李欣怡,王洪伸,林涌鵬,麥烙棋,陳博來

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510006;2. 廣東省中醫(yī)院,廣東 廣州 510006)

腰椎間盤退行性疾病是我國嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題,在腰痛復(fù)雜的多因素中,大約40%的腰痛是由于椎間盤退變引起的[1],而在發(fā)病人群中有11%～12%因腰痛致殘[2]。因此,對椎間盤退變進(jìn)行早期預(yù)防和治療具有非常重要的臨床價值和公共衛(wèi)生學(xué)意義。臨床對于腰椎間盤退變的治療主要為抗炎鎮(zhèn)痛等保守治療和手術(shù)治療,治療效果有限,且手術(shù)治療有發(fā)生并發(fā)癥的風(fēng)險[3]。另外,目前尚無藥物干預(yù)、生物療法或技術(shù)被批準(zhǔn)用于預(yù)防椎間盤退變[4]。 鄧晉豐教授根據(jù)內(nèi)經(jīng)“腎主骨生髓”的論述,體悟腎中精氣陰陽的盛衰與骨骼的生長代謝密切相關(guān)[5],進(jìn)一步認(rèn)識到“補(bǔ)腎陽”的重要性,開發(fā)出代表性方劑“溫腎壯陽方”,經(jīng)過現(xiàn)代制劑技術(shù)開發(fā)出院內(nèi)制劑“溫通膠囊”,臨床用于治療腰椎間盤突出癥獲得良好療效[6]。但該方緩解腰痛及對退變椎間盤的生物學(xué)機(jī)制尚不明確,本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察溫腎壯陽方含藥血清對髓核細(xì)胞凋亡、增殖及缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)/血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)通路的影響,探討溫腎壯陽方延緩腰椎間盤退變的可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系 由廣東省中醫(yī)院骨一科提供人髓核組織(經(jīng)椎間孔鏡手術(shù)取得,患者均知情同意),進(jìn)行原代細(xì)胞提取與培養(yǎng),采用第三代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性SD大鼠25只,3月齡,體重約350 g,購自廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心,動物合格證編號:44829700001434。大鼠飼養(yǎng)于廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級環(huán)境[許可證號:SYXK(粵)2018-0094],每籠5只,自由飲食飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)通過該中心倫理審查通過(2022009)。

1.3主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備、試劑與耗材 多功能酶標(biāo)儀M1000pro(TECAN);熒光定量PCR儀ABI Quant Studio 7 Flex(ABI);nanodrop2000c超微量分光光度計(Thermo Fisher);SDS-PAGE垂直電泳槽(Bio-Rad);高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像儀(Bio-Rad);NovoCyte Advanteon 流式細(xì)胞儀(安捷倫)。 SteadyPure通用型RNA提取試劑盒(艾科瑞);Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(艾科瑞);BeyoFastTMSYBR Green One-Step qRT-PCR Kit(碧云天);氯化鈷(CoCl2)粉末(九鼎化學(xué));Ⅱ型膠原酶(Sigma);CCK8溶液(博士德);HIF-1α Monoclonal antibody(Proteintech);VEGFA Monoclonal antibody(Proteintech);Actin Monoclonal antibody(Proteintech);半胱天冬酶-1(Caspase-1) Monoclonal antibody(Proteintech);p53 Monoclonal antibody(Proteintech);HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) (Proteintech);HRP Conjugated AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L)(博士德);10%水合氯醛溶液(BBI);Human MSC Analysis Kit(BD)。

1.4實(shí)驗(yàn)藥物 溫腎壯陽方(熟附子15 g、骨碎補(bǔ)15 g、巴戟天15 g、仙茅15 g、杜仲20 g、黃芪30 g、全蝎5 g、白術(shù)15 g、桂枝10 g,康美藥業(yè)),按照人與大鼠劑量換算制備低、中、高濃度分別為4.821 4 g/(kg·d)、9.792 8 g /(kg·d)、19.285 7 g /(kg·d)的藥液;依托考昔(齊魯制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字H20193275,規(guī)格:60 mg),按照人與大鼠劑量換算制備濃度為0.001 5 g/(kg·d)的藥液。

1.5含藥血清制備 將25只SD大鼠隨機(jī)分為5組,分別用生理鹽水、依托考昔溶液及低、中、高濃度溫腎壯陽方進(jìn)行灌胃,每次灌胃量1.5 mL,2次/d,連續(xù)灌胃7 d。于末次灌胃后2 h,采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,使用手術(shù)刀或剪刀打開大鼠腹腔,鈍性分離暴露腹主動脈,一次性采血針平行刺入腹主動脈,另一端迅速連接真空促凝采血管,待血液充滿后換管,3 000 r/min離心15 min,移液器吸取上清液,56 ℃恒溫水浴滅活30 min,0.2 μm微孔濾膜除菌,分裝,-80 ℃儲存?zhèn)溆?血清濃度均為10%。

1.6細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.6.1細(xì)胞生存率檢測 取生長良好的髓核細(xì)胞,1 104個/孔鋪于96孔板中,培育24 h至全部貼壁。實(shí)驗(yàn)分為6組,空白對照組用正常大鼠血清培養(yǎng),缺氧造模組用300 μmol/L CoCl2溶液干預(yù)24 h誘導(dǎo)缺氧狀態(tài),依托考昔組用300 μmol/L CoCl2+依托考昔含藥血清同時干預(yù)24 h,低、中、高濃度溫腎壯陽方組分別用300 μmol/L CoCl2+相應(yīng)濃度腎壯陽方含藥血清同時干預(yù)24 h。按照CCK-8試劑盒說明處理細(xì)胞2 h后,使用多功能酶標(biāo)儀檢測每個孔在450 nm波長處的吸光度值。

1.6.2細(xì)胞中HIF-1α、VEGF、Caspase-1、p53蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測:取生長良好的髓核細(xì)胞,按1 105個/孔鋪于96孔板中,培育24 h至全部貼壁。待細(xì)胞生長至80%后分組培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)分組及培養(yǎng)同1.6.1。作用24 h后添加RIPA裂解液,細(xì)胞刮匙收集蛋白,在4 ℃下12 000 r/min離心15 min,抽取上層蛋白清液轉(zhuǎn)移至EP管。BCA法測定蛋白濃度,蛋白均一定量后變性,SDS-PAGE電泳,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,快速封閉液封閉30 min,加入一抗4 ℃過夜。TBST清洗10 min×3次,加入二抗室溫孵育1 h,TBST緩沖液洗膜10 min 3次。ECL化學(xué)發(fā)光顯影。ECL化學(xué)發(fā)光顯影,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,使用Image Lab軟件測量條帶灰度值。

1.6.3細(xì)胞中HIF-1α、VEGF、Caspase-1、p53 mRNA表達(dá)情況 采用qPCR法檢測:取生長良好的髓核細(xì)胞,按1 105個/孔鋪于6孔板,培育24 h至全部貼壁。待細(xì)胞生長至80%后分組培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)分組及培養(yǎng)同1.6.1。作用24 h后,采用SteadyPure通用型RNA提取試劑盒提取細(xì)胞RNA,并用Nanodrop分光光度計測總RNA濃度和純度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照PCR試劑盒說明書,選擇β-actin為內(nèi)參,HIF-1α、VEGF、Caspase-1、p53引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性20 s,95 ℃ 1 s,60 ℃ 20 s,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,共40個循環(huán)。2-△△CT法計算mRNA相對表達(dá)量。每個實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次。

1.6.4髓核間充質(zhì)干細(xì)胞(NPSCs)增殖情況 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測:取生長良好的髓核細(xì)胞,按1 106個/皿進(jìn)行鋪板,培育24 h至全部貼壁。待細(xì)胞生長至80%后分組培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)分組及培養(yǎng)同1.6.1。作用24 h后,用PBS清洗,不含EDTA胰酶消化,離

表1 引物序列

心,棄上清,PBS重懸,用細(xì)胞計數(shù)板定濃度為5 106個/mL。根據(jù)Human MSC Analysis Kit試劑盒說明書,以CD90、CD73、CD105為陽性表面抗體,CD34、CD45、CD11b、CD19、HLA-DR為陰性表面抗體,用5 mL流式管每管加入100 μL細(xì)胞懸液,避光加入熒光染料。冰上或室溫孵育30 min,期間每隔10 min震蕩1次反應(yīng)管,使細(xì)胞和抗體充分反應(yīng)。孵育完畢后用PBS清洗2次,每次1 500 r/min離心3 min,再用PBS重懸至500 μL/管,上機(jī)分析NPSCs增殖情況。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用 GraphPad Prism 8.3.0 軟件(GraphPad Software公司,美國)進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Tukey’s Method分析進(jìn)行多組間差異分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞存活率比較 缺氧誘導(dǎo)各組細(xì)胞存活率均明顯低于空白對照組(P均<0.05),且依托考昔組細(xì)胞存活率明顯低于缺氧造模組(P<0.05);中濃度溫腎壯陽方組、高濃度溫腎壯陽方組的細(xì)胞存活率均明顯高于缺氧造模組(P均<0.05)。見圖1。

圖1 空白對照組和缺氧誘導(dǎo)各組髓核細(xì)胞存活率

2.2各組細(xì)胞中缺氧及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況缺氧造模組細(xì)胞中HIF-1α、VEGF、Caspase-1、p53蛋白相對表達(dá)量均明顯高于空白對照組(P均<0.05)。依托考昔組HIF-1α蛋白相對表達(dá)量明顯高于缺氧造模組(P<0.05),VEGF、Caspase-1、p53蛋白相對表達(dá)量與缺氧造模組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05);溫腎壯陽方各組HIF-1α蛋白相對表達(dá)量與缺氧造模組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05),VEGF蛋白相對表達(dá)量均明顯高于缺氧造模組(P均<0.05);中濃度溫腎壯陽方組、高濃度溫腎壯陽方組Caspase-1、p53蛋白相對表達(dá)量及低濃度溫腎壯陽方組p53蛋白相對表達(dá)量均明顯低于缺氧造模組(P均<0.05)。見圖2。

2.3各組細(xì)胞中缺氧及凋亡相關(guān)因子mRNA表達(dá)情況 缺氧造模組細(xì)胞中HIF-1α、VEGF、Caspase-1、p53 mRNA相對表達(dá)量均明顯高于空白對照組(P均<0.05)。依托考昔組HIF-1α mRNA相對表達(dá)量明顯高于缺氧造模組(P<0.05),VEGF、Caspase-1、p53蛋白相對表達(dá)量與缺氧造模組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05);溫腎壯陽方各組HIF-1α mRNA相對表達(dá)量與缺氧造模組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05),VEGF mRNA相對表達(dá)量均明顯高于缺氧造模組(P均<0.05);中濃度溫腎壯陽方組、高濃度溫腎壯陽方組Caspase-1、p53 mRNA相對表達(dá)量均明顯低于缺氧造模組(P均<0.05)。見圖3。

2.4各組NPSCs增殖情況 空白對照組NPSCs占總活細(xì)胞比例為80.59%,缺氧造模組為45.10%,依托考昔組為43.31%,低、中、高濃度溫腎壯陽方組分別為47.96%,54.49%,40.65%。各造模組NPSCs占比均明顯低于空白對照組(P均<0.05),中濃度溫腎壯陽方組NPSCs占比明顯高于缺氧造模組、依托考昔組、高濃度溫腎壯陽方組(P均<0.05)。見圖4。

3 討 論

椎間盤長期處于缺氧環(huán)境中,缺氧是椎間盤退變的重要因素之一[7]。本研究采用溫腎壯陽方含藥血清干預(yù)缺氧誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞,意在探討溫腎壯陽方對于椎間盤退變的干預(yù)機(jī)制。

CCK-8及流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示,經(jīng)過缺氧誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞存活率明顯降低,較好地模擬了髓核細(xì)胞的缺氧環(huán)境。依托考昔組細(xì)胞生存率以及NPSCs比例相比缺氧造模組反而下降,提示依托考昔針對缺氧誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞并無細(xì)胞保護(hù)作用,甚至有促進(jìn)凋亡的作用。而既往在骨關(guān)節(jié)炎的研究中,依托考昔顯示出明顯的抗炎鎮(zhèn)痛效果,并且通過其抗炎效應(yīng)來維持細(xì)胞生存[8]。本項(xiàng)關(guān)于髓核細(xì)胞的研究中,依托考昔表現(xiàn)出相反的效應(yīng),與COX-2特異性抑制劑的抗癌作用[9]有相似之處,即COX-2特異性抑制劑能夠誘導(dǎo)腫瘤凋亡相關(guān)因子的表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[10]?？紤]到椎間盤是人體最大的免疫特權(quán)組織[11],并且長期處于與腫瘤細(xì)胞相似的低氧環(huán)境中[12],髓核細(xì)胞的生理功能與普通的軟骨細(xì)胞相比可能有所差異,且髓核細(xì)胞缺氧機(jī)制與軟骨細(xì)胞炎性損傷機(jī)制并不相同,導(dǎo)致了依托考昔在本項(xiàng)研究中產(chǎn)生了不同的效應(yīng),但具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。另外,中、高濃度溫腎壯陽方組的細(xì)胞存活率和中濃度溫腎壯陽方組NPSCs比例明顯高于缺氧造模組,提示中高濃度溫腎壯陽方能夠有效提高髓核細(xì)胞存活率,但高濃度溫腎壯陽方對于NPSCs的增殖并無明顯作用,可能原因是中濃度溫腎壯陽方通過促進(jìn)NPSCs增殖而減少細(xì)胞的凋亡,而高濃度溫腎壯陽方促使干細(xì)胞向其他種類細(xì)胞分化。由于VEGF是血管生成的特異性代表因子[13],結(jié)合溫腎壯陽方對于VEGF的激活功能,以及高濃度溫腎壯陽方干預(yù)后CD73+CD90、CD105陽性細(xì)胞的占比降低,提示高濃度溫腎壯陽方可能改變了NPSCs的表型,使之向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化,這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。

圖2 空白對照組和缺氧誘導(dǎo)各組髓核細(xì)胞中缺氧與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

圖3 空白對照組和缺氧誘導(dǎo)各組髓核細(xì)胞中缺氧與凋亡相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)情況

圖4 空白對照組和缺氧誘導(dǎo)各組髓核間充質(zhì)干細(xì)胞占總活細(xì)胞比例

HIF-1α是細(xì)胞適應(yīng)缺氧的主要調(diào)節(jié)因子,其有明顯的抗炎作用[14]。本研究結(jié)果顯示,依托考昔可促進(jìn)HIF-1α過表達(dá),符合依托考昔所公認(rèn)的抗炎效應(yīng)[15];而溫腎壯陽方對于HIF-1α并無明顯調(diào)控效應(yīng),說明溫腎壯陽方有效成分可能并無抗炎作用。VEGF是炎性分子的招募因子之一[16],溫腎壯陽方明顯上調(diào)了VEGF的表達(dá),所以間接引發(fā)了炎癥反應(yīng)。綜上所述,溫腎壯陽方也許并無抑制炎癥的功能,其可能在一定程度上能夠維持機(jī)體的低水平炎癥反應(yīng),并且由于VEGF是血管生成的特異性代表因子,能夠促進(jìn)血管的形成,可能提示溫腎壯陽對于髓核細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化有著特異性的激活作用,長期來看有利于血管的分化與生成,改善組織內(nèi)部灌注功能,使組織重吸收,促進(jìn)組織修復(fù)。這與臨床上觀察到溫腎壯陽方的治療效果相一致,例如溫腎壯陽方可以有效改善腎陽虛證患者的肢體發(fā)冷情況,其機(jī)制有可能是因?yàn)閂EGF的激活,招募炎癥因子,并促進(jìn)了血管生成,改善了機(jī)體的血液灌注。關(guān)于溫腎壯陽方的血管生成效應(yīng),還需要進(jìn)一步的動物模型研究與臨床研究進(jìn)行確認(rèn)。

雖然溫腎壯陽方能夠上調(diào)VEGF表達(dá)并促進(jìn)血管生成,但是關(guān)于VEGF激活后血管生成對于椎間盤退變的影響仍舊未有定論。因?yàn)樵谂R床治療中,椎間盤血管化對于椎間盤退變的影響一直存在爭論。首先,在胚胎時期椎間盤血管便開始退變,成人椎間盤生理情況下并無血管存在[17]。在椎間盤退變的過程中,長期的低氧環(huán)境誘導(dǎo)了HIF-1α的持續(xù)表達(dá)[18],VEGF作為HIF-1α的下游因子也在退變的椎間盤中持續(xù)生成[19]。Freemont等[20]研究發(fā)現(xiàn),退變椎間盤中神經(jīng)與血管會在椎間盤內(nèi)伴行生長,這種病理改變是導(dǎo)致盤源性腰痛的病理基礎(chǔ)。徐坤林等[21]研究發(fā)現(xiàn),突出的椎間盤組織在接觸血運(yùn)后誘發(fā)了連續(xù)的免疫炎性反應(yīng),此時促進(jìn)了血管的分化與形成,這對突出椎間盤重吸收起到了關(guān)鍵性作用。所以, VEGF的激活以及血管的生成對于椎間盤退變的影響依舊存在爭論:首先,VEGF的激活以及血管的生成常常會伴隨神經(jīng)生長,這是臨床產(chǎn)生椎間盤退變并導(dǎo)致盤源性腰痛的病理基礎(chǔ),所以VEGF有可能是導(dǎo)致盤源性腰痛的關(guān)鍵因子之一。其次,VEGF的激活以及血管的生成改善了局部血流灌注,引發(fā)了局部的免疫反應(yīng),促進(jìn)了椎間盤的重吸收和組織修復(fù),提示VEGF發(fā)揮了促進(jìn)椎間盤修復(fù)的作用。所以在臨床使用溫腎壯陽方時,應(yīng)當(dāng)考慮到VEGF激活后對于椎間盤的雙重影響,針對神經(jīng)伴行可能產(chǎn)生盤源性腰痛的情況,還需要進(jìn)一步研究與神經(jīng)生長因子抑制劑聯(lián)合使用效果,以指導(dǎo)臨床用藥。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。