管峰，胡馨予，姚逸安，石國(guó)慶，劉守仁，萬(wàn)鵬程*

(1. 中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018；2. 新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆 石河子 832000)

隨著人類對(duì)生物醫(yī)學(xué)材料日益增長(zhǎng)的需求和對(duì)獲取材料的安全性、可持續(xù)開發(fā)利用以及環(huán)境保護(hù)等多方面要求的提升，促使人們尋求“綠色”的方法來(lái)開發(fā)基于現(xiàn)有材料的可利用“天然副產(chǎn)品”。自然界為人類提供了多種獨(dú)特材料，蛋白質(zhì)就是生物材料中重要的候選和來(lái)源材料之一，其中角蛋白憑借其獨(dú)特的生物相容性和降解性在近年來(lái)得到廣泛開發(fā)應(yīng)用。角蛋白是一種屬于纖維結(jié)構(gòu)蛋白家族的硬蛋白，富含硫元素，分子量高達(dá)60 kDa，同時(shí)含有大量的二硫鍵和氫鍵，分子間還廣泛存在相互疏水作用力，良好且獨(dú)特的生物學(xué)特性使其在材料開發(fā)和應(yīng)用中備受關(guān)注，其在飼料新來(lái)源開發(fā)[1]、農(nóng)業(yè)肥料等新型緩釋材料開發(fā)[2-3]、特異性水中有害物吸附劑[4]、水凝膠和多孔吸附性新材料[5-6]、新型醫(yī)藥材料與大健康[7-8]以及食品新材料[9]和新能源材料開發(fā)[10]等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。角蛋白是動(dòng)物體內(nèi)最重要的生物大分子，來(lái)源廣泛，目前羊毛紡織業(yè)、屠宰場(chǎng)、家禽養(yǎng)殖場(chǎng)和人類頭發(fā)產(chǎn)生的角蛋白廢料估計(jì)每年可達(dá)4 000萬(wàn)t[11]，這些材料主要來(lái)自畜牧業(yè)“廢棄材料”或加工后的低值副產(chǎn)品。在世界各地，大量的角質(zhì)廢物被傾倒、填埋或焚燒，造成環(huán)境污染，因此迫切需要探究高效環(huán)保的方法來(lái)處理加工這些“廢物”。

角蛋白具有多方面的生物學(xué)功能，材料來(lái)源豐富且價(jià)格便宜，但提取過(guò)程復(fù)雜，提純難度大，通過(guò)生物降解技術(shù)能夠使含有大量角蛋白的生物廢料更有效地轉(zhuǎn)化為有產(chǎn)業(yè)價(jià)值的角蛋白副產(chǎn)品，具有巨大的科學(xué)應(yīng)用價(jià)值和商業(yè)前景。角蛋白在農(nóng)業(yè)、紡織業(yè)、醫(yī)藥材料和化妝品等多個(gè)領(lǐng)域及行業(yè)都展示出獨(dú)特的潛在廣闊前景。由羊毛和頭發(fā)制備的角蛋白存在可結(jié)合基序，由此制備的角蛋白材料具有止血和細(xì)胞結(jié)合的能力以及自組裝和形成聚合物的內(nèi)在能力[12]。角蛋白生物材料特殊的生物相容性以及促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力，使其可以進(jìn)一步加工成海綿、薄膜和水凝膠等復(fù)合材料用于生物和臨床醫(yī)學(xué)多個(gè)領(lǐng)域，成為傷口愈合、藥物傳遞和組織工程的絕佳新型材料[12]。在過(guò)去的幾十年里，角蛋白作為功能材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛關(guān)注，以頭發(fā)或羊毛提取物為基礎(chǔ)的多孔海綿角蛋白已經(jīng)進(jìn)行了多項(xiàng)體外研究和測(cè)試，表明生物角蛋白極具醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)前景，這些研究結(jié)果為角蛋白生物材料的深入開發(fā)應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本文圍繞角蛋白來(lái)源、成分、結(jié)構(gòu)和分類以及應(yīng)用等方面，詳細(xì)介紹了角蛋白當(dāng)前的提取技術(shù)，重點(diǎn)論述角蛋白在醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域的應(yīng)用，為角蛋白生物材料的開發(fā)應(yīng)用研究提供參考，也為提升畜牧產(chǎn)業(yè)動(dòng)物養(yǎng)殖附加值提供了一個(gè)重要思路。

1 角蛋白構(gòu)成與特點(diǎn)

1.1 結(jié)構(gòu)與構(gòu)成

角蛋白是組成毛發(fā)、指甲、羽毛、角、蹄、爪和羊毛的主要成分，是生物體最堅(jiān)硬的生物材料之一，在動(dòng)物保護(hù)、防御、捕食和盔甲生成及修復(fù)等多方面發(fā)揮著重要作用，但是不同機(jī)體中角蛋白的含量差異較大。角蛋白由多肽長(zhǎng)鏈和交聯(lián)纖維組成，分子內(nèi)和分子間由大量二硫鍵(R-S-S-R)、氫鍵和離子鍵相連，這些化學(xué)鍵增加了角蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度，角蛋白含有的多肽序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)可與細(xì)胞表面受體相互作用，促進(jìn)細(xì)胞黏附、分化和成熟[13-14]。角蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)是由19種氨基酸排列而成的多肽鏈，不同角蛋白組織中氨基酸的含量和排列順序存在巨大差異，也正是這些差異使不同水解方式得到的蛋白分子量不同，雖然羊毛、羽毛、人類頭發(fā)中角蛋白氨基酸存在差異，但是其中存在兩種穩(wěn)定的基本重復(fù)單元，即A：Cys-Cys-X-Pro-X和B：Cys-Cys-X-SerThr-SerThr，并衍生出十肽衍生物和多氨基酸重復(fù)序列[8，11-12]。

多肽鏈作為細(xì)胞骨架構(gòu)成了角蛋白的大分子基本結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)鏈卷曲成螺旋狀，生成緊致的棒狀α-螺旋構(gòu)象，伸展成扭曲扁平時(shí)折疊形成β-折疊構(gòu)象，這就是角蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，α-螺旋和β-折疊通過(guò)非共價(jià)相互作用(主要是氫鍵)穩(wěn)定了50%的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)[11]。根據(jù)構(gòu)象不同角蛋白可分為中間絲蛋白(intermediate filament proteins，IFPs)即α-角蛋白和角蛋白聯(lián)合蛋白(keratin associated proteins，KAPs)即β-角蛋白兩大類[12]。構(gòu)成角蛋白的氨基酸緊緊纏繞成一個(gè)右旋螺旋即α-螺旋，α-螺旋每輪有3.6個(gè)殘基呈縱向排列，由于大量的半胱氨酸以及α-螺旋之間大量的二硫鍵，角蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且具有較好的伸展性能[14]。β-折疊由往返折疊的多肽鏈組成，形成扭曲和褶皺的片層結(jié)構(gòu)，通過(guò)氫鍵把主羰基氧原子和氨基氫原子穩(wěn)定連接，呈平行堆積，片層之間形成Gly-Gly或Ser-Ser連接與共價(jià)鍵共同作用，當(dāng)α-螺旋受熱后致氫鍵斷裂時(shí)肽鏈變?yōu)棣?折疊，此時(shí)毛發(fā)可以被拉伸一倍[14]。α-螺旋經(jīng)扭曲纏繞形成超螺旋，超螺旋進(jìn)一步形成二聚體，這種α-螺旋二聚體是微纖維結(jié)構(gòu)的亞單元，成百上千的二聚體在相互作用下構(gòu)成微纖維，數(shù)十根微纖維相互作用形成原纖維，形成角蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，化學(xué)鍵和多種作用力的組合決定了角蛋白的結(jié)構(gòu)及理化特征[14]。

角蛋白最顯著特點(diǎn)是富含半胱氨酸殘基(占總氨基酸殘基的7%～20%)，且大部分存在于蛋白質(zhì)末端區(qū)域。大量存在的二硫鍵使角蛋白具有良好的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)抗性，豐富的硫含量對(duì)角蛋白的天然結(jié)構(gòu)及化學(xué)合成角蛋白的形態(tài)和功能都具有重要影響和作用[12]。角蛋白中除半胱氨酸外，還含有甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和纈氨酸，以及少量的蛋氨酸、賴氨酸和色氨酸[8，11]。角蛋白在抗機(jī)械剪切能力、生物合成和纖維基質(zhì)形成三方面的功能不受生物體形態(tài)、大小或角蛋白類別的影響，始終保持高度一致。

1.2 角蛋白分類

角蛋白的分類方法很多，當(dāng)前對(duì)所知角蛋白的分類主要依據(jù)其組分特征、含硫量、纖維化程度以及不同等電點(diǎn)(pI)等進(jìn)行區(qū)分，角蛋白的分類是研究其理化特征、來(lái)源、功能以及應(yīng)用方向的重要參考和依據(jù)。

根據(jù)結(jié)構(gòu)和含硫量可將角蛋白分為α-角蛋白和β-角蛋白，α-角蛋白即IFPs，主要存在于纖維皮層；β-角蛋白即KAPs，不含半胱氨酸，主要由絲氨酸、丙氨酸和甘氨酸構(gòu)成，提取難度大，不能形成穩(wěn)定的重建結(jié)構(gòu)[15]。α-角蛋白的分子單位是1個(gè)盤繞的異二聚體，α-角蛋白和β-角蛋白由非共價(jià)相互作用形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[12]。α-角蛋白的分子量為40～60 kDa，β-角蛋白的分子量在10～22 kDa之間，α-角蛋白絲直徑為7～10 nm，β-角蛋白絲直徑為3～4 nm，相對(duì)較細(xì)的β-角蛋白在物理特性上比α-角蛋白更堅(jiān)硬[16]。α-角蛋白廣泛存在于哺乳動(dòng)物中，是羊毛、毛發(fā)、爪、蹄和角的主要成分。β-角蛋白主要存在于鳥類和爬行類的硬組織中，如鳥類的羽毛、喙、爪和蠶絲絲心蛋白，以及爬行類的鱗片和爪，具有保護(hù)角蛋白纖維免受物理和化學(xué)損傷的作用[16]。

角蛋白根據(jù)含硫量和是否纖維化可分為硬角蛋白和軟角蛋白[12]。硬角蛋白的含硫量較高(≥5%)且發(fā)生纖維化，主要構(gòu)成堅(jiān)韌的表皮，中間絲嵌在交聯(lián)基質(zhì)中并形成有序排列；硬角蛋白存在于與表皮相連的結(jié)構(gòu)中作為結(jié)構(gòu)支架，是構(gòu)成毛發(fā)、羽毛、角和鱗片等組織的重要結(jié)構(gòu)蛋白，是多種生物材料的提取來(lái)源，已廣泛開展體內(nèi)外降解和相容性等相關(guān)研究[11]。軟角蛋白含硫量少(≤1%)，主要位于皮膚角質(zhì)層，由松散的細(xì)胞質(zhì)微絲束構(gòu)成，具有穩(wěn)定上皮細(xì)胞、為表皮提供彈性的作用；細(xì)胞內(nèi)的軟角蛋白是細(xì)胞膜、脊髓和視網(wǎng)膜神經(jīng)等組織結(jié)構(gòu)的重要組分[17-19]。

角蛋白也可以根據(jù)等電點(diǎn)進(jìn)一步細(xì)分為酸性和堿性兩大類，等電點(diǎn)是蛋白質(zhì)中性時(shí)的pH值，角蛋白經(jīng)蛋白翻譯修飾后的pI值會(huì)發(fā)生改變，離子鍵的存在也與pH值有關(guān)，pI=4.9時(shí)，蛋白質(zhì)以兩性離子形式存在[12]。角蛋白一般是中性的，離子鍵在極端酸性或堿性條件下被削弱，銨離子和羧基陰離子之間存在離子鍵，這些化學(xué)鍵在高pH值時(shí)被氨基脫質(zhì)子，在低pH值時(shí)被羧基質(zhì)子化[12]。例如，頭發(fā)基質(zhì)蛋白的分子量為15～28 kDa，等電點(diǎn)5.0～7.0的酸性頭發(fā)基質(zhì)蛋白有14種；分子量18.5～28 kDa，等電點(diǎn)7.8～8.8的堿性基質(zhì)蛋白有12種[15]。這些分類和基本理化特征是角蛋白研究的重要基礎(chǔ)，基于不同分類方法的角蛋白種類隨著蛋白鑒定和分離新技術(shù)以及新材料來(lái)源的開發(fā)也在持續(xù)增加。

1.3 角蛋白生物學(xué)特點(diǎn)

角蛋白來(lái)源的生物材料憑借其豐富的二硫鍵和氫鍵，形成了獨(dú)特的生物相容性、生物降解以及機(jī)械強(qiáng)度等特征，在眾多天然與合成的高分子化合物中獨(dú)樹一幟，極大改變了生物材料的來(lái)源途徑和提取工藝。

生物相容性是指材料必須無(wú)毒、無(wú)刺激性、無(wú)致癌、無(wú)致突變和不使宿主發(fā)生局部炎癥的基本特征，是生物醫(yī)學(xué)材料必須具有的特性。在生物醫(yī)學(xué)研究和臨床應(yīng)用之前，所有生物材料都必須進(jìn)行細(xì)胞和組織相容性測(cè)試，細(xì)胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)是最常用的體外相容性評(píng)估方法。通過(guò)12種不同細(xì)胞系在角蛋白膜和聚苯乙烯上的生長(zhǎng)行為比較研究，證明角蛋白材料具有良好的生物相容性[20]。進(jìn)一步對(duì)不同來(lái)源的角蛋白提取物植入動(dòng)物模型測(cè)試，表明角蛋白材料在活體動(dòng)物水平具有良好的生物相容性[21]。另外，以頭發(fā)中提取的角質(zhì)糖(keratose，KOS)制成的透析膜，在生物體內(nèi)與角膜的生物相容性較好，炎癥反應(yīng)輕，為角蛋白膜在角膜功能方面的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)[22]。目前已在小鼠、大鼠、兔子和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行相容性試驗(yàn)，結(jié)果均表明體內(nèi)移植角蛋白不會(huì)引起明顯的免疫反應(yīng)，也不會(huì)對(duì)皮膚、肌肉、心臟和神經(jīng)等組織和器官造成較大的負(fù)面影響[23]，表明生物角蛋白具有多組織相容性的特點(diǎn)。

生物降解性是角蛋白具有的天然特性之一，在臨床應(yīng)用中作為支架材料的理想降解速度應(yīng)與目標(biāo)組織的生長(zhǎng)速度相匹配，角蛋白人工合成材料剛好滿足了這一特殊要求[8]。角蛋白從毛發(fā)纖維中提取后，通過(guò)化學(xué)處理破壞二硫鍵，使IFPs蛋白與KAPs蛋白通過(guò)氧化或還原轉(zhuǎn)化形成非交聯(lián)模式，氧化提取后的角蛋白具有吸濕性、水溶性和交聯(lián)性，在極端pH值下易水解，這些特性使得角蛋白生物材料在體內(nèi)降解相對(duì)較快，幾天至幾周時(shí)間即可完成[8]。但是，經(jīng)還原處理后的角蛋白極性降低，不易溶于水，在極端pH值下更穩(wěn)定，這種角蛋白材料可以在體內(nèi)存在數(shù)周至數(shù)月[8，14，24-25]。研究證明蛋白酶K可以降解角蛋白，但人體缺少專門降解角蛋白的角朊酶(keratinase)，因此角蛋白在人體內(nèi)的穩(wěn)定性高于那些易被膠原酶降解的蛋白質(zhì)[26]。不同處理后的角蛋白生物降解性有較大差異，研究并控制生物材料降解速率是功能性組織設(shè)計(jì)的重要基礎(chǔ)，也是臨床應(yīng)用的前提[8]。

角蛋白結(jié)構(gòu)堅(jiān)固、穩(wěn)定性高，不溶于水和許多弱酸、堿等溶劑，其抗酶降解的穩(wěn)定性和生物相容性已在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用和再生醫(yī)學(xué)中得到了廣泛關(guān)注[11，15]。角蛋白中豐富的半胱氨酸使其具有機(jī)械性、化學(xué)抗性和耐熱性的特點(diǎn)，使得其在可制備生物材料領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。雖然角蛋白具有顯著的生物學(xué)優(yōu)良特性，但另一方面其作為生物材料也存在力學(xué)性能差、體內(nèi)降解速度較快、分子量較低等不足，限制了角蛋白基生物材料的直接開發(fā)利用。交聯(lián)處理是改善角蛋白物理力學(xué)性能的有效方法，同時(shí)根據(jù)交聯(lián)程度保持角蛋白的生物活性[8，11]，在很大程度上克服角蛋白自身特性的不足。改良后的角蛋白具有獨(dú)特的生物相容性、生物降解性和生物活性，使其成為具有廣泛應(yīng)用前景的生物醫(yī)學(xué)材料，在傷口愈合、組織工程修復(fù)和藥物傳遞等臨床中具有巨大的開發(fā)潛力和市場(chǎng)前景。

2 角蛋白來(lái)源及提取技術(shù)

2.1 角蛋白來(lái)源

2.1.1 人類毛發(fā)角蛋白

人類毛發(fā)主要是頭發(fā)，來(lái)源廣泛并且數(shù)量較多、易于搜集，頭發(fā)發(fā)絲纖維由外向內(nèi)依次是角質(zhì)層、皮質(zhì)層和髓質(zhì)層，角質(zhì)層由矩形重疊扁平細(xì)胞組成，占纖維總重量的10%，含有5～12層的β-角蛋白[26]。髓質(zhì)層位于毛發(fā)纖維的中心，由角質(zhì)化細(xì)胞松散排列組成柔軟松散的軸向流，是人發(fā)纖維的多孔部分，與全纖維相比髓質(zhì)中半胱氨酸和含硫量較低，酸性和堿性氨基酸含量相對(duì)較高。皮質(zhì)層是頭發(fā)的主要組成部分，由低硫α-角蛋白和高硫β-角蛋白組成，分別占頭發(fā)纖維重量的50%～60%和20%～30%[27]。從毛發(fā)中提取的角蛋白屬于硬角蛋白，具有較強(qiáng)的成纖維能力[28]。目前證明人類毛發(fā)蛋白結(jié)構(gòu)由17個(gè)KIFs基因和85個(gè)KAPs編碼基因構(gòu)成，分子量41.5～59 kDa，等電點(diǎn)5.1～6.8[27，29]。人類毛發(fā)尤其是頭發(fā)提取角蛋白是個(gè)性化醫(yī)學(xué)生物相容性材料的重要來(lái)源，其含有具有細(xì)胞黏附功能的亮氨酸-天冬氨酸-纈氨酸肽鏈，具有增加細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)連接的能力，與天然組織結(jié)構(gòu)相似，被認(rèn)為是作為合成細(xì)胞外基質(zhì)用于體外組織工程支架的良好候選材料。

2.1.2 羊毛角蛋白

羊毛主要成分是角蛋白[30]，由角質(zhì)層和皮質(zhì)層組成，多數(shù)粗羊毛類似頭發(fā)結(jié)構(gòu)含有髓質(zhì)層，但以細(xì)毛著稱的美利奴羊毛纖維結(jié)構(gòu)中不含髓質(zhì)層。角質(zhì)層的細(xì)胞由梭形皮層細(xì)胞形成，扁平重疊的角質(zhì)層細(xì)胞包圍皮質(zhì)層，皮質(zhì)層是羊毛纖維的主體部分，占潔凈羊毛總重量的90%～98%，皮質(zhì)層主要由IFPs和KAPs組成，兩種蛋白交叉連接發(fā)生角質(zhì)化最終形成羊毛纖維[29，31]。羊毛的結(jié)構(gòu)和人類頭發(fā)有許多相似之處，但是羊毛的直徑(約為20 μm)明顯小于頭發(fā)(約為80 μm)[32]。羊毛角蛋白分子量約15～58 kDa，等電點(diǎn)為4.7～5.4[8，31]。羊毛是角蛋白材料的重要來(lái)源，也被認(rèn)為是中間絲蛋白IFPs的主要來(lái)源，在紡織業(yè)、化妝品和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域占有重要地位[29]。如何高效利用羊毛進(jìn)行角蛋白提取并開發(fā)成新型生物材料是目前羊毛應(yīng)用研究的一個(gè)新方向。

2.1.3 羽毛角蛋白

禽類羽毛由羽軸、羽片和羽枝三部分組成，羽毛成分中90%以上為角蛋白，大量羽毛作為禽類養(yǎng)殖業(yè)的副產(chǎn)品通過(guò)填埋或焚燒等方式處理，全世界羽毛年產(chǎn)量超6 500萬(wàn)t[14]，因此是角蛋白含量豐富且成本最低的材料來(lái)源。羽毛中主要有分子量10～30 kDa的β-角蛋白和部分α-角蛋白，β-角蛋白作為主要成分起到保護(hù)作用，少量的α-角蛋白則有利于羽毛的生長(zhǎng)發(fā)育[13，16]。羽毛中約7%的半胱氨酸殘基含量決定了角蛋白組織的柔韌度，羽毛相較于半胱氨酸11%～17%羊毛更為柔軟[33]?；诎腚装彼岬暮亢徒Y(jié)構(gòu)特征，通?？蓪⑵渲械亩蜴I還原為巰基(SH)，處理后的羽毛角蛋白提取物可用于多項(xiàng)生物學(xué)研究和生產(chǎn)原料[8]。

2.2 角蛋白分離提取技術(shù)

目前從毛發(fā)等生物材料中提取角蛋白的方法有多種，根據(jù)毛發(fā)材料性質(zhì)和提取物特點(diǎn)采用不同方法。最初使用化學(xué)試劑氧化或還原得到角蛋白，但該方法所需試劑對(duì)環(huán)境造成較大污染且提取效率較低。物理方法進(jìn)行高溫高壓破壞二硫鍵，過(guò)程無(wú)污染、成本低，提取得到的角蛋白具有自我組裝、聚合成纖維并形成多孔膜、生成凝膠和支架的內(nèi)在能力。生物技術(shù)法則利用微生物分泌的特定酶降解角蛋白，該方法在一些新興工業(yè)和生物技術(shù)領(lǐng)域探究中得到應(yīng)用，是將來(lái)角蛋白提取產(chǎn)業(yè)化和規(guī)模化生產(chǎn)中最具開發(fā)潛力的新型技術(shù)[11]。隨著蛋白分離提取技術(shù)的發(fā)展，研究者提出了利用快速攪拌的去溶劑法、鹽析法、尿素-氯化膽堿共溶體系等提取羊毛角蛋白方法，相比之下尿素-氯化膽堿共溶體系提取得到的角蛋白結(jié)構(gòu)更為完整[34]。角蛋白作為一種生物材料，運(yùn)用不同的處理方法得到的最終產(chǎn)物及其特性也有所不同，這些特性直接影響生物材料(見表1)最終的物理、化學(xué)和生物特征，這些屬性決定了角蛋白材料在醫(yī)學(xué)中的用途。

3 角蛋白的應(yīng)用

角蛋白作為天然生物材料被廣泛運(yùn)用于生物醫(yī)學(xué)研究和臨床治療中，尤其在再生醫(yī)學(xué)中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。

早在16世紀(jì)我國(guó)著名醫(yī)藥學(xué)家李時(shí)珍就提出一種名叫“血余炭”的藥物可以加速傷口的愈合，實(shí)則該物質(zhì)是通過(guò)熱裂解的頭發(fā)提取物。在之后的數(shù)百年里人們對(duì)角蛋白的功能、組成和獲取來(lái)源等很多方面開展了大量研究并獲得了諸多資料，但是對(duì)于角蛋白的應(yīng)用研究報(bào)道較少。在21世紀(jì)初，研究人員開始以羊毛角蛋白為材料進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并用于組織工程，研究成果為角蛋白生物材料在神經(jīng)修復(fù)、止血和傷口愈合等多個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。隨著技術(shù)改進(jìn)，現(xiàn)在可以從頭發(fā)、羊毛和羽毛中提取并開發(fā)出不同形式的角蛋白生物材料，如薄膜、水凝膠、海綿、纖維和3D支架等，但人工提取或制造的角蛋白在機(jī)械性能方面具有一定的局限性，需要添加交聯(lián)劑和增塑劑來(lái)改善角蛋白的部分機(jī)械特性以滿足臨床應(yīng)用要求，在應(yīng)用中與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)如聚乙二醇等人工合成材料聯(lián)合使用才能更好地滿足臨床和應(yīng)用需求。另外，頭發(fā)和指甲角蛋白及其薄膜可用于抗過(guò)敏材料和制備支架用于組織工程等[28]。多年來(lái)研究表明，角蛋白材料在臨床應(yīng)用如組織和器官再生、替換或修復(fù)中有著巨大的潛在市場(chǎng)前景，如骨、軟骨、皮膚和神經(jīng)修復(fù)以及替換等所需材料的開發(fā)就是最普遍應(yīng)用的領(lǐng)域(圖1)。

3.1 角蛋白在骨組織工程的應(yīng)用

骨質(zhì)疏松和骨關(guān)節(jié)炎癥是臨床常見病之一，手術(shù)再生和修復(fù)是臨床治療的重要手段[43]。使用角蛋白生物材料取代植入體內(nèi)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)金屬合成物是近年來(lái)再生醫(yī)學(xué)的重要突破，成為醫(yī)學(xué)研究和臨床骨組織修復(fù)材料應(yīng)用領(lǐng)域之一[24]。

用于骨組織修復(fù)的材料要求具有良好的強(qiáng)度和彈性等機(jī)械性能，但提取的角蛋白材料力學(xué)性能不佳，需要與天然聚合物共混生成產(chǎn)物后使之具備極佳的物理力學(xué)等優(yōu)良特性，同時(shí)改善降解性，成為醫(yī)學(xué)骨組織修復(fù)中較佳的生物材料[44]。在角蛋白提取物改良方面，從起初添加羥基磷灰石(HAP)制成海綿支架到后來(lái)使用聚乳酸-羥基乙酸(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)制成復(fù)合支架，這些復(fù)合物改善了材料表面粗糙程度和分子顆粒大小以及熱穩(wěn)定性，使其具有更好的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率，還能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞附著能力并提升增殖速度，使其完全滿足組織修復(fù)需要[45]?；诮堑鞍讖?fù)合材料具有自我聚合和組裝能力，這些材料做成的生物活性支架能夠修復(fù)多種組織[18]。例如，磷酸鈣涂層角蛋白/聚已酸內(nèi)酯(polycaprolactone，PCL)復(fù)合材料支架提高了Ca2+吸附能力，還增加了材料機(jī)械強(qiáng)度[43]，濃度20%的羊毛角蛋白中間絲蛋白水凝膠能夠促進(jìn)牙髓質(zhì)愈合且效果良好[46]，這些材料都已在臨床中得到廣泛應(yīng)用。

作為骨組織工程的支架材料，必須具備的多孔性和互聯(lián)性也是角蛋白生物材料的關(guān)鍵特征，這樣的支架才能允許營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣擴(kuò)散到細(xì)胞，消除細(xì)胞代謝產(chǎn)生的廢物和周圍組織的入侵[8]。改良的角蛋白纖維海綿支架具有高達(dá)約93%的連接孔隙度，同時(shí)模仿了細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞識(shí)別點(diǎn)，該支架表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，具有良好的細(xì)胞粘附和增殖能力，還能夠通過(guò)離子互相作用與骨形態(tài)蛋白BMP-2結(jié)合，作為載體用于缺損股骨的再生[47]。目前，角蛋白材料來(lái)源的組織工程研究在于建立合適的支架系統(tǒng)平臺(tái)，更好的把生物材料或細(xì)胞及生長(zhǎng)因子結(jié)合，提高組織修復(fù)能力，并改造成為個(gè)性化的支架材料，這是當(dāng)前骨組織工程研究和開發(fā)到轉(zhuǎn)化應(yīng)用的重要課題。

3.2 角蛋白在神經(jīng)組織工程的應(yīng)用

醫(yī)學(xué)中外科切除或物理?yè)p傷所致神經(jīng)損傷的修復(fù)是當(dāng)前醫(yī)療中面臨的一個(gè)重要難題，神經(jīng)損傷會(huì)導(dǎo)致患者完全喪失感覺和自主神經(jīng)功能，外傷性周圍神經(jīng)損傷的首選治療方法是將2根神經(jīng)殘端直接縫合修復(fù)，但是縫合后的愈合和損傷的修復(fù)需要更多的輔助治療[48]。神經(jīng)組織的修復(fù)和再生需要為細(xì)胞增殖提供支撐材料，傳統(tǒng)的金屬和生物材料填充物通常為細(xì)胞再生只能提供物理支持，現(xiàn)如今被多種生物可降解材料和人工神經(jīng)導(dǎo)管材料逐步取代并廣泛應(yīng)用。角蛋白由于使用方便、具有天然生物活性和生物相容性以及價(jià)格優(yōu)勢(shì)，成為神經(jīng)組織工程材料的重要替代物。目前研究表明，濃度15%的角蛋白材料具有幫助神經(jīng)組織修復(fù)的良好效果[49]，是神經(jīng)組織修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)的重要開發(fā)對(duì)象。

神經(jīng)組織修復(fù)和再生的支撐材料比較特殊，角蛋白水凝膠作為填充物可以加速神經(jīng)再生和恢復(fù)，但這種角蛋白的制備需要通過(guò)氧化法，且需要具有一定溶解度的α-角蛋白和β-角蛋白材料，改良材料不但保留大量水分、黏彈性強(qiáng)，還具有方便以微創(chuàng)方式植入并彌補(bǔ)不規(guī)則形狀缺陷的優(yōu)勢(shì)和潛力，提高神經(jīng)再生修復(fù)速度[8]。當(dāng)前，神經(jīng)組織工程中最常用的角蛋白材料是氧化法所得的角質(zhì)糖KOS。體外研究表明，由頭發(fā)制備的角質(zhì)糖KOS凝膠有助于Swann細(xì)胞周圍神經(jīng)再生，促進(jìn)細(xì)胞的附著和增殖，并上調(diào)重要基因的表達(dá)從而改善神經(jīng)再生，且該KOS凝膠成功用于改善4 mm脛骨神經(jīng)損傷小鼠模型的功能神經(jīng)恢復(fù)[26]。機(jī)制研究表明，KOS可與周圍神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system，PNS)相互作用，通過(guò)激活Swann細(xì)胞促進(jìn)修復(fù)功能[50]。KOS凝膠作為基底材料的再生神經(jīng)在面積和軸突密度甚至優(yōu)于自體移植物，且神經(jīng)傳導(dǎo)速度更快[51]。我國(guó)科研人員探究使用鹽酸處理的天然角蛋白材料與神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)相交聯(lián)，該材料可以支持神經(jīng)干細(xì)胞的黏附、生存、遷移和分化，有效促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化，顯著增加神經(jīng)元分化比率，是一種神經(jīng)組織修復(fù)較為理想的角蛋白材料[52]。在用于神經(jīng)修復(fù)的角蛋白材料中，頭發(fā)來(lái)源的角蛋白具有與自體移植相當(dāng)或更好的效果，改良優(yōu)化的角蛋白水凝膠是神經(jīng)再生、修復(fù)和個(gè)性化醫(yī)療中最具應(yīng)用前景的候選材料[51]。

3.3 角蛋白在傷口愈合的應(yīng)用

人體嚴(yán)重病變或受損較重的表皮難以自我修復(fù)，要依靠藥物、物理治療甚至手術(shù)移植提高康復(fù)水平。角蛋白敷料在傷口愈合過(guò)程中具有吸收滲出物并形成凝膠的能力和良好的吸水性并能促進(jìn)愈合過(guò)程。角蛋白膜材料的開發(fā)為組織損傷修復(fù)和組織替代品的臨床應(yīng)用提供了新材料和治療方案，其創(chuàng)面修復(fù)和止血功能以及優(yōu)良的特性可以有效促進(jìn)細(xì)胞黏附，這種新材料已開發(fā)出多個(gè)臨床產(chǎn)品[12，53]。

角蛋白制作的水凝膠、薄膜和纖維是最常見的臨床用于傷口敷料的材料形式。乙二醇和戊二醛混合物中加入10%角蛋白和明膠制備的薄膜具有良好的力學(xué)性能和吸水性能，可用于傷口包扎[11]。多孔材料的角蛋白殼聚糖/虎杖甙復(fù)合生物支架則具有孔隙多、韌性強(qiáng)和塑性好等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前傷口修復(fù)效果最佳的材料之一[54]。聚乳酸/聚(羥基丁酸-羥基戊酸共聚酯)-角蛋白復(fù)合纖維、聚乙烯吡咯烷酮-羊毛角蛋白復(fù)合納米纖維可以維持人類原代皮膚成纖維細(xì)胞的附著和生長(zhǎng)，作為皮膚支架能很好地支持皮膚組織再生過(guò)程和傷口愈合[55]。角蛋白復(fù)合材料比單純的納米纖維材料更有利于成纖維細(xì)胞的粘附和增殖，能加速創(chuàng)面恢復(fù)。KOS水凝膠在傷口修復(fù)中表現(xiàn)優(yōu)異，在創(chuàng)傷早期通過(guò)增強(qiáng)成纖維細(xì)胞的浸潤(rùn)、膠原蛋白的生成和血管化，進(jìn)而減少炎癥，在后期清除成纖維細(xì)胞從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合，且愈合速度更快[56]。動(dòng)物試驗(yàn)證明，KOS水凝膠能夠維持化學(xué)燒傷模型小鼠和熱燒傷模型豬傷口細(xì)胞的活力并促進(jìn)增殖，縮短傷口愈合時(shí)間，優(yōu)化傷口結(jié)痂過(guò)程[23]。人工改性KOS水凝膠可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和肉芽組織生成，更適于急性傷口愈合[56]。不同濃度角蛋白水凝膠對(duì)傷口愈合效果不同，9%的水凝膠適用燒傷皮膚的再生，15%的水凝膠適于神經(jīng)組織修復(fù)和再生[11]，而5%水凝膠有助于體內(nèi)傷口愈合[57]。另外，角蛋白具有的化學(xué)鍵和結(jié)合位點(diǎn)可以提高藥物因子的藥效，頭發(fā)角蛋白偶聯(lián)胰島素具有更強(qiáng)止血和傷口愈合能力[58]，而復(fù)合角蛋白水凝膠治療隱性營(yíng)養(yǎng)不良性大皰性表皮松解效果更好[59]。如今，已有部分角蛋白產(chǎn)品完成臨床試驗(yàn)，如治療靜脈曲張性潰瘍(NCT02896725)和乳腺癌皮膚局部角質(zhì)標(biāo)識(shí)(NCT03374995)[59]。角蛋白材料在組織愈合和創(chuàng)面?zhèn)谛迯?fù)的應(yīng)用是臨床醫(yī)學(xué)組織醫(yī)學(xué)工程的重要開發(fā)領(lǐng)域，對(duì)于提高生命健康具有重要意義。

3.4 角蛋白在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用

藥物轉(zhuǎn)運(yùn)是指將治療藥物輸送至患者體內(nèi)直至藥物靶點(diǎn)或病灶的過(guò)程，角蛋白因自身安全和具有提高藥效等方面的優(yōu)勢(shì)成為藥物傳遞系統(tǒng)(drug delivery systems，DDSs)的重要候選載體之一。生物角蛋白材料可用于多種藥物輸送，包括小分子藥物和大分子生物制劑。此外，角蛋白富含活性化學(xué)基團(tuán)(羥基、羧基和酰胺)，這些基團(tuán)能夠與生物活性分子相互作用，從而為后處理提供了技術(shù)突破口；如蛋白質(zhì)和肽類藥物中引入巰基可顯著改善聚合物載體的黏附性，進(jìn)而提高藥物利用效率，保護(hù)藥物活性[60]。角蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)載體與現(xiàn)有臨床使用的合成硫代聚合物相比，角蛋白帶有硫醇基團(tuán)或二硫鍵，提供了更有內(nèi)聚性的聚合物基質(zhì)，從而能夠更精準(zhǔn)可控地釋放藥物，將藥物精準(zhǔn)輸送到作用靶點(diǎn)[60-61]。藥物分子與生物角蛋白材料的交聯(lián)在生物活性物質(zhì)釋放中起到重要作用，不同性狀的角蛋白如顆粒狀、膜和水凝膠等，均可以作為載體來(lái)固定或封裝藥物。生物分子、蛋白質(zhì)和細(xì)胞等與載體之間的作用是不同的，采用適配類型的角蛋白可以防止轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)尤其是藥物發(fā)生不可控或未知的變化。角蛋白膜和水凝膠與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶TGase交聯(lián)后靶向藥物的釋放研究表明，前者的釋放量較低，水凝膠更適于該類藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)[14]。但是，KOS降解較快，用作載體則會(huì)影響生長(zhǎng)因子的釋放速率[62]，而還原角蛋白水凝膠的降解則影響環(huán)丙沙星的轉(zhuǎn)運(yùn)和釋放過(guò)程[63]，但具體調(diào)控機(jī)制和可用于臨床的角蛋白材料尚需針對(duì)特定藥物進(jìn)一步研究。值得肯定的是，藥物和KOS水凝膠存在直接的互相作用，二硫化物的交聯(lián)程度可以改變藥物或生長(zhǎng)因子的釋放速率[25]。交聯(lián)二硫化物水凝膠是一種藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的新型材料，角蛋白/烯丙基硫醚水凝膠則是一種基質(zhì)封裝和細(xì)胞傳遞材料[64]，羧甲基/羥基磷灰石-角蛋白復(fù)合材料適于骨愈合和藥物釋放[65]，利用角蛋白制備DOX負(fù)載的角蛋白-透明質(zhì)酸微凝膠，適用于腫瘤治療相關(guān)藥物釋放[66]。羽毛角蛋白納米顆粒具有疏水結(jié)構(gòu)并攜帶正負(fù)電荷，可以裝載多種類型藥物并能定向轉(zhuǎn)運(yùn)至靶標(biāo)器官[61]。角蛋白納米顆粒與水凝膠和生物膜相比，納米顆粒具有更大的接觸面積，更易于保存和使用，用于轉(zhuǎn)運(yùn)羅丹明B和姜黃素的試驗(yàn)證明，對(duì)此類藥物表現(xiàn)出pH值和氧化還原雙重響應(yīng)性[67]。角蛋白生物材料用于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的臨床應(yīng)用以及作用機(jī)制仍在不斷探索研究之中。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

隨著從多種材料中角蛋白提取和加工技術(shù)的不斷改進(jìn)，其作為一種來(lái)自動(dòng)物體的天然蛋白材料在醫(yī)藥和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，展現(xiàn)出潛在應(yīng)用前景和市場(chǎng)價(jià)值。角蛋白材料是構(gòu)成毛發(fā)、指甲、角、蹄和羽毛的主要成分，來(lái)源廣泛，富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)和大量存在的二硫鍵使其具有較高的機(jī)械強(qiáng)度，也為加工后的產(chǎn)品提供了諸多可利用的化學(xué)基團(tuán)。角蛋白具有天然不溶性和良好的機(jī)械性能，使其成為一種可再生、生物相容的天然材料，能通過(guò)不同處理獲得多種產(chǎn)物。當(dāng)前技術(shù)提取的角蛋白材料均具有良好的機(jī)械性和生物相容性，以及良好的耐久性和易于生物降解等優(yōu)點(diǎn)，且具備作為細(xì)胞增殖載體的優(yōu)良特征[12]。生物角蛋白材料可以加工后轉(zhuǎn)化為復(fù)雜的三維支架、纖維、海綿、薄膜和水凝膠，用于生物醫(yī)學(xué)多個(gè)領(lǐng)域的研究和臨床[8，12]，但是角蛋白的提取和加工過(guò)程優(yōu)化仍是當(dāng)前生物技術(shù)研究的重要課題。

角蛋白作為新型生物材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的研究和應(yīng)用引起了廣泛關(guān)注，是集材料學(xué)、生物物理學(xué)、生理學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等多個(gè)學(xué)科的一門應(yīng)用科學(xué)，目前主要集中于骨和神經(jīng)組織工程以及組織再生和藥物釋放等方面。隨著角蛋白作為組織工程材料在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、組織再生等方面分子機(jī)制的研究，其在多種疾病的臨床治療與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)中也展現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價(jià)值。角蛋白生物材料的深度開發(fā)和功能探究為新型生物醫(yī)學(xué)材料的開發(fā)利用提供了方向和思路，在生命健康和生態(tài)環(huán)保領(lǐng)域的應(yīng)用將日益廣泛。