文曉東,羅 寧,周欣梅,盧建政,曾 振,張 藝,王春玲

帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是一種復(fù)雜的神經(jīng)退行性疾病。研究[1-2]表明,線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、自噬受損和神經(jīng)炎癥等均與PD的發(fā)生密切相關(guān)。目前,PD的治療主要以藥物治療為主,但長期服用會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng),因此,研究PD的發(fā)病機(jī)制對于PD的治療具有重要意義。線粒體異常被認(rèn)為是包括PD在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)重要靶點(diǎn),清除受損線粒體的唯一途徑是線粒體自噬,這提示刺激線粒體自噬可作為延緩PD患者神經(jīng)退行性過程的一種有效的方法[3]。

miR-145-3p是一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA,研究[4]表明,miR-145-3p參與包括自噬在內(nèi)的多種細(xì)胞生物學(xué)過程的調(diào)控,但關(guān)于miR-145-3p在PD中的作用還未有報(bào)道。自噬過程受到多種信號通路的調(diào)控,其中鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶激酶β(calmodulin-dependent protein kinase kinaseβ,CaMkkβ)/腺苷酸活化蛋白激酶(adenylate activated protein kinase,AMPK)通路與自噬密切相關(guān),并可激活下游環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein,CREB),參與多種神經(jīng)退行性疾病[5]。因此,該研究通過構(gòu)建1-甲基-4苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridiniumion,MPP+)誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型,研究miR-145-3p對PD細(xì)胞模型線粒體自噬的影響及其機(jī)制,為深入了解PD的發(fā)病機(jī)制及尋找新的治療靶點(diǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y購自中科院細(xì)胞庫,DMEM/F12購自美國Hyclone公司,CaMkkβ抑制劑STO-609購自美國Selleck公司,CERB抑制劑KG-501購自美國MCE公司,CCK-8購自北京索萊寶科技有限公司,qRT-PCR試劑盒購自日本TAKARA公司,AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司,兔抗Bcl-2、Bax、Caspase-3、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、CaMkkβ、AMPK、CREB和HRP標(biāo)記的二抗均購自武漢Bioswamp公司,兔抗磷酸化鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶激酶β(phosphorylated calmodulin-dependent protein kinase kinaseβ,p-CaMkkβ)購自美國Invitrogen公司,兔抗磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(phosphorylated cadenylate activated protein kinase,p-AMPK)購自美國Abcam公司,兔抗磷酸化環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(phosphorylated cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein,p-CREB)購自美國GeneTex公司,鋨酸、枸櫞酸鉛購自北京中鏡科儀技術(shù)有限公司,醋酸鈾購自西安鼎天化工有限公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及MPP+誘導(dǎo)PD細(xì)胞模型的構(gòu)建 SH-SY5Y細(xì)胞用含15%胎牛血清和1%青-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)按照1 ∶2的比例進(jìn)行傳代,選取對數(shù)期生長的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。利用250 μmol/L的MPP+干預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h,構(gòu)建PD細(xì)胞模型[6]。CCK-8檢測細(xì)胞的增殖能力,結(jié)果顯示MPP+處理后細(xì)胞增殖能力降低,表明PD細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率鑒定 合成并構(gòu)建miR-145-3p的mimics及對應(yīng)的NC,轉(zhuǎn)入 MPP+誘導(dǎo)PD細(xì)胞模型中,以未做處理的SH-SY5Y細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的MPP+誘導(dǎo)損傷PD細(xì)胞模型為對照,分別提取各組細(xì)胞的總RNA,qRT-PCR法檢測miR-145-3p的表達(dá),驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組細(xì)胞中miR-145-3p水平降低;與模型組相比,mimics組細(xì)胞中miR-145-3p水平升高,而mimics-NC組細(xì)胞中miR-145-3p水平無明顯變化,表明轉(zhuǎn)染成功。

1.2.3細(xì)胞分組及處理 將細(xì)胞分為8組:對照組、模型組、mimics組、STO-609組、mimics+STO-609組、KG-501組、mimics+KG-501組、STO-609+KG-501組。對照組細(xì)胞不做處理;其余組細(xì)胞均用250 μmol/L的MPP+誘導(dǎo)24 h,mimics組細(xì)胞轉(zhuǎn)入miR-145-3p mimics;STO-609組加入20 μmol/L STO-609[7];mimics+STO-609組先加入20 μmol/L STO-609處理1 h,再轉(zhuǎn)入miR-145-3p mimics;KG-501組加入5 nmol/L KG-501[8];mimics+KG-501組先加入5 nmol/L KG-501處理1 h,再轉(zhuǎn)入miR-145-3p mimics;STO-609+KG-501組同時(shí)加入20 μmol/L STO-609和5 nmol/L KG-501。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組處理完成的細(xì)胞,取1×106個(gè)培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞,棄上清液,加入1 ml預(yù)冷的PBS,混勻后棄上清液,200 μl PBS重懸細(xì)胞沉淀,加入10 μl Annexin V-FITC和10 μl PI,混勻,4 ℃避光孵育30 min,最后加入300 μl PBS,隨即進(jìn)行流式檢測。

1.2.5透射電鏡觀察自噬泡和自噬體 收集各組細(xì)胞用2.5%戊二醛預(yù)固定30 min以上,0.1 mol/L PBS緩沖液清洗3次,1%鋨酸后固定1 h,PBS緩沖液清洗3次后,50%～90%乙醇梯度脫水,90%丙酮脫水,100%丙酮2次脫水,包埋后超薄切片機(jī)切片,厚度約為60 nm,醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染,透射電鏡觀察并拍照。

1.2.6Western blot檢測凋亡、自噬和CaMkkβ/AMPK/CREB通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 細(xì)胞取出后,吸棄培養(yǎng)液,預(yù)冷的PBS洗滌2次后,加入裂解液,充分裂解后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中,取上清液BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。上樣電泳,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉4 ℃過夜,加入一抗稀釋液室溫孵育1 h,洗膜后加入二抗稀釋液,室溫孵育1 h,洗膜后ECL顯影,TANON GIS讀取條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 miR-145-3p對MPP+誘導(dǎo)PD模型細(xì)胞凋亡率的影響與對照組相比,模型組細(xì)胞凋亡率升高;與模型組相比,mimics組細(xì)胞凋亡率降低,KG-501組和STO-609組細(xì)胞凋亡率升高;與mimics組相比,mimics+STO-609組和mimics+KG-501組細(xì)胞凋亡率均升高;與STO-609組相比,STO-609+KG-501組細(xì)胞凋亡率升高(F=1 085.53,P<0.01)。見表1和圖1。

表1 各組細(xì)胞凋亡率

圖1 各組細(xì)胞凋亡率的比較

2.2 miR-145-3p調(diào)控MPP+誘導(dǎo)PD模型細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)與對照組相比,模型組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低,Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高;與模型組相比,mimics組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高,Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低,STO-609組和KG-501組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低,Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高;與mimics組相比,mimics+STO-609組和mimics+KG-501組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低,Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高;與STO-609組相比,STO-609+KG-501組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低,Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高。Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=243.15,P<0.01;F=657.83,P<0.01;F=344.55,P<0.01)。見表2和圖2。

表2 各組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白相對表達(dá)

圖2 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.3 miR-145-3p對MPP+誘導(dǎo)PD模型細(xì)胞中自噬的影響對照組細(xì)胞內(nèi)可見大量自噬體結(jié)構(gòu);模型組細(xì)胞內(nèi)自噬體結(jié)構(gòu)較對照組明顯減少;mimics組細(xì)胞內(nèi)自噬體結(jié)構(gòu)較模型組增多,而STO-609組和KG-501組細(xì)胞內(nèi)自噬體結(jié)構(gòu)較模型組進(jìn)一步減少;與mimics組相比,mimics+STO-609組和mimics+KG-501組細(xì)胞內(nèi)自噬體結(jié)構(gòu)均減少;STO-609+KG-501組較STO-609組和KG-501組自噬體結(jié)構(gòu)進(jìn)一步減少。見圖3。

圖3 各組細(xì)胞透射電鏡觀察結(jié)果 ×12 000

2.4 miR-145-3p調(diào)控MPP+誘導(dǎo)PD模型細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)與對照組相比,模型組細(xì)胞中Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01),LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)水平升高(P<0.01);與模型組相比,mimics組細(xì)胞中Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05),LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05),STO-609組和KG-501組細(xì)胞中Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01),LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)水平升高(P<0.01);與mimics組相比,mimics+STO-609組和mimics+KG-501組細(xì)胞中Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01),LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)水平升高(P<0.01);與STO-609組相比,STO-609+KG-501組細(xì)胞中Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01),LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)水平升高(P<0.01)。Beclin-1、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=405.45,P<0.01;F=177.03,P<0.01;F=333.62,P<0.01)。見表3和圖4。

表3 各組細(xì)胞內(nèi)Beclin-1、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白相對表達(dá)

圖4 各組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較

2.5 miR-145-3p促進(jìn)MPP+誘導(dǎo)PD細(xì)胞模型CaMkkβ/AMPK/CREB通路的激活與對照組相比,模型組細(xì)胞中p-CaMkkβ、p-AMPK、p-CREB蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01);與模型組相比,mimics組細(xì)胞中p-CaMkkβ、p-AMPK、p-CREB蛋白表達(dá)水平升高(P<0.01),STO-609組和KG-501組細(xì)胞中p-CaMkkβ、p-AMPK、p-CREB蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01);與mimics組相比,mimics+STO-609組和mimics+KG-501組細(xì)胞中p-CaMkkβ、p-AMPK、p-CREB蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01);與STO-609組相比,STO-609+KG-501組細(xì)胞中p-CaMkkβ、p-AMPK、p-CREB蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。CaMkkβ、AMPK和CREB的磷酸化差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 498.40,P<0.01;F=89.77,P<0.01;F=329.24,P<0.01)。見表4和圖5。

表4 各組細(xì)胞內(nèi)p-CaMkkβ/CaMkkβ、p-AMPK/AMPK和p-CREB/CREB的蛋白相對表達(dá)

圖5 各組細(xì)胞中CaMkkβ/AMPK/CREB通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較

3 討論

線粒體自噬可選擇性地清除細(xì)胞內(nèi)受損或多余的線粒體,以維持細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量和功能的正常,線粒體自噬功能紊亂在包括PD在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞暴露于MPP+等神經(jīng)毒素中時(shí),會(huì)引起神經(jīng)細(xì)胞的自噬和死亡的增加[9]。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,MPP+處理的SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡率升高,而轉(zhuǎn)染miR-145-3p mimics后細(xì)胞凋亡率降低,這表明miR-145-3p能夠抑制PD細(xì)胞模型的凋亡,具有保護(hù)PD細(xì)胞模型的作用。眾所周知,細(xì)胞凋亡是一個(gè)受多基因控制的過程,Bcl-2家族成員的抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax共同調(diào)控細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bax的活性高于Bcl-2時(shí),Bax的構(gòu)象發(fā)生變化并易位到線粒體膜上,促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中,并促進(jìn)Caspase-3的活化,啟動(dòng)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡[10]。該實(shí)驗(yàn)檢測了Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-145-3p mimics后細(xì)胞中Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平較模型組降低,Bcl-2蛋白表達(dá)水平較模型組升高,提示miR-145-3p可能通過抑制線粒體途徑凋亡而抑制PD細(xì)胞模型的凋亡。

為了探討miR-145-3p對MPP+誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型線粒體自噬的影響,該實(shí)驗(yàn)利用透射電鏡觀察了細(xì)胞內(nèi)的自噬體結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-145-3p mimics后細(xì)胞中自噬結(jié)構(gòu)增多,表明miR-145-3p能夠促進(jìn)PD細(xì)胞模型中的線粒體自噬。Beclin-1是一種線粒體自噬調(diào)控蛋白,可作為自噬標(biāo)志物用于自噬水平的檢測[11]。Beclin-1上調(diào)能夠增強(qiáng)線粒體自噬水平,從而發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用。Beclin-1可與LC3結(jié)合形成復(fù)合物參與自噬體的形成,當(dāng)發(fā)生自噬時(shí),LC3-Ⅰ發(fā)生泛素化與自噬膜表面的物質(zhì)結(jié)合形成LC3-Ⅱ,因此,LC3-Ⅱ可作為檢測自噬活性的標(biāo)志物[12]。該結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-145-3p mimics后PD細(xì)胞模型中Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白水平升高,LC3-Ⅰ蛋白水平降低,進(jìn)一步表明miR-145-3p能夠促進(jìn)MPP+誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型的線粒體自噬,具有保護(hù)神經(jīng)元的作用。

CaMkkβ/AMPK通路介導(dǎo)線粒體自噬,激活CaMkkβ/AMPK通路可以促進(jìn)細(xì)胞的自噬[13]。有研究[14]表明CaMkkβ/AMPK通路與神經(jīng)元中的線粒體自噬相關(guān),CaMkkβ可激活A(yù)MPK,AMPK激活后可促進(jìn)TSC2活化發(fā)生磷酸化,從而激活CREB,CREB是一種轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子,能夠促進(jìn)神經(jīng)元的成熟和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,與包括PD在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)[15]。為了明確miR-145-3p調(diào)控MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞線粒體自噬發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)的作用機(jī)制,該實(shí)驗(yàn)檢測了CaMkkβ/AMPK/CREB通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-145-3p mimics后,PD細(xì)胞模型中p-CaMkkβ、p-AMPK、p-CREB水平升高,表明miR-145-3p具有調(diào)控CaMkkβ/AMPK/CREB通路的作用。為了進(jìn)一步明確其機(jī)制,該實(shí)驗(yàn)又利用CaMkkβ抑制劑STO-609和CERB抑制劑KG-501處理細(xì)胞,結(jié)果顯示,STO-609和KG-501均能降低MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中p-CaMkkβ、p-AMPK、p-CREB的水平,且轉(zhuǎn)染miR-145-3p mimics后細(xì)胞中p-CaMkkβ、p-AMPK、p-CREB的水平均升高,這表明miR-145-3p可通過促進(jìn)CaMkkβ/AMPK/CREB通路的激活來促進(jìn)線粒體自噬,從而發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。