù)前升高(P<0.05),eGFR水平較干預(yù)前降低(P<0.05);運(yùn)動(dòng)組(1次/周)和運(yùn)動(dòng)組(≥2次/周)的Scr、BUN和UACR水平均低于對(duì)照組(P<0.05),eGFR水平均高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 糖尿病腎病患者的腎功能指標(biāo)

2.6 糖尿病腎病患者的短期預(yù)后運(yùn)動(dòng)組中短期預(yù)后不良5例,其中進(jìn)展為糖尿病腎病G4期2例,并發(fā)急性心肌梗死3例;對(duì)照組中短期預(yù)后不良18例,其中進(jìn)展為糖尿病腎病G4期8例,并發(fā)不穩(wěn)定心絞痛3例,急性心肌梗死7例。運(yùn)動(dòng)組(≥2次/周)的累積預(yù)后不良發(fā)生率為2.13%(1/47),低于運(yùn)動(dòng)組[1次/周,11.43%(4/35)]和對(duì)照組[16.07%(18/112);Log-Rank χ2=6.043,P=0.049]。見(jiàn)圖3。

圖3 糖尿病腎病患者的預(yù)后不良發(fā)生情況

COX回歸分析結(jié)果顯示運(yùn)動(dòng)干預(yù)1次/周(HR=0.714,95%CI:0.242～2.109)較不干預(yù)并不能降低糖尿病腎病患者短期預(yù)后不良發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),運(yùn)動(dòng)干預(yù)≥2次/周(HR=0.123,95%CI:0.016～0.925)較不干預(yù)可降低糖尿病腎病患者短期預(yù)后不良發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

3 討論

糖尿病腎病具有發(fā)病率高、治療費(fèi)用高、預(yù)后差等特點(diǎn),嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量和生命安全。據(jù)報(bào)道[10],全球因糖尿病腎病進(jìn)展為終末期腎病的患者占30%～50%。在中國(guó),糖尿病腎病已成為中老年人終末期腎病發(fā)病的首要原因[11]。在糖尿病腎病發(fā)病早期給予及時(shí)、有效的干預(yù),可延緩病情進(jìn)展,甚至逆轉(zhuǎn)[12]。目前,臨床針對(duì)糖尿病腎病的治療主要依靠藥物、透析及腎移植手術(shù)等,忽視了運(yùn)動(dòng)干預(yù)的作用[13]。該研究主要探究低溫下有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)糖尿病腎病小鼠和患者腎臟代謝的影響及短期預(yù)后效應(yīng)。

該研究采用腹腔注射鏈脲佐菌素法構(gòu)建糖尿病腎病模型,在低溫環(huán)境下給予有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù),結(jié)果顯示模型組的FBG、Scr、BUN和24 h尿蛋白水平均升高,運(yùn)動(dòng)組和低溫運(yùn)動(dòng)組的FBG、Scr、BUN和24 h尿蛋白水平均降低,此外,低溫運(yùn)動(dòng)組的FBG、Scr、BUN和24 h尿蛋白水平均低于低溫組和運(yùn)動(dòng)組。上述結(jié)果提示低溫下有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以降低糖尿病腎病小鼠血糖,糾正腎臟代謝異常,其效果優(yōu)于單純低溫環(huán)境干預(yù)和室溫下有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)。此外,腎組織HE染色結(jié)果顯示模型組的腎小球肥大,腎小管上皮細(xì)胞存在不同程度的壞死,細(xì)胞排列混亂,其腎臟損傷評(píng)分較正常組升高;運(yùn)動(dòng)組和低溫運(yùn)動(dòng)組的組織形態(tài)均有不同程度改善,兩組腎臟損傷評(píng)分均較模型組降低;低溫運(yùn)動(dòng)組的腎臟損傷程度低于運(yùn)動(dòng)組,其腎臟損傷評(píng)分較運(yùn)動(dòng)組降低。該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了低溫下有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)糖尿病腎病小鼠的腎臟保護(hù)作用,其效果優(yōu)于單純有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)。

NRF2和HO-1是細(xì)胞內(nèi)抗氧化反應(yīng)的重要因子,據(jù)報(bào)道[14-15],激活NRF2/HO-1信號(hào)通路可有效降低因高糖環(huán)境所產(chǎn)生的活性氧,抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的胰島素抵抗,延緩糖尿病腎病進(jìn)展。該研究結(jié)果顯示模型組的NRF2和HO-1水平均降低,運(yùn)動(dòng)組和低溫運(yùn)動(dòng)組的HO-1和NRF2水平均升高,但低溫運(yùn)動(dòng)組的NRF2和HO-1水平更高。上述結(jié)果提示低溫下有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)可上調(diào)腎臟組織中NRF2和HO-1表達(dá),其上調(diào)效果優(yōu)于單純有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)。

為闡明低溫下有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)糖尿病腎病患者的作用,該研究用Scr、BUN、UA、UACR和eGFR作為評(píng)價(jià)腎功能的指標(biāo),結(jié)果顯示低溫下有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后,運(yùn)動(dòng)組(1次/周)和運(yùn)動(dòng)組(≥2次/周)的Scr、BUN和UACR水平均低于對(duì)照組,eGFR水平均高于對(duì)照組,該結(jié)果提示低溫有氧運(yùn)動(dòng)可降低糖尿病腎病患者Scr、BUN和UACR水平,提高eGFR水平,表明低溫有氧運(yùn)動(dòng)可改善糖尿病腎病患者腎功能。此外,運(yùn)動(dòng)組(≥2次/周)的累積預(yù)后不良發(fā)生率低于運(yùn)動(dòng)組(1次/周)和對(duì)照組;COX回歸分析結(jié)果顯示運(yùn)動(dòng)干預(yù)1次/周較不干預(yù)并不能降低糖尿病腎病患者短期預(yù)后不良發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),運(yùn)動(dòng)干預(yù)≥2次/周較不干預(yù)可降低糖尿病腎病患者短期預(yù)后不良發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。上述結(jié)果提示低溫下有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)可改善糖尿病腎病患者短期預(yù)后,其原因可能是低溫下有氧運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)NRF2/HO-1信號(hào)通路表達(dá),從而抑制糖尿病腎病患者體內(nèi)炎癥和氧化應(yīng)激損傷,保護(hù)腎功能,改善預(yù)后。

綜上所述,低溫下有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)可糾正糖尿病腎病腎臟代謝異常,保護(hù)腎臟組織,降低短期預(yù)后不良發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),其機(jī)制可能與上調(diào)NRF2/HO-1軸表達(dá)有關(guān)。該研究尚存在一定不足,關(guān)于低溫下有氧運(yùn)動(dòng)與常溫下有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病腎病患者的腎功能及預(yù)后的保護(hù)作用未進(jìn)行比較,下一步將針對(duì)上述不足進(jìn)行補(bǔ)充,為低溫下有氧運(yùn)動(dòng)的開(kāi)展提供更多依據(jù)。