杜 鑫，付春杰，蘇 操，孟令偉，石 瑩，張 丹，曲艷嬌，宋海巖，朱長動，楊 柳

吉林冠界生物技術(shù)有限公司，吉林梅河口 135000

禽流感是引起水禽、野禽、家禽的一種急性高度接觸性傳染病，我國將其列為一類疫病[1,2]。防控禽流感的重要途徑是疫苗免疫，滅活疫苗不僅要求能夠產(chǎn)生高水平的抗體，還應(yīng)具備安全性良好，無不良反應(yīng)，因此生產(chǎn)安全高效的滅活疫苗意義重大。滅活是疫苗生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，滅活效果與滅活劑的選擇密切相關(guān)，理想的滅活劑不但免疫原性良好，且無任何毒副作用[3]。

本試驗(yàn)用β-丙內(nèi)酯、甲醛、二乙烯亞胺、N-乙酰乙烯亞胺、鹽酸聚六亞甲基胍滅活劑對重組禽流感病毒細(xì)胞毒的滅活效果進(jìn)行了研究，確定了不同滅活劑的滅活的最佳條件并配苗，比較其免疫效果和安全性，篩選出了安全、高效的重組禽流感病毒細(xì)胞源滅活疫苗用滅活劑。

1 材料

1.1 病毒液

重組禽流感病毒H5 亞型Re-13 株、Re-14 株和重組禽流感病毒H7 亞型H7-Re4 株細(xì)胞毒(濃縮后HA 效價均為9log2)由吉林冠界生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.2 抗原、血清

禽流感病毒H5 亞型H5-Re13 株、H5-Re14 株和H7 亞型H7-Re4 株血凝抑制試驗(yàn)抗原和陽性血清，購自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司。

1.3 SPF 雞胚和SPF 雞

購自北京勃林格生物。

2 方法

2.1 病毒的滅活

2.1.1 甲醛滅活最佳條件：在病毒液中緩慢滴加40%的甲醛溶液，使終濃度分別為 0.2%、0.15%、0.1%、0.05%、0.025%，37 ℃ 130 r/min 滅活，作用至32 h，每隔8 h 取樣。

2.1.2 β-丙內(nèi)酯滅活最佳條件：在病毒液中緩慢滴加稀釋后β-丙內(nèi)酯溶液，使終濃度分別為0.2%、0.15%、0.1%、0.05%、0.025%，4 ℃ 130 r/min 滅活，32 h 內(nèi)每隔8 h 取樣，37 ℃作用2 h 終止。

2.1.3 N-乙酰乙烯亞胺滅活最佳條件：在病毒液中緩慢滴加稀釋后的N-乙酰乙烯亞胺溶液，使終濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，37 ℃130 r/min 滅活，32 h 內(nèi)每隔8 h 取樣，加入等量10%硫代硫酸鈉終止。

2.1.4 二乙烯亞胺滅活最佳條件：在病毒液中緩慢滴加稀釋后二乙烯亞胺溶液，使終濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，37 ℃ 130 r/min 滅活，32 h 內(nèi)每隔8 h 取樣，加等量10%硫代硫酸鈉終止。

2.1.5 鹽酸聚六亞甲基胍滅活最佳條件：在病毒液中緩慢滴加鹽酸聚六亞甲基胍溶液，使終濃度分別為1%、2%、3%、4%和5%，37 ℃ 130 r/min 滅活，32 h 內(nèi)每隔8 h 取樣。

2.2 無菌檢驗(yàn)

取滅活病毒液，進(jìn)行無菌檢驗(yàn)。

2.3 HA 效價

取滅活病毒液，進(jìn)行HA 效價測定。

2.4 滅活檢驗(yàn)

將滅活病毒液通過尿囊腔接種10 枚10 日齡SPF 雞胚，每枚0.1 mL。36 ℃孵育72 h，2 ～8 ℃冷卻，并盲傳1 代，測定HA 效價，若均為陰性，則滅活完全，反之亦然。

2.5 效力檢驗(yàn)

取30 只3 周齡SPF 雞，每只胸部肌肉或頸部皮下接種疫苗0.3 mL，同時設(shè)對照雞15 只。接種21 日后采血，分離血清，用禽流感病毒H5 亞型H5-Re13 株、H5-Re14 株和H7 亞型H7-Re4 株血凝抑制試驗(yàn)抗原測定HI 抗體效價。

2.6 安全性檢驗(yàn)

取10 只3 周齡的SPF 雞，各胸部肌肉或頸部皮下接種疫苗2.0 mL，每日觀察，連續(xù)14 d，觀察是否有疫苗引起的不良反應(yīng)。

3 結(jié)果

3.1 病毒的滅活

3.1.1 甲醛最佳滅活條件的確定：依據(jù)最佳滅活條件的判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定甲醛滅活的最佳條件為37 ℃0.025%濃度滅活24 h。

3.1.2 β-丙內(nèi)酯最佳滅活條件的確定：依據(jù)最佳滅活條件的判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定β-丙內(nèi)酯滅活的最佳條件為4 ℃ 0.05%濃度滅活24 h。

3.1.3 N-乙酰乙烯亞胺最佳滅活條件的確定：依據(jù)最佳滅活條件的判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定N-乙酰乙烯亞胺滅活的最佳條件為37 ℃ 0.5%濃度滅活24 h。

3.1.4 二乙烯亞胺最佳滅活條件的確定：依據(jù)最佳滅活條件的判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定二乙烯亞胺滅活的最佳條件為37℃ 0.5%濃度滅活24 h。

3.1.5 鹽酸聚六亞甲基胍最佳滅活條件的確定：依據(jù)最佳滅活條件的判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定鹽酸聚六亞甲基胍滅活的最佳條件為37 ℃ 1%濃度滅活24 h。

3.2 效力檢驗(yàn)

甲醛滅活疫苗組、β-丙內(nèi)酯滅活疫苗組和二乙烯亞胺組滅活疫苗組免疫21 d 后H5-Re13株、H5-Re14 株和H7-Re4 株抗體效價（GMT）均在8log2 以上。N-乙酰乙烯亞胺滅活疫苗組和鹽酸聚六亞甲基胍滅活疫苗組免疫21 d 后H5-Re13株、H5-Re14 株和H7-Re4 株抗體效價（GMT）均在7log2 以上。結(jié)果表明，抗體效價甲醛滅活疫苗組、β-丙內(nèi)酯滅活疫苗組、二乙烯亞胺滅活疫苗組抗體效價高于N-乙酰乙烯亞胺滅活疫苗組、鹽酸聚六亞甲基胍滅活疫苗組。

3.3 安全性檢驗(yàn)

結(jié)果表明，β-丙內(nèi)酯、甲醛、二乙烯亞胺、N-乙酰乙烯亞胺、鹽酸聚六亞甲基滅活疫苗免疫雞后，連續(xù)觀察14 d，免疫部位均無炎癥反應(yīng)，疫苗均吸收良好，采食、飲水和精神狀態(tài)均正常，無不良臨床癥狀。

4 討論

多年來,通常都是用甲醛作為動物用滅活疫苗滅活劑。但其存在強(qiáng)刺激性、強(qiáng)致癌、殘留過多易產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)等缺陷[3]。國內(nèi)外學(xué)者一直在探尋更理想的滅活劑用于AIV 滅活疫苗的生產(chǎn)。施維松等［4］使用二乙烯亞胺對禽流感病毒Re-5 株進(jìn)行滅活，并篩選出了滅活的最佳條件，制苗免疫后二乙烯亞胺滅活疫苗抗體效價高于甲醛滅活疫苗。黃文科等［5］使用β-丙內(nèi)酯對禽流感病毒H9N2 進(jìn)行了滅活，配苗后免疫抗體效價與甲醛相當(dāng)。

疫苗生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)病毒的種類，選擇不同的滅活劑用于滅活，在選用滅活劑時以較低濃度、溫度和較短作用時間處理為好，以保證疫苗安全與效價。以此為依據(jù)，本研究設(shè)計了不同濃度的β-丙內(nèi)酯、甲醛、二乙烯亞胺、N-乙酰乙烯亞胺、鹽酸聚六亞甲基胍作為滅活劑，在不同作用時間下對AIV 進(jìn)行的滅活，通過血凝（HA）試驗(yàn)、滅活和無菌檢驗(yàn)確定了β-丙內(nèi)酯、甲醛、二乙烯亞胺、N-乙酰乙烯亞胺、鹽酸聚六亞甲基最佳的滅活條件。將滅活后的病毒液配苗，進(jìn)行安全性檢驗(yàn)，結(jié)果表明接種SPF 雞后均無不良反應(yīng)。效力檢驗(yàn)結(jié)果表明，甲醛、β-丙內(nèi)酯、二乙烯亞胺抗體效價均在8log2以上，N-乙酰乙烯亞胺和鹽酸聚六亞甲基體效價均在7log2 以上，均遠(yuǎn)高于國家標(biāo)準(zhǔn)（6log2）。從5 種滅活劑對AIV 滅活,通過HA 試驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)、滅活檢驗(yàn)結(jié)果以及對SPF 雞的抗體效價綜合分析，再從毒性及試劑穩(wěn)定性來考慮，最好的滅活劑為β-丙內(nèi)酯，其次為二乙烯亞胺和甲醛，最后為N-乙酰乙烯亞胺和鹽酸聚六亞甲基,本研究為禽流感病毒的滅活提供參考依據(jù)，為規(guī)模化生產(chǎn)重組禽流感病毒細(xì)胞源滅活疫苗所需的理想滅活劑應(yīng)用提供了依據(jù)?？紤]到β-丙內(nèi)酯成本較高，不同的疫苗企業(yè)可根據(jù)自己的實(shí)際情況進(jìn)行選擇。