柳夢(mèng)思，時(shí)國(guó)強(qiáng)，高娜婷，焦義然，孫旭飛，孟亞南，董振國(guó)

（1.河北三獅生物科技有限公司，河北 石家莊 050035；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000）

近年來(lái)，公眾對(duì)肉制品的消費(fèi)需求逐年增長(zhǎng)［1～2］。隨著食品加工工藝不斷提高，很大程度改變了食材原有的色澤、味道、紋理、氣味等特性，傳統(tǒng)的感官鑒別技術(shù)已無(wú)法對(duì)食材的真?zhèn)芜M(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定［3-5］。其中，肉類及肉制品摻假已成為食品質(zhì)量控制面臨的重要挑戰(zhàn)之一［6］。由于鴨肉的紋理色澤和牛羊肉較為接近，一些不法商家為獲得高額利潤(rùn)，會(huì)以廉價(jià)的鴨肉冒充高價(jià)的牛羊肉進(jìn)行銷售［7-8］。因此，建立快速有效的鴨源性成分鑒定對(duì)于肉制品行業(yè)的監(jiān)管具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，肉類認(rèn)證檢測(cè)技術(shù)以定性檢測(cè)為主，主要包括光譜法、質(zhì)譜法、色譜法、酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction,PCR）法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）法等［9-18］。其中光譜法、質(zhì)譜法和色譜法需要昂貴且精密的儀器，所用試劑價(jià)格較高，檢測(cè)成本高，且對(duì)操作人員的專業(yè)素質(zhì)要求較高，限制了其在肉類檢測(cè)中的推廣應(yīng)用；ELISA 法操作步驟繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，且樣品加工處理可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，在加工肉制品中的應(yīng)用受到限制；PCR 法依賴于昂貴的熱循環(huán)儀，且需要繁瑣的凝膠電泳來(lái)判定結(jié)果；LAMP 由于其快速簡(jiǎn)便、儀器廉價(jià)等優(yōu)勢(shì)迅速發(fā)展起來(lái)［19-23］。但常規(guī)LAMP 法需要通過(guò)凝膠電泳法判定結(jié)果，無(wú)法進(jìn)行定量檢測(cè)，易產(chǎn)生非特性擴(kuò)增，造成“假陽(yáng)性”［24］。

本研究通過(guò)引入TapMan 探針，建立基于TapMan探針的實(shí)時(shí)熒光LAMP 方法（TaqMan-LAMP），與常規(guī)LAMP 法相比，TaqMan-LAMP 既可以實(shí)現(xiàn)定性檢測(cè)，又可以實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，可有效避免非特異性擴(kuò)增，為肉制品中鴨源性成分的定量檢測(cè)提供新的實(shí)用方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用動(dòng)物源樣品：包括鴨肉、牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、馬肉、驢肉、蝦肉、鴿子肉、鸚鵡肉、狐貍?cè)?、魷魚(yú)、鯉魚(yú)、鼠肉、水貂均購(gòu)自各大型超市及電商平臺(tái)的單一品類生鮮肉，并經(jīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T38164-2019［25］進(jìn)行驗(yàn)證。市售待檢樣品：通過(guò)菜市場(chǎng)、超市及各線上平臺(tái)共采購(gòu)了47 份牛、羊、豬肉制品，包括牛肉速凍水餃、羊肉速凍水餃、豬肉速凍水餃、牛肉干、牛肉卷、黑椒牛肉餡餅半成品、合成牛排、撒尿牛丸、牛肉漢堡餅、生羊肉串、熟羊肉串、羊肉卷、羊肉燒麥、羊肉烤包子、豬肉脯、豬肉四喜丸子、豬肉香腸、豬肉小籠包、牛肉小籠包等。

1.2 儀器

BBEX-32 全自動(dòng)核酸提取純化儀（廣州灣區(qū)生物科技有限公司）；Q162D 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（河北三獅生物科技有限公司）。

1.3 核酸提取

根據(jù)Baypure 磁珠法動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒（廣州灣區(qū)生物科技有限公司）說(shuō)明書(shū)要求對(duì)各樣品進(jìn)行DNA 提取，核酸樣本冷藏備用。

1.4 引物探針設(shè)計(jì)

從Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)中找到鴨線粒體cytb基因（GenBank：EU585609.1）序列保守區(qū)域，使用primer explorer v5 網(wǎng)站設(shè)計(jì)LAMP 引物組，包括內(nèi)引物（FIP/BIP）、外引物（F3/B3）及環(huán)引物（LB/LF）。分別使用LB/LF 設(shè)計(jì)為L(zhǎng)BP/LFP 探針，于3′端與5′端修飾熒光基團(tuán)-FAM 與淬滅基團(tuán)-BHQ1。引物及探針由上海生工合成，序列見(jiàn)表1 和表2。

表1 TaqMan-LAMP 引物和探針序列Table 1 The primer and probe sequences of TaqMan-LAMP

表2 熒光定量PCR 引物和探針序列Table 2 The primer and probe sequences of realtime fluorescence quantitative PCR

參照GB/T38164—2019 合成鴨源特異性引物和探針，序列見(jiàn)表2。

1.5 TaqMan-LAMP 檢測(cè)方法的建立

LAMP 檢測(cè)方 法包含：1×ThermoPol Buffer（Vazyme），8U Bst DNA Polymerase Large Fragment（Vazyme），1.4 mmol MgSO4（Vazyme），1.4 mmol dNTPs（Sanshibio），0.5 μL SYTO-9（life technology），F(xiàn)IP 和BIP 各2.0 μmol，F(xiàn)3 和B3 各0.5 μmol，0.5 μmol LB/LF，1.0 μL 模板DNA，（根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇是否添加），ddH2O 補(bǔ)足25 μL，反應(yīng)條件：60 ℃，1 min（采集熒光FAM），40 個(gè)循環(huán)。

TaqMan-LAMP 檢測(cè)方法包含：1×ThermoPol Buffer（Vazyme），8U Bst DNA Polymerase Large Fragment（Vazyme），5U Taq DNA polymerase（E001，Sanshibio），1.4 mmol MgSO4（Vazyme），1.4 mmol dNTPs（Sanshibio），F(xiàn)IP 和BIP 各2.0 μmol，F(xiàn)3 和B3 各0.5 μmol，1.5 μmol LB/LF 與LFP/LBP 組合，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇組合添加，1.0 μL 模板DNA，ddH2O 補(bǔ)足25 μL，反應(yīng)條件為：60 ℃，1 min（采集熒光FAM），40 個(gè)循環(huán)。

實(shí)時(shí)熒 光PCR 檢測(cè)方 法：2× Probe qPCR Mix（EH002，Sanshibio），F(xiàn)、R 和P 各5.0 μmol，5.0 μL 模板DNA，ddH2O 補(bǔ)足25 μL，反應(yīng)條件：95 ℃/2 min，95 ℃/15 s，65 ℃/80 s（采集熒光FAM），40 個(gè)循環(huán)。

1.6 特異性試驗(yàn)

使用TaqMan-LAMP 檢測(cè)方法分別對(duì)提取的鴨肉、牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、馬肉、驢肉、蝦肉、鴿子肉、鸚鵡肉、狐貍?cè)狻Ⅳ滛~(yú)、鯉魚(yú)、鼠肉及水貂等基因組DNA 檢測(cè)，以無(wú)酶無(wú)菌水為陰性對(duì)照，測(cè)試TaqMan-LAMP 體系的特異性。

1.7 靈敏度試驗(yàn)

將鴨肉與羊肉混合，使鴨肉質(zhì)量濃度依次為10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%，充分混勻后，進(jìn)行核酸提取，分別使用LAMP、TaqMan-LAMP 和實(shí)時(shí)熒光PCR 法對(duì)各梯度核酸模板進(jìn)行測(cè)試，并計(jì)算擴(kuò)增結(jié)果的線性相關(guān)系數(shù)（R2）＞0.980 為靈敏度合格。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

采用TaqMan-LAMP 檢測(cè)方法對(duì)低質(zhì)量濃度鴨源核酸樣品進(jìn)行8 次重復(fù)測(cè)試，以ddH2O 為陰性對(duì)照，對(duì)Ct值的變異系數(shù)CV值進(jìn)行計(jì)算，CV＜3%為靈敏度合格。

1.9 實(shí)際樣品檢測(cè)

同時(shí)使用LAMP、TaqMan-LAMP 和實(shí)時(shí)熒光PCR 法對(duì)市售47 份肉制品鴨源成分進(jìn)行檢測(cè)，以實(shí)時(shí)熒光PCR 作為對(duì)照，確定該檢測(cè)方法的相對(duì)敏感性、相對(duì)特異性、相對(duì)符合率，對(duì)該檢測(cè)方法作出評(píng)價(jià)。分別按下列公式進(jìn)行計(jì)算：

相對(duì)敏感性=真陽(yáng)性數(shù)/（真陽(yáng)性數(shù)+假陰性數(shù)）；

相對(duì)特異性=真陰性數(shù)/（真陰性數(shù)+假陽(yáng)性數(shù)）；

相對(duì)符合率=（真陽(yáng)性數(shù)+真陰性數(shù)）/被檢總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaqMan-LAMP 體系建立

在LAMP 檢測(cè)方法的內(nèi)引物（FIP、BIP）和外引物（F3、B3）上，加入不同環(huán)引物或環(huán)引物探針組合，分別建立了LAMP（無(wú)LB/LF）、LAMP（LF）、LAMP（LB）和LAMP（LB/LF）4 種LAMP 檢測(cè)體系，以及LAMP（LBP/LF）與LAMP（LB/LFP）2種TaqMan-LAMP 檢測(cè)方法，以熒光定量PCR 法作為對(duì)照，對(duì)同一鴨源核酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同檢測(cè)體系的檢測(cè)結(jié)果Table 3 Results of the different detection systems

結(jié)果顯示，所建立的恒溫檢測(cè)方法（Ct值對(duì)應(yīng)的即為檢測(cè)時(shí)間）相對(duì)于熒光定量PCR 法（Ct值為17.57，對(duì)應(yīng)的PCR 檢測(cè)時(shí)間約為32 min），檢測(cè)時(shí)間更短。雙環(huán)引物L(fēng)AMP 比無(wú)環(huán)引物及單環(huán)引物的檢測(cè)時(shí)間均更短，表明體系中加入的環(huán)引物在形成擴(kuò)增元過(guò)程中起到了加速的作用。將其中一條環(huán)引物引入熒光/淬滅基團(tuán)，由于LAMP（LBP+LF）較LAMP（LB+LFP）檢測(cè)時(shí)間更短，故優(yōu)選LAMP（LBP+LF）為TaqMan-LAMP 檢測(cè)體系進(jìn)行鴨源性成分檢測(cè)。

2.2 特異性檢測(cè)結(jié)果

為驗(yàn)證引物的特異性，本研究分別以提取的鴨肉、牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、馬肉、驢肉、蝦肉、鴿子肉、鸚鵡肉、狐貍?cè)狻Ⅳ滛~(yú)、鯉魚(yú)、鼠肉和水貂等基因組DNA 作為模板，以ddH2O 作為陰性對(duì)照，采用TaqMan-LAMP 方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖1 所示，只有鴨肉出現(xiàn)典型的“S”型擴(kuò)增曲線，呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，而其他動(dòng)物源性成分均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，判定為陰性結(jié)果。表明TaqMan-LAMP 檢測(cè)方法具有良好的特異性。

圖1 TaqMan-LAMP 檢測(cè)方法特異性檢測(cè)結(jié)果Fig. 1 Specificity result of TaqMan-LAMP method

2.3 靈敏度檢測(cè)結(jié)果

將鴨肉分別與生羊肉混合，使其質(zhì)量濃度（w/w）依次為10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%，充分混勻后，進(jìn)行核酸提取，分別采用LAMP、TaqMan-LAMP 和熒光定量PCR 法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 靈敏度檢測(cè)結(jié)果Table 4 Test results of sensibility

結(jié)果顯示，與LAMP 檢測(cè)方法相比，TaqMan-LAMP 法靈敏度一致，均為0.001%（w/w），且陰性對(duì)照無(wú)“假陽(yáng)性”結(jié)果；與熒光定量PCR 法相比，TaqMan-LAMP 法擴(kuò)增結(jié)果的線性相關(guān)系數(shù)（R2）相當(dāng)，均大于0.999，且可在更短時(shí)間（25.92 min）內(nèi)完成靈敏度為0.001%（w/w）的準(zhǔn)確檢測(cè)。

2.4 重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

采用TaqMan-LAMP 檢測(cè)體系對(duì)低質(zhì)量濃度0.001%鴨源核酸樣品進(jìn)行8 次重復(fù)測(cè)試，以ddH2O為陰性對(duì)照，檢測(cè)結(jié)果如圖2 所示。

圖2 重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果Fig. 2 Repeatability of test results

對(duì)Ct值的變異系數(shù)CV值進(jìn)行計(jì)算，CV值為1.99%。TaqMan-LAMP 檢測(cè)方法靈敏度合格，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定。

2.5 實(shí)際樣品結(jié)果

以GB/T38164-2019 實(shí)時(shí)熒光PCR 法鴨源檢測(cè)方法為對(duì)照，使用TaqMan-LAMP 和LAMP（LB/LF）檢測(cè)體系同時(shí)對(duì)收集的47 份肉制品進(jìn)行平行測(cè)試，見(jiàn)表5。結(jié)果顯示，LAMP（LB/LF）檢測(cè)體系的相對(duì)敏感性為100%，但出現(xiàn)了2 份“假陽(yáng)性”結(jié)果，故影響了相對(duì)特異性和相對(duì)符合率（分別為88.89%和95.74%）；而本研究所建立的TaqMan-LAMP 檢測(cè)方法相對(duì)敏感性、相對(duì)特異性和相對(duì)符合率均為100%。

表5 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果Table 5 Accuracy of test results

3 結(jié)論

本研究建立了快速有效的TaqMan-LAMP 檢測(cè)方法，用于檢測(cè)肉制品中的鴨源性成分。結(jié)果表明，該檢測(cè)方法的特異性良好，可在30 min 內(nèi)完成準(zhǔn)確檢測(cè)，靈敏度為0.001%（w/w），重復(fù)性好。通過(guò)對(duì)47 份實(shí)際樣品檢測(cè)，與國(guó)標(biāo)法相比，該方法相對(duì)敏感性、特異性和符合率均為100%?？傊狙芯拷⒌镍喸葱猿煞諸aqMan-LAMP 檢測(cè)方法快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高，適用于肉制品中鴨源性成分的快速檢測(cè)，為肉制品中摻假成分的檢測(cè)提供了一種新方法。