余俊杰，韓剛，周志磊,3，唐俊*，毛健,3

1.阜陽師范大學生物與食品工程學院（阜陽 236037）；2.江南大學食品學院，糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心（無錫 214122）；3.江南大學（紹興）產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院（紹興 312000）

冰淇淋是一種具有誘人風味和細膩口感的冷凍飲品，據(jù)統(tǒng)計，2017年全球冰淇淋市場總市值為570億美元，并且將在2024年達到750億美元[1]。冰淇淋有著廣泛的消費群體（兒童，成年人甚至是老人）、合適的營養(yǎng)成分（糖類，蛋白質(zhì)和脂肪）以及良好的理化性質(zhì)（偏堿性）。隨著消費者對健康飲食需求的增加[2]，越來越多的功能性冰淇淋問世，如低熱量的代糖代脂冰淇淋[3-4]、益生菌冰淇淋[5]和能滿足一些有著特殊營養(yǎng)需求如糖尿病患者等特殊群體的功效成分冰淇淋[6]等。益生菌冰淇淋是指添加了有益的活性微生物的冰淇淋，這些活性微生物有著改善人體腸道微生物環(huán)境[7]、預防齲齒[8]、改善消化[9]等豐富的保健功效。

通常益生菌冰淇淋需要在其保質(zhì)期內(nèi)保證自己的活益生菌數(shù)量在～CFU/g[10]以上，但因為冰淇淋的生產(chǎn)過程、儲藏條件以及原材料的特性都可能會對益生菌造成傷害，所以需要充分考慮益生菌存活率的影響因素和采取一定的保護技術(shù)。

1 影響益生菌存活率的主要因素

1.1 生產(chǎn)原料的影響

作為冰淇淋的主要原料和益生菌存活的主要載體，乳品的種類對于益生菌存活率有著重要的影響。原料乳可以提供營養(yǎng)配比均勻的蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物（主要是乳糖）。目前，用于制作冰淇淋的原料乳已經(jīng)不再局限于牛奶，關(guān)于以綿羊奶[11]、山羊奶[12]和駱駝奶[13]等動物奶為原料制作的冰淇淋的嘗試都在不斷開展。并且其中山羊奶相比牛奶具有固形物含量高、加工過程中無需均質(zhì)化以及脂肪含量高等優(yōu)勢。除了動物乳以外，一些植物乳也可以作為冰淇淋的原料，Aziz等[14]利用大豆加工的豆乳制作冰淇淋，豆乳具有pH適中，總固形物含量高并且含有益生元寡糖（大豆低聚糖）等特點，該試驗結(jié)果中，大豆冰淇淋中益生菌在冷凍后180 d內(nèi)活菌數(shù)下降趨于穩(wěn)定，始終在106CFU/g之上，表明豆乳是益生菌的合適載體。

冰淇淋中通常會添加一些水果作為風味配料，這樣不僅可以改善冰淇淋的口感，也可以增加冰淇淋的營養(yǎng)價值。一些水果冰淇淋如桃金娘果[15]，葡萄和核桃[16]都已經(jīng)被證明對食物中的益生菌的存活率有影響。這種影響的主要方式可能是果肉中的一些有機酸和糖分改變產(chǎn)品的pH和化學環(huán)境。Kavas[17]在用駱駝奶制成的冷凍酸奶中添加了草莓和番石榴，增加了冰淇淋中嗜酸性乳桿菌的存活率（Lacticaseibacillus casei431）。El-Shenawy等[18]在冰淇淋中添加了老虎果提取物，結(jié)果表明，用50%老虎果提取物替代水生產(chǎn)冰淇淋效果最好，在提高了益生菌菌株的存活率的同時，還改善了冰淇淋的理化性質(zhì)。風味配料對于冰淇淋理化性質(zhì)和生物學環(huán)境的影響是多種多樣不可忽視的，所以具體的風味配料對冰淇淋中益生菌存活率的影響可能還是需要單獨考察。

甜味劑也是冰淇淋的重要配料，其類型和濃度也可能對益生菌存活有影響。Pay等[19]觀察到，添加了未精制椰子棕櫚糖的冰淇淋相比使用精制蔗糖的產(chǎn)品呈現(xiàn)出更高的益生菌存活率。此外，試驗結(jié)果還表明添加18%糖的產(chǎn)品比添加15%或21%糖的產(chǎn)品具有更高的益生菌活力。這可能是由于高糖分會造成比較強的滲透壓，從而不利于益生菌的生存，而糖分過少則會無法滿足益生菌的碳源需要。用多元醇如赤蘚糖醇、木糖醇、異麥芽酮糖醇和麥芽糖醇作為甜味劑的冰淇淋中冷凍和儲藏過程后益生菌數(shù)量都保持在較高的水平[20]，但是赤蘚糖醇的添加會導致冰淇淋的硬度變小，從而使口感變差。

此外，配料中如果添加了膳食纖維或者其他益生元，同樣可以顯著地提升冰淇淋中的益生菌的存活率。Hanafi等[21]對植物乳桿菌（L.plantarum）進行了不同膳食纖維添加量的對比試驗，試驗結(jié)果表明，膳食纖維添加量最高的一組中益生菌的存活率也越高，這可能是因為膳食纖維可以在益生菌生長過程中起到益生元的作用，并且膳食纖維本身具有一定的物理保護作用，能夠保護益生菌免受冷凍損傷和機械應力的剪切以及在冷凍混合過程中的凍傷。

1.2 生產(chǎn)工藝的影響

冰淇淋中大部分益生菌都是微氧或者厭氧的，因此，氧氣的含量對于益生菌的存活率有著重要的影響[22]。此外，在冷凍過程中氧氣會對膜脂和細胞蛋白質(zhì)造成損害[23]。此外，如果溶解氧進入了厭氧的益生菌細胞內(nèi)，就會導致毒性含氧代謝物（如超氧陰離子）在細胞內(nèi)積累，從而降低益生菌的生存能力[24]。

由于冷凍過程中冰晶的形成，細胞在冷凍過程中所受到的傷害通常比低溫儲存時受到的傷害更大[25]。冷凍過程中不僅形成的冰晶會對細胞膜造成機械傷害，短時間的溫度下降也會導致細胞蛋白質(zhì)變性和細胞膜的結(jié)構(gòu)損傷。由于冰晶的形成，液體形態(tài)的游離水會減少，從而升高細胞內(nèi)物質(zhì)濃度，甚至可能會發(fā)生質(zhì)壁分離，最終導致細胞膜的破裂[23]。不同的降溫速度對于冰晶形成的大小具有一定程度上的影響，快速冷凍會產(chǎn)生數(shù)量多的小冰晶；而慢速冷凍則會產(chǎn)生大冰晶[26]。但是這并不能保證快速冷凍一定可以提升益生菌的活性，Baati等[27]的試驗表明，在一些情況下預冷凍和慢速冷凍可以提升細胞對低溫的抗性。相比直接快速降溫的對照組，經(jīng)過低溫孵育6 h的試驗組的存活率和活性更高。嘗試分階段降溫的方法可能也是規(guī)避冷凍時益生菌損失的一種方法。

冰晶形成對于不同的益生菌所造成的傷害也不同，Sheu[28]對保加利亞乳桿菌的兩個代表菌株（L2和rr）進行了冷凍試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在同樣的條件下，細胞體積比較小的L2的存活率（45%）遠高于細胞體積比較大的rr的存活率（5%），所以選用細胞體積更小的益生菌可以減少它們在冷凍過程中受到的機械損傷。

1.3 儲藏溫度的影響

冰淇淋通常都需要長期的低溫儲藏，儲藏過程中的低溫會抑制益生菌的生長和繁殖，并且在大部分情況下冰淇淋的儲藏溫度都會有一定幅度上的變化。Ullah等[29]通過對馬鈴薯細胞進行4個不同冷凍儲藏處理（恒溫-80 ℃；在-17～-16，-17～-11和-17～-7 ℃之間波動）觀察溫度變化對冰晶粒度分布的影響。結(jié)果表明，細胞和細胞間隙中的晶體生長也受到儲存期間溫度變化的影響，隨著溫度波動幅度的增加，冰晶的生長也會越大，從而對細胞的損傷也越大。Park等[30]發(fā)現(xiàn)不同的儲藏溫度對冰晶的生長也有一定的影響，在長達52周的貯藏期間，4種儲藏溫度（-18，-30，-50和-70 ℃）下的冰淇淋冰晶尺寸有不同的變化。其中-18 ℃下的冰淇淋冰晶尺寸增長的幅度最大，從40.3 μm增長到了100.1 μm，而-50 ℃和-70 ℃下的冰淇淋冰晶則是從40.3 μm增長到了57～58 μm。并且不僅是只有在-50 ℃或者-70 ℃的溫度下，即便是在-10 ℃和-20 ℃的差別下，細菌的存活率也有著顯著的差別[26]。

1.4 其他影響

益生菌的種類也可能會影響到最終的存活率。與雙歧桿菌相比，乳桿菌對有害條件有著更高的抗性[31-32]。Ferraz等[33]研究了不同冰淇淋的膨脹率對益生菌存活的影響，結(jié)果表明低膨脹率的冰淇淋中嗜酸乳桿菌的活性相對較高。益生菌的冷凍應激機制雖然未被探明，但是Streit等[34]在提高保加利亞乳桿菌的耐冷凍能力的試驗中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過30 min酸化預處理的乳桿菌有著更好的抗冷凍性能，說明一些乳桿菌的酸應激和冷應激機制可能存在一定程度上的關(guān)聯(lián)。

2 益生菌保護技術(shù)

2.1 微膠囊化

微膠囊技術(shù)是利用特殊材料通過乳劑、噴霧干燥、電噴霧和反乳化等微膠囊化手段[35-36]，將目標物包裹在很小的微型膠囊壁內(nèi)的一種包裝技術(shù)。這項技術(shù)應用在保護冰淇淋中的益生菌時也同樣表現(xiàn)出良好的效果。Afzaal等[37]用海藻酸鈉和卡拉膠作為材料對益生菌細胞進行包封，顯著地提高了益生菌的存活率和活力。而Zanjani等[38]對比了采用海藻酸鈣、小麥、大米、玉米淀粉、殼聚糖和聚賴氨酸不同材料作為微膠囊涂層對益生菌存活率的影響。結(jié)果表明，低聚糖和聚賴氨酸作為涂層的微膠囊方案優(yōu)于采用淀粉作為涂層的方案，而淀粉中，玉米淀粉的效果又優(yōu)于小麥和大米淀粉。除此之外，乳清濃縮蛋白、海藻酸鈣[39]和魔芋葡甘聚糖水解物[40]也可以用作冰淇淋微膠囊的壁材?？偟膩碚f，與游離細胞相比，微膠囊化促進了益生菌在加工和儲存過程以及模擬腸道中的存活率的提高，主要是保護益生菌免受水結(jié)晶所造成的傷害，并且增加了厭氧的益生菌對氧氣的抵抗[35]，從而起到了保護益生菌的效果。

2.2 冷凍保護劑

向細菌懸液中添加冷凍保護劑是最常見的保護手段之一。一般情況下冷凍保護劑都是水溶性的，可以降低冰的熔點。當冰晶開始形成時，益生菌會被固體冰晶擠到還沒有結(jié)冰的水溶液中，所以如果添加冷凍保護劑，那么相當于擴大了未結(jié)冰的部分區(qū)域，也就給了益生菌更多的生存空間，從而降低益生菌機械壓力和滲透應力的損傷[41]。一些糖類被證明有冷凍保護劑的功能，Chen等[42]研究了冷凍干燥對開菲爾酸奶中微生物存活的影響，并測定了凍干前添加到開菲爾中的凍干保護劑（半乳糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖和海藻糖）對益生菌存活率的影響。結(jié)果表明，添加10%半乳糖或蔗糖作為冷凍保護劑顯著提高了乳酸菌和酵母菌的存活率。賴田甜等[43]向含有益生性植物桿菌YW 11的冰淇淋中添加了低聚果糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這不僅能提高益生菌的整體活性，也可以改善冰淇淋的理化性質(zhì)。

除了水溶性的保護劑之外，飽和單甘酯結(jié)構(gòu)乳液也可以作為冷凍保護劑。在這種復雜結(jié)構(gòu)中的細菌可能將其自身普遍地置于單酸甘油酯晶體結(jié)構(gòu)附近的水性區(qū)域中，在那里它們可以找到一些疏水的營養(yǎng)物質(zhì)并且承受更小的環(huán)境壓力，從而起到保護益生菌的效果[44]。

2.3 其他保護技術(shù)

除了微膠囊化益生菌和向冰淇淋中添加冷凍保護劑之外，還有一些其他技術(shù)也可以提升益生菌的存活率。比如Terpou等[45]采用微生物固定化技術(shù)，將益生菌干酪乳桿菌ATCC393固定化在沙棘果中并添加到冷凍酸奶里面，經(jīng)過90 d/-18 ℃的低溫儲藏之后，益生菌存活率仍然處于較高水平，而對照組游離益生菌細胞的存活率則下降了10%。但并非所有的益生菌固定化都可以提升益生菌存活率。Pornpan[46]以香蕉粉為載體固定化益生菌，采用益生菌Lactobacillus caseiTISTR 1463和Lactobacillus acidophilusTISTR 1338所制作的冰淇淋經(jīng)過低溫儲存后的益生菌存活率和對照的游離益生菌組并沒有顯著差異。所以應當充分考慮菌種和固定化載體對固定化保護效果的影響。益生菌在低溫環(huán)境下的抗冷凍脅迫機制還未被探明，因此添加一些能夠刺激細胞活性的輔酶也有可能提高細胞的活性。比如有向冰淇淋中添加抗壞血酸的研究，結(jié)果表明抗壞血酸可以刺激冰淇淋中嗜酸乳桿菌等益生菌的生長，這可能意味著一些維生素也具有一定的益生菌保護作用[47]。

3 結(jié)語與展望

益生菌的存活很大程度上取決于它的食品基質(zhì)，所以在益生菌冰淇淋的生產(chǎn)時應充分考慮乳品種類和配料對益生菌存活率的影響，針對特定的益生菌菌種進行冰淇淋配方的優(yōu)化是有必要的。大部分益生菌都是厭氧菌，所以在冷凍攪拌時應當控制氧氣含量，防止益生菌氧中毒。在冷凍成型階段，溫度變化速度會刺激益生菌的低溫脅迫機制和導致冰晶形成對益生菌造成的物理損傷，所以不能夠盲目的加快降溫速度，具體工藝參數(shù)還需試驗進行優(yōu)化。此外，在儲存過程中應當盡量避免溫度的大幅度波動。

一些益生菌保護技術(shù)如微膠囊化和添加冷凍保護劑等方法都已經(jīng)被證明在益生菌冰淇淋生產(chǎn)中可以有效的提高益生菌的存活率，但是具體的微膠囊化方法和冷凍保護劑的類型對于不同冰淇淋中益生菌的存活率的影響還沒有得到有針對的研究。

冰淇淋市場的競爭日趨激烈，低熱量、功能化和口感好的新型益生菌冰淇淋將會成為市場追逐的熱點。但關(guān)于冰淇淋中益生菌的損傷機制的探究目前還停留在起步階段，具體生產(chǎn)過程中加工工藝的各個環(huán)節(jié)與益生菌損傷之間的聯(lián)系還有待進一步的明確。