王佳樂 步凡 何佳麗 呂德國

摘要：通過研究不同供銅（Cu）水平對(duì)蘋果幼苗生長、光合作用、Cu富集情況和氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，探究蘋果苗Cu脅迫閾值，旨在為蘋果抗逆栽培提供理論指導(dǎo)。以寒富蘋果為試材，設(shè)置不同濃度（60、180、300、600、900 mg/kg）Cu處理，處理后60 d取樣，測(cè)定幼苗各組織生物量、根系形態(tài)、光合特性、各器官Cu含量以及總Cu含量、活性氧、抗氧化物含量和抗氧化物酶活性。結(jié)果表明，當(dāng)Cu脅迫濃度超過300 mg/kg時(shí)，幼苗各器官生物量顯著降低，根系形態(tài)指標(biāo)（總根長、根總表面積、根總體積）、葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、PSⅡ最大光化學(xué)效率、光合性能指數(shù)均呈下降趨勢(shì)。各組織Cu含量為根＞葉＞莖。隨著Cu濃度提高，幼苗各組織中活性氧物質(zhì)積累，總硫醇、可溶性酚、抗壞血酸等物質(zhì)含量及超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等酶活性以300 mg/kg為臨界點(diǎn)，呈先增高后降低趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞：銅；蘋果；脅迫；幼苗生長；生理響應(yīng)

中圖分類號(hào)：S661.101文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）16-0105-08

收稿日期：2022-05-15

基金項(xiàng)目：遼寧省興遼英才計(jì)劃-青年拔尖人才項(xiàng)目（編號(hào)：XLYC1907105）；遼寧省教育廳科學(xué)研究經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（編號(hào)：LSNQN201916）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號(hào)：CARS-28）。

作者簡(jiǎn)介：王佳樂（1998—），男，甘肅平?jīng)鋈?，碩士研究生，主要從事果樹栽培與生理生態(tài)研究。E-mail：wjl1655294867@163.com。

通信作者：何佳麗，博士，副教授，主要從事果樹栽培與生理生態(tài)研究。E-mail：hejiali1017@163.com。

近年來由于工業(yè)廢料排放，化肥、農(nóng)藥的過量施用導(dǎo)致果園銅（Cu）污染問題日益嚴(yán)重。相關(guān)研究表明，我國環(huán)渤海灣優(yōu)勢(shì)蘋果產(chǎn)區(qū)因臨近工礦業(yè)，且存在嚴(yán)重的盲目施用化肥、農(nóng)藥現(xiàn)象，導(dǎo)致土壤中Cu過量積累^［1］。單正軍等對(duì)江蘇徐州大沙園30處蘋果園及山東即墨12處蘋果園的銅含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)分別有6.7%和8.3%的土壤Cu含量遠(yuǎn)超果園土壤Cu含量的二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)^［2］。因此，果園土壤Cu污染已成為果樹生產(chǎn)中亟需解決的重要問題。

Cu是自然界中廣泛存在的重金屬元素，是植物體內(nèi)的微量營養(yǎng)元素之一，參與光合電子傳遞作用、碳同化和氮代謝等多種生理反應(yīng)^［3］。但土壤Cu含量超標(biāo)會(huì)影響植物根系正常發(fā)育、抑制光合呼吸作用、減少葉片色素含量，進(jìn)而導(dǎo)致植株生長受損^［4-5］。過量Cu還能導(dǎo)致活性氧（ROS）的產(chǎn)生，使細(xì)胞膜脂過氧化，從而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能。為了緩解Cu脅迫引起的氧化損傷，植物會(huì)通過激活抗氧化防御系統(tǒng)來抵御毒害。其中游離脯氨酸、可溶性酚、抗壞血酸等抗氧化物質(zhì)與超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等酶類物質(zhì)，在ROS清除過程中發(fā)揮重要作用^［6-7］。目前，關(guān)于Cu脅迫對(duì)植物生長發(fā)育及生理特性的影響已在許多農(nóng)作物如小麥、玉米、辣椒上開展^［8-10］，但Cu脅迫對(duì)蘋果影響的研究較少，其耐Cu脅迫閾值尚不明確。鑒于此，本研究以東北冷涼氣候區(qū)廣泛栽植的寒富蘋果幼苗為試材，通過設(shè)置不同濃度Cu處理，來探索Cu脅迫對(duì)蘋果幼苗生長發(fā)育及生理特性的影響。旨在為明確寒富幼苗的耐Cu閾值提供理論基礎(chǔ)，為農(nóng)戶合理施用含Cu肥料及相關(guān)制劑提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試材及取樣

本試驗(yàn)于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹科研基地（123°341′E，41°491′N）進(jìn)行。以一年生寒富蘋果（Malus domestica Borkh.）枝條為接穗，山定子（Malus baccata Borkh.）為砧木，于2018年4月采用芽接的方式進(jìn)行嫁接。培養(yǎng)期間每天澆Hoagland營養(yǎng)液（Cu濃度為0.5 μmol/L）50 mL^［11］，以滿足試材的正常生長需要，待其長到15～20 cm時(shí)進(jìn)行Cu處理。選取長勢(shì)一致的幼苗，移栽至20 cm×20 cm 的營養(yǎng)缽內(nèi)進(jìn)行沙培，每個(gè)營養(yǎng)缽裝有4 kg沙子［Cu濃度背景值為（1.03±0.2） mg/kg］。以Hoagland營養(yǎng)液中的基礎(chǔ)Cu濃度為對(duì)照（CK），額外添加不同濃度的CuSO₄溶液為處理，分別為T1，60 mg/kg；T2，180 mg/kg；T3，300 mg/kg；T4，600 mg/kg；T5，900 mg/kg。共計(jì)6個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)6次重復(fù)，培養(yǎng)60 d后收獲試材，用于指標(biāo)測(cè)定。試材收獲前，用蒸餾水沖洗各株幼苗，除去根系表面的Cu²⁺及植株上的雜質(zhì)。然后將各組織分別收取，記錄鮮質(zhì)量。取好的樣品放入液氮中，于超低溫冰箱保存，以便進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目

1.2.1 生物量、根系構(gòu)型 稱取100 mg左右的各組織鮮樣于60 ℃下烘干，測(cè)定其干質(zhì)量、干濕比與生物量。將幼苗根洗凈后，利用WinRHIZO根系掃描系統(tǒng)（WinRHIZO 2012，Regent Instruments Canada INC.，Montreal，Canada）測(cè)定各個(gè)植株的根系構(gòu)型。

1.2.2 光合參數(shù)及熒光參數(shù)的測(cè)定 在試材收獲之前對(duì)幼苗成熟葉（LPI=7～9）進(jìn)行測(cè)定，利用CIRAS-2光合儀測(cè)定葉片的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率及胞間CO₂濃度。利用Handy-PEA連續(xù)激發(fā)式熒光儀測(cè)定葉片的PSⅡ最大化學(xué)效率及光合性能指數(shù)。

1.2.3 Cu含量、總Cu量、富集系數(shù)及轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)的測(cè)定 稱取各組織鮮樣（根取0.5 g左右，莖和葉各取0.7 g左右）進(jìn)行消煮（溫度100 ℃，穩(wěn)定于 200 ℃），利用火焰原子吸收分光光度計(jì)（Hitachi 180-80，HitachiLtd，Tokyo，Japan）測(cè)定各組織Cu含量和總Cu量^［12］。根據(jù)各組分的Cu含量與土壤中Cu含量的比值，來計(jì)算富集系數(shù)（BCF）。用幼苗地上部分Cu含量與根系部分Cu含量的比值，計(jì)算樣品的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（T_f）。

1.2.4 O^-₂·、H₂O₂和MDA含量測(cè)定 超氧陰離子（O^-₂·）、過氧化氫（H₂O₂）的測(cè)定分別參照Zhou等^［13］、He等^［14］的方法。丙二醛（MDA）含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法，取上清液利用分光光度計(jì)測(cè)定待測(cè)溶液450、532、600 nm處的吸光度。

1.2.5 抗氧化物的測(cè)定 總硫醇（T-SH）含量的測(cè)定參照Zhou等的方法^［11］，可溶性酚、谷胱甘肽（TG）、還原型谷胱甘肽（GSH）及氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量的測(cè)定參照He等的方法^［12］。總抗壞血酸（TA）、抗壞血酸（ASC）和脫氫抗壞血酸（DHA）含量的測(cè)定分別使用抗壞血酸含量測(cè)定試劑盒（微板法）和脫氫抗壞血酸含量測(cè)定試劑盒（微板法）2種試劑盒（蘇州格銳思生物科技有限公司）測(cè)定。超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）、過氧化物酶（POD）及過氧化氫酶（CAT）的活性測(cè)量方法參照Wang等的方法^［15］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics軟件對(duì)本試驗(yàn)中所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。所有數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)與分析前會(huì)進(jìn)行正態(tài)分布檢測(cè)。方差分析F檢驗(yàn)當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu脅迫對(duì)蘋果幼苗生長的影響

由圖1所示，當(dāng)Cu濃度超過300 mg/kg，幼苗表現(xiàn)出明顯的Cu脅迫現(xiàn)象。表現(xiàn)為株高降低，根系整體褐色加深、主根變短、側(cè)根與白根數(shù)量減少，并且出現(xiàn)葉片變小且葉片邊緣發(fā)生卷曲現(xiàn)象。

由表1可知，當(dāng)Cu脅迫濃度為60、180 mg/kg時(shí)，幼苗生物量和根構(gòu)型相關(guān)參數(shù)與對(duì)照相比無顯著差異。但當(dāng)Cu脅迫濃度超過300 mg/kg，植株生物量、根構(gòu)型均有顯著降低趨勢(shì)，并且這種不利影響隨Cu脅迫濃度的增加而增大。最高濃度處理（T5）與對(duì)照相比，根質(zhì)量、莖質(zhì)量以及葉質(zhì)量分別降低了40.23%、42.46%和33.29%；總根長、根總表面積和根總體積分別降低了31.26%、12.04%和33.53%，這與試材生長狀況表現(xiàn)一致。

由表2可知，蘋果幼苗的凈光合速率與氣孔導(dǎo)度在Cu處理濃度超過300 mg/kg后呈顯著下降趨勢(shì)，最高處理（T5）與對(duì)照相比，分別下降57.81%和65.12%。胞間CO₂濃度在Cu脅迫濃度為 180 mg/kg后逐漸下降。PSⅡ最大化學(xué)效率和光合性能指數(shù)在Cu濃度≥300 mg/kg后顯著下降。最高濃度下葉片的PSⅡ最大化學(xué)效率和光合性能指數(shù)與對(duì)照相比分別下降了13.01%和78.32%。

2.2 Cu脅迫對(duì)蘋果幼苗中Cu含量的影響

由圖2可知，蘋果幼苗各組織Cu含量為根＞砧木莖>葉＞莖，其中地下部（根）的Cu含量遠(yuǎn)大于地上部。各組織的Cu含量隨著Cu處理濃度的增加而逐漸增大，當(dāng)Cu處理濃度超過300 mg/kg后，根中的Cu含量大幅提高。

由圖3-a可知，根中總Cu量整體最多，其次是砧木莖，接穗莖、葉組織相對(duì)較少。各組織的總Cu量隨著Cu處理濃度的增加而逐漸增大，當(dāng)Cu濃度高于300 mg/kg，根系中總Cu量急劇增加。BCF以180 mg/kg的Cu處理濃度為臨界點(diǎn)，表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)（圖3-b）。無論在多少濃度的環(huán)境下，幼苗地上部分的T_f都是砧木莖＞葉＞莖，且隨著Cu濃度提高，砧木莖和葉的Tf呈下降趨勢(shì)（圖3-c）。

2.3 Cu脅迫對(duì)蘋果幼苗O^-₂·、H₂O₂和MDA含量的影響

如圖4所示，隨著Cu濃度提高，寒富蘋果幼苗根、莖和葉中O^-₂·含量逐漸增加，并在Cu脅迫濃度為900 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值。與對(duì)照相比，各組織的H₂O₂含量在低濃度（60、180 mg/kg）Cu脅迫下有小幅增加，但當(dāng)Cu濃度超過300 mg/kg時(shí)，其含量顯著增加（圖4-b）。MDA含量的變化趨勢(shì)與O^-₂·和H₂O₂含量類似（圖4-c）。

2.4 Cu脅迫對(duì)蘋果幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響

由圖5可知，Cu脅迫誘導(dǎo)了幼苗各組織中游離脯氨酸的積累。當(dāng)Cu濃度超過300 mg/kg，根和葉中游離脯氨酸的含量急劇增加（圖5-a1～圖5-a3）。最高濃度Cu處理與對(duì)照相比，根、莖、葉中游離脯氨酸的含量分別提高了77.94%、34.11%和71.57%。與對(duì)照相比，根中總硫醇含量隨著Cu濃度的提高顯著下降，其中根系下降幅度最大，最高濃度處理時(shí)較CK下降了43.29%，而莖則以 300 mg/kg 的Cu濃度為臨界點(diǎn)呈先上升后下降的趨勢(shì)（圖5-b1～圖5-b3）。由圖5-c1～圖5-c3可知，隨著Cu濃度提高，根系可溶性酚含量逐漸降低。莖中的可溶性酚含量以300 mg/kg Cu處理濃度為臨界點(diǎn)，表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。而各組織中GSH含量以300 mg/kg的Cu濃度為臨界點(diǎn)，呈先增多后減少的趨勢(shì)（圖5-d1～圖5-d3）。

由圖6可知，隨著Cu濃度提高，幼苗各組織中SOD活性變化各不相同，其中根和莖部分以 300 mg/kg 的Cu濃度為臨界點(diǎn)，隨Cu濃度提高，呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。葉片部分則隨著Cu濃度的升高，SOD活性顯著下降，并且葉片中SOD活性明顯低于莖和根（圖6-a1～圖6-a3）中。與對(duì)照相比，除莖中T5濃度以外，根與莖中CAT活性均隨著Cu濃度提高而顯著降低，葉片部分則是以 300 mg/kg 的Cu濃度為臨界點(diǎn)表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)（圖6-b1～圖6-b3）。對(duì)于APX活性而言，與對(duì)照相比，根系和葉片部分的APX活性均以300 mg/kg為臨界點(diǎn)表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，而莖中則逐漸下降，其中根系部分APX活性最高（圖6-c1～圖6-c3）。各組織中的POD活性變化與SOD活性變化趨勢(shì)一致，莖中POD活性最高，葉片中POD活性遠(yuǎn)低于根、莖（圖6-d1～圖6-d3）。對(duì)于GR活性來說，與對(duì)照相比，當(dāng)Cu濃度低于300 mg/kg時(shí)幼苗根系的GR活性顯著提高，高于這個(gè)濃度之后呈顯著降低的趨勢(shì)。而莖和葉部分的GR活性隨著Cu濃度的提高表現(xiàn)出下降趨勢(shì)（圖6-e1～圖6-e3）。

3 討論

Cu在植物生理代謝過程中發(fā)揮重要作用，一般認(rèn)為植物組織中Cu含量以5～30 mg/kg為宜^［16-17］。當(dāng)植物中的Cu濃度超過臨界限值時(shí)會(huì)對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生毒性，抑制植物生長^［18-19］。黎建玲等發(fā)現(xiàn)當(dāng)Cu濃度大于50 mg/L 時(shí)，南瓜種子萌發(fā)和幼苗根系的生長會(huì)被顯著抑制^［20］；韓承華等在五月慢油菜上發(fā)現(xiàn)當(dāng)Cu濃度大于90 mg/L 時(shí)，試材根系發(fā)育受損，植株會(huì)有死亡現(xiàn)象發(fā)生^［21］。本研究表明，蘋果幼苗對(duì)Cu的耐受濃度為300 mg/kg，當(dāng)Cu濃度過高，幼苗總根長、根總表面積和根總體積均顯著下降。這可能與高Cu濃度引起氣孔導(dǎo)度下降、CO₂供應(yīng)受阻，致使凈光合速率降低、光合底物減少有關(guān)。對(duì)葉綠素?zé)晒鈪?shù)的分析可知，高濃度Cu處理下，葉片PSⅡ最大化學(xué)效率和PIabs均呈下降趨勢(shì)，進(jìn)一步說明Cu脅迫會(huì)顯著抑制幼苗葉片的光合作用，影響根系生長，降低幼苗生物量。

植物通過將重金屬滯留在根中來減弱其毒害作用。本研究通過對(duì)各組織中Cu含量和總Cu量進(jìn)行測(cè)定，表明蘋果幼苗可以將大部分的Cu滯留在根中，從而抑制Cu向地上部分轉(zhuǎn)運(yùn)，生物富集系數(shù)也明確了這一現(xiàn)象，這與前人研究結(jié)果^［22］類似。在本試驗(yàn)中，蘋果幼苗的Cu轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)以180 mg/kg為臨界點(diǎn)，呈先升高再降低的變化趨勢(shì)，這可能是因?yàn)楫?dāng)Cu濃度達(dá)到300 mg/kg時(shí)，其根系受損，導(dǎo)致向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)能力降低。

Cu脅迫會(huì)誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生與MDA的積累，對(duì)植物造成氧化脅迫，從而對(duì)植物生長產(chǎn)生抑制，嚴(yán)重時(shí)甚至引起細(xì)胞死亡^［23］。這一現(xiàn)象在甘蔗、粉葛、菠菜等植物中已經(jīng)被證實(shí)^［24-26］。雖然低濃度的ROS可作為信號(hào)分子參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)^［27］，但當(dāng)濃度高于細(xì)胞所能承受的限度時(shí)，會(huì)以極強(qiáng)的氧化性造成細(xì)胞膜脂過氧化，影響蛋白質(zhì)、脂質(zhì)甚至核酸的功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷乃至死亡^［28］。本試驗(yàn)表明，隨著Cu濃度提高，幼苗各組織中O^-₂·與 H₂O₂含量均有增加趨勢(shì)。當(dāng)Cu濃度超過300 mg/kg時(shí)，各組織中的MDA含量顯著增加，這可能是活性氧的積累促進(jìn)MDA的產(chǎn)生，膜透性增加受損^［29］。進(jìn)一步說明隨著Cu濃度增大，蘋果幼苗細(xì)胞膜受到的傷害越嚴(yán)重。由此可以判斷此時(shí)幼苗已經(jīng)開始受到Cu脅迫傷害，且隨著細(xì)胞膜脂過氧化程度加深，幼苗生理代謝受到影響，最終表現(xiàn)為生長受到抑制。

為了免受ROS侵害，植物進(jìn)化出一系列復(fù)雜的防御機(jī)制來避免或減少氧化損傷^［30-32］，游離脯氨酸為其中重要的物質(zhì)之一。在植物組織中廣泛積累的游離脯氨酸一方面能協(xié)調(diào)原生質(zhì)體內(nèi)外的滲透平衡，提高植物的抗氧化能力^［33］；另一方面可與總硫醇、可溶性酚共同作為非酶類抗氧化劑參與活性氧清除。蔣英等研究指出，Cu脅迫條件下，絲瓜中游離脯氨酸含量呈顯著上升趨勢(shì)，且隨Cu 濃度的提高而提高^［34］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Cu濃度超過300 mg/kg，各組織中脯氨酸含量急劇上升，而總硫醇和可溶性酚含量并未隨著Cu濃度提高而逐漸增加，這可能說明總硫醇和可溶性酚不是蘋果幼苗抵抗Cu脅迫的關(guān)鍵ROS清除物質(zhì)。

谷胱甘肽-抗壞血酸循環(huán)是保護(hù)植物細(xì)胞免受氧化脅迫的重要途徑^［35］。GSH的提高有助于清除活性氧。闞世紅等研究發(fā)現(xiàn)，外源硫酸鈉可以通過維持高水平的GSH來降低膜脂過氧化程度，緩解Cu脅迫對(duì)生菜幼苗生長的抑制^［36］。本試驗(yàn)中，當(dāng)Cu濃度低于300 mg/kg時(shí)，幼苗根中GSH的含量呈上升趨勢(shì)，這使GSH被積累，有利于清除由Cu脅迫導(dǎo)致的過量ROS。此外，植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)也在遭受氧化脅迫時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究表明，當(dāng)蘋果幼苗受到Cu脅迫時(shí)，根中的SOD、APX、POD、GR，莖中SOD、POD以及葉中CAT、APX的活性均顯著升高。但當(dāng)Cu濃度高于300 mg/kg，這些酶的活性均出現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能是由于此時(shí)的Cu濃度已超過了植物的調(diào)節(jié)能力范圍，導(dǎo)致酶活性降低^［37］，這與李曉梅等的研究結(jié)果^［38-39］一致。

綜上，本研究分析比較了不同供Cu水平下幼苗生長發(fā)育情況及對(duì)活性氧和抗氧化物的影響，表明300 mg/kg的Cu濃度是寒富幼苗能忍耐的最高限度，有助于探明蘋果對(duì)Cu脅迫的抵御機(jī)制，為明確寒富幼苗受Cu毒害的閾值提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

供Cu量過高（超過300 mg/kg）會(huì)抑制蘋果幼苗的正常生長，降低葉片光合作用，抑制根系發(fā)育。過量的Cu主要在根系中積累。Cu脅迫會(huì)導(dǎo)致ROS與MDA過量積累，造成氧化脅迫。雖然蘋果幼苗可通過提高抗氧化物含量及抗氧化酶活性來抵御Cu毒害，但當(dāng)Cu濃度超過300 mg/kg時(shí)抗氧化系統(tǒng)受到顯著抑制，這說明蘋果幼苗能忍耐的最高環(huán)境Cu濃度為300 mg/kg。

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