危建文,曹寅生,金久楚,劉 雄,鄒 冕

(1. 湖南中醫(yī)藥大學,湖南 長沙 410208;2. 湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,湖南 長沙 410007)

肩袖損傷是以肩痛、乏力伴肩關節(jié)活動障礙為主要表現(xiàn)的肩部疾病,多由勞損、外力等因素造成,常見于中老年人,嚴重影響患者生活質量[1-2]。肩袖損傷多采用保守治療,保守治療失敗后需進行手術,以達到改善肩部功能并緩解疼痛的目的。關節(jié)鏡下肩袖修補術是目前治療肩袖損傷最主流的手術方式[3],但是術后腱骨結合部是否完整愈合嚴重影響治療效果。相關研究顯示,肩袖修補術后再撕裂率可達到20%～30%[4],其原因與腱骨界面結構以及炎癥反應有著直接關系[5]。前期研究表明,續(xù)筋接骨液能增加肩袖修補術后腱骨組織抗拉強度[6],但其作用機制仍不明確。PI3K/Akt信號通路參與調控細胞增殖、分化等生命活動[7],基于此,本課題組研究了續(xù)筋接骨液對兔肩袖損傷修復術后腱骨組織中PI3K/Akt信號通路的影響,以探討其促進腱骨愈合的作用機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性新西蘭大白兔15只,清潔級,體重2.0～2.5 kg,購于湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心并飼養(yǎng)于該中心,動物許可證號:SCXK(湘)2020-0005,單位許可證號:SYXK(湘)2022-0003。所有兔常規(guī)飼養(yǎng),實驗室室溫21～26 ℃,相對濕度50%～55%,環(huán)境干凈整潔、安靜,單籠飼養(yǎng),自由攝水,保持12 h晝夜輪替。本實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學倫理委員會批準(ZYFY20220513-01)。

1.2主要藥物及試劑 續(xù)筋接骨液(湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院院內制劑,批號:20220925,規(guī)格:250 mL/瓶);兔p-PI3K抗體(北京博奧森,批號:bs-5570r);兔p-Akt抗體(美國CST,批號:#4060);兔GAPDH抗體(美國proteintech,批號:10494-1-AP);miRNA反轉錄試劑盒(北京康為世紀,批號:CW2141)。

1.3主要儀器 搖床、旋渦混合器(中國江蘇其林貝爾,型號分別為TS-1和GL-88B);臺式冷凍離心機(中國湖南湘儀,型號:H1650R);熒光定量RCP儀、熒光PCR板(美國Thermo公司,型號分別為PIKOREAL96和SPL0960);電泳儀、水平瓊脂糖電泳槽(中國北京六一有限公司,型號分別為DYY-2C和DYCP-31DN);-80 ℃冰箱(中國美菱有限公司,型號:DW-HW438)?；瘜W發(fā)光成像系統(tǒng)(中國勤翔,型號:ChemiScope6100);生物樣品均質儀(中國杭州奧盛,型號:BioPrep-24)。

1.4實驗方法 隨機取5只兔作為空白組,其余兔參考寇景浩等[8]方法建立肩袖損傷修復模型:戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉兔后,固定于無菌手術臺,左肩做縱向2 cm切口,逐層分離,暴露岡上肌,縫線標記,在大結節(jié)止點處銳性切斷岡上肌肌腱,用克氏針在肱骨大結節(jié)制作孔道,絲線通過孔道將切斷的岡上肌肌腱縫合固定大結節(jié)止點處,逐層關閉切口。術后肌注青霉素20萬IU,持續(xù)3 d。將造模兔隨機分為模型組、續(xù)筋接骨組各5只。續(xù)筋接骨組給予續(xù)筋接骨液56 mg/kg灌胃(參照劑量-體表面積換算方法[9]計算給藥量,藥物和蒸餾水配置成混懸液,灌胃量為10 mL/kg),空白組、模型組給予等量生理鹽水灌胃,均2次/d,連續(xù)灌胃8周。

1.5檢測指標及方法

1.5.1腱骨組織HE染色病理形態(tài) 末次灌胃結束后,采用空氣栓塞法處死兔,在無菌環(huán)境下暴露兔造模側肩關節(jié),取部分下岡上肌及連接的上段肱骨(腱骨組織),予烤片、切片、脫蠟、脫水、蘇木素染色、伊紅染色、梯度酒精脫水、透明封片等處理,采用普通光學顯微鏡觀察腱骨組織形態(tài)。

1.5.2腱骨組織中p-PI3K、p-Akt蛋白表達情況采用Western blot法檢測:取-80 ℃凍存的腱骨組織,剪碎,經(jīng)RIPA裂解液裂解后,4 ℃下12 000 r/min離心15 min,收集上清液。SDS-PAGE分離蛋白,轉膜,PBST清洗。脫脂奶粉液封閉,室溫靜置90 min,4 ℃過夜,次日室溫靜置30 min。加入p-PI3K、p-Akt一抗(稀釋度均為1∶2 000),4 ℃孵育過夜,再洗膜3次×15 min。加二抗(稀釋度1∶5 000),室溫孵育90 min,洗膜3次×10 min。將膜置入ECL化學發(fā)光液孵育1 min,再用濾紙吸干,凝膠成像系統(tǒng)成像,用Quantity One 4.6.2軟件進行分析,以GAPDH為內參計算蛋白相對表達量。

1.5.3腱骨組織中PI3K、Akt mRNA表達情況 采用RT-qPCR法檢測:取凍存的腱骨組織,經(jīng)Trizol裂解,提取總的RNA。反轉錄為cDNA,行PCR反應。PCR反應體系:cDNA模板2 μL,PrimerR(10 μmol)1 μL,PrimerF(10 μmol)1 μL,ddH2O 11 μL,2X SYBGREEN PCR Master Mix 15 μL。PCR反應條件:95 ℃預變性10 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,循環(huán)40次。反應結束后采用2-ΔΔCT法計算各基因相對表達量。兔引物序列見表1。

表1 兔引物序列

2 結 果

2.1各組兔腱骨組織HE染色病理形態(tài) 空白組兔肌腱-骨連接緊密,肌腱與骨組織之間界限清晰,膠原纖維排列整齊;模型組兔肌腱-骨連接不完全,膠原纖維排列紊亂;續(xù)筋接骨組兔肌腱-骨緊密連接,腱骨界面有大量致密結締組,并且有新生血管。見圖1。

2.2各組兔腱骨組織中p-PI3K、p-Akt蛋白表達情況比較 模型組造模側腱骨組織中p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達量均明顯高于空白組(P均<0.05),續(xù)筋接骨組造模側腱骨組織中p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖2及表2。

圖1 空白組和肩袖損傷修復術后各組兔腱骨界面組織HE染色表現(xiàn)(×400)

圖2 空白組和肩袖損傷修復術后各組兔腱骨組織中p-PI3K、p-Akt蛋白表達電泳圖

2.3各組兔腱骨組織中PI3K、Akt mRNA表達情況比較 模型組造模側腱骨組織中PI3K、Akt mRNA相對表達量均明顯高于空白組(P均<0.05),續(xù)筋接骨組造模側腱骨組織中PI3K、Akt mRNA相對表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表3。

3 討 論

表2 空白組和肩袖損傷修復術后各組兔腱骨組織中p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達量比較

表3 空白組和肩袖損傷修復術后各組兔腱骨組織中PI3K、Akt mRNA相對表達量比較

肩袖通過肌腱附著于肱骨,其特殊的腱骨界面結構能將應力載荷從肌腱轉移至骨骼而完成力的傳導,減少肌腱勞損[10]。肩袖修復術后促進腱骨界面愈合是保證手術效果的重要因素,也是運動醫(yī)學的研究熱點。正常腱骨界面由肌腱、未鈣化的纖維軟骨、鈣化纖維軟骨和骨組成[11],結合腱骨界面特殊結構,促進其中的軟骨、骨及肌腱的形成,可直接加速腱骨愈合[12]。

PI3K/Akt信號通路是調節(jié)細胞生命活動的重要通路,PI3K可以被上游細胞因子如轉化生長因子-β(TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)等激活為p-PI3K[13]。p-PI3K可作為第二信使募集Akt,使其被激活為p-Akt,再將信號傳遞至下游效應蛋白[14]。近年來研究發(fā)現(xiàn),PI3K/Akt信號通路可以參與調控成骨間充質干細胞(BMSCs)成骨分化遷移[15]和BMSCs肌腱誘導分化[16],可以上調血管內皮生長因子(VEGF)水平,增加血管數(shù)量[17]。而充足的血運可為腱骨界面修復提供營養(yǎng),同時也能傳輸炎癥代謝產(chǎn)物。過度的炎癥應激導致組織水腫并瘢痕化,影響腱骨結構中軟骨層的長入,破壞其生物力學機制[18],而PI3K/Akt信號通路可參與調控TNF-α、IL-6表達水平[19]。

中醫(yī)藥目前廣泛應用于骨折筋傷疾病。續(xù)筋接骨液為湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院經(jīng)驗制劑,由丹參、續(xù)斷、骨碎補、杜仲、自然銅等藥組成,全方共奏活血養(yǎng)血、補益肝腎、接骨續(xù)筋之效。藥理學研究表明,丹參酮ⅡA[20]、續(xù)斷皂苷Ⅵ[21]能促進BMSCs增殖并向成骨細胞分化;骨碎補不僅能促進BMSCs成骨分化,還能抑制破骨細胞活性,抑制氧化應激反應[22];杜仲葉提取物可促進局部毛細血管再生,改善微循環(huán)[23]。前期臨床研究證實,續(xù)筋接骨液內服能有效緩解肩袖損傷患者疼痛,改善肩關節(jié)活動[24]。

本實驗結果顯示,模型組腱骨界面連接不完全,膠原纖維排列紊亂,腱骨組織中p-PI3K、p-Akt蛋白及PI3K、Akt mRNA表達量均明顯升高,說明肩袖損傷術后PI3K/Akt通路明顯活化;與模型組比較,續(xù)筋接骨組腱骨界面大量結締組織,連接緊密,膠原纖維排列有序,腱骨組織中p-PI3K、p-Akt蛋白及PI3K、Akt mRNA表達量均明顯降低,說明續(xù)筋接骨液可以抑制PI3K/Akt通路的活化。

綜上,續(xù)筋接骨液可能通過抑制PI3K/Akt信號通路活化而促進兔肩袖損傷修復術后腱骨愈合。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。