駱宗江，劉彪，林珈好

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)藥創(chuàng)新中心，北京 100193)

犬乳腺腫瘤(canine mammary tumour，CMT)是雌性犬最常見的腫瘤之一，占雌性犬腫瘤疾病的25%～42%[1]，其發(fā)病率是人類乳腺腫瘤的3倍[2-3]，嚴(yán)重威脅犬的健康。目前，手術(shù)切除是治療CMT最常見的方式，然而，對于惡性乳腺腫瘤的患犬，單純手術(shù)切除療法對其創(chuàng)傷大，術(shù)后并發(fā)癥多且容易復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[4]。CMT在中獸醫(yī)中屬于“乳巖”范疇，其主要病因病機為肝郁氣滯，瘀毒互結(jié)[5]，氣滯血瘀、痰濁淤積，阻于乳絡(luò)，久而生成癌毒。癌毒是乳腺腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，扶正祛邪、抗癌解毒是治療乳腺腫瘤的重要治則[6]。黃芩是清熱解毒中藥，尤其擅長解癰腫瘡毒，是治療乳腺腫瘤的常用中藥。黃芩苷(baicalin)是從黃芩干燥根中提取得到的黃酮類成分，為黃芩的主要活性成分。研究表明，黃芩苷能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，且具有時間和濃度依賴性[7]，但是黃芩苷存在水溶性差和生物利用度低的缺點，其臨床應(yīng)用受到限制，亟需尋找有效的解決方法。

碳點是一類粒徑小于10 nm，主要元素為碳、氫、氧和氮的新型零維碳納米材料[8]。中草藥作為天然產(chǎn)物，其來源廣泛，含有豐富的活性成分，是碳點合成的理想前體之一[9]。以中草藥為碳源合成的中藥碳點作為碳點家族的最新成員，具有水溶性好、毒性低及雜原子豐富等優(yōu)點[10]，在生物成像[11]、抑菌[12]和腫瘤治療[13]等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的研究和應(yīng)用。本研究以黃芩苷為碳源，制備黃芩苷碳點，并探究了其抗犬乳腺腫瘤的活性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

犬乳腺癌細(xì)胞系CIPp由日本東京大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院饋贈；CMT-7364由本實驗室自臨床分離、鑒定及保存[14]。

1.2 主要試劑

黃芩苷(純度≥90%)，上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器

水熱合成反應(yīng)釜，西安儀創(chuàng)實驗室儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；真空干燥箱，上海精宏儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；Milli-Q 超純水儀，美國Millipore公司產(chǎn)品；真空冷凍干燥儀，上海葉拓科技有限公司產(chǎn)品；紫外-可見分光光度計，美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；熒光分光光度計，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；傅里葉變換紅外光譜儀，德國Sigma公司產(chǎn)品；場發(fā)射透射電鏡，荷蘭Philips-FEI公司產(chǎn)品；X射線光電子能譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；透析袋(1 000 Da)，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.4 黃芩苷碳點的制備

將20 mg黃芩苷粉末與30 mL超純水混合均勻后，轉(zhuǎn)移至水熱合成反應(yīng)釜，隨后將其置于真空干燥箱中，反應(yīng)溫度設(shè)為160 ℃，持續(xù)6 h。反應(yīng)結(jié)束后，待反應(yīng)釜自然冷卻至室溫，取出溶液，12 000g離心30 min，收集上清液，用0.22 μm濾膜過濾，取濾液透析24 h。最后，使用真空冷凍干燥儀對透析后的液體進(jìn)行冷凍干燥[13-15]。

1.5 黃芩苷碳點的表征

1.5.1 黃芩苷碳點形態(tài)觀察

將制得的黃芩苷碳點配制成碳點水溶液，將碳點水溶液滴于超薄碳膜，待干燥后在高分辨率透射電子顯微鏡下觀察碳點的大小和形態(tài)。

1.5.2 黃芩苷碳點的紫外可見吸收光譜分析

將黃芩苷碳點配制成的碳點溶液置于紫外-可見分光光度計中，掃描檢測其250～700 nm的吸收圖譜。

1.5.3 黃芩苷碳點的熒光發(fā)射光譜分析

將黃芩苷碳點配制成的碳點溶液置于熒光光譜儀中，用380～480 nm波長的光激發(fā)，掃描并記錄黃芩苷碳點在不同激發(fā)波長下的發(fā)射光譜。

1.5.4 黃芩苷碳點的紅外光譜分析

將碳點樣品置于傅利葉紅外光譜儀中進(jìn)行紅外掃描，波數(shù)范圍為500 ～4 000 cm-1，記錄紅外譜圖，分析碳點的表面結(jié)構(gòu)。

1.6 黃芩苷碳點對犬乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用

將犬乳腺腫瘤細(xì)胞CIPp、CMT-7364培養(yǎng)于含10%胎牛血清和100 U/mL 青霉素鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)皿置于37 ℃，5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的CIPp和CMT-7364細(xì)胞系按照1.0×104個/μL接種于96孔板，為減少揮發(fā)，在96孔細(xì)胞板四周的孔中加入100 μL PBS，不接種細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)液，分別加入100 μL含有不同濃度黃芩苷碳點的完全培養(yǎng)基。共孵育48 h后，棄去原培養(yǎng)基，分別加入100 μL含10% CCK-8試劑的DMEM，37 ℃避光孵育30～60 min后，檢測各孔在450 nm處的OD值，計算細(xì)胞存活率；用Graphpad Prism 8.0軟件計算碳點溶液作用于兩種細(xì)胞的IC50值。

細(xì)胞存活率=(OD試驗-OD對照)/(OD對照-OD空白)×100%。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷碳點形態(tài)觀察

如圖1所示，黃芩苷碳點呈類球形，顆粒較均勻且分散性良好，顆粒的平均直徑為3～6 nm，晶格間距為0.253 nm。

A.透射電子顯微鏡成像；B. 高分辨率透射電子顯微鏡成像。

2.2 黃芩苷碳點的紫外可見吸收光譜分析

黃芩苷碳點水溶液在自然光照下呈黃色，在365 nm紫外光下發(fā)出藍(lán)色熒光。由紫外可見吸收光譜(圖2)可知，黃芩苷碳點在260 nm及350 nm附近存在吸收峰。

圖2 黃芩苷碳點的紫外可見吸收光譜

2.3 黃芩苷碳點的熒光發(fā)射光譜分析

熒光發(fā)射光譜(圖3)顯示，黃芩苷碳點的發(fā)射波長隨著激發(fā)波長的增加逐漸紅移，說明該碳點具有較好的熒光激發(fā)依賴特性。

圖3 黃芩苷碳點的熒光發(fā)射光譜

2.4 黃芩苷碳點的紅外光譜分析

如圖4所示，在黃芩苷碳點的紅外光譜中，3 432 cm-1附近的吸收峰歸因于O-H的伸縮振動，1 716 cm-1處吸收峰由C=O伸縮振動產(chǎn)生，1 450 cm-1處的吸收峰對應(yīng)N-H的伸縮振動，1 099 cm-1附近的吸收峰歸因于C-O的伸縮振動。結(jié)果表明，黃芩苷碳點表面存在-OH、-COOH和-NH2等基團(tuán)，提示該碳點具有較好的水溶性。

圖4 黃芩苷碳點的紅外光譜

2.5 黃芩苷碳點對犬乳腺腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

如圖5所示，黃芩苷碳點作用犬乳腺腫瘤細(xì)胞CIPp、CMT-7364 48 h的IC50分別為41.65 μg/mL和42.78 μg/mL，表明黃芩苷碳點可有效抑制犬乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖。

A.犬乳腺腫瘤細(xì)胞CIPp；B. 犬乳腺腫瘤細(xì)胞CMT-7364。

3 討論

水溶性是藥物發(fā)揮作用的關(guān)鍵性質(zhì)，水溶性的增加可增強藥物在體內(nèi)的溶解及吸收，從而改善藥物的生物利用度。本研究紅外圖譜顯示，黃芩苷碳點在3 432 cm-1、1 716 cm-1和1 450 cm-1附近出現(xiàn)吸收峰，分別歸因于O-H、C=O和N-H的伸縮振動，提示該碳點表面存在-OH、-COOH和-NH2等基團(tuán)，表明黃芩苷在制成碳點后可獲得良好的水溶性，從而發(fā)揮更優(yōu)的療效。

無限增殖是惡性腫瘤的顯著特征之一，它可導(dǎo)致腫瘤組織的過度生長，從而掠奪正常組織的營養(yǎng)和生存空間，影響機體正常的生理功能，最終嚴(yán)重威脅到個體的生命健康[16]。藥物對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用是考察其抗腫瘤活性的重要評價指標(biāo)。CCK-8試驗結(jié)果顯示，黃芩苷碳點能夠有效抑制犬乳腺腫瘤細(xì)胞CIPp和CMT-7364的增殖，這與之前的報道相似。Yao等[13]基于人參皂苷Re成功合成出一種新型光致發(fā)光碳點，并對其體外抗癌作用進(jìn)行評估，結(jié)果表明該碳點可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并通過caspase介導(dǎo)的途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。Li等[17]發(fā)現(xiàn)用生姜制成的碳點能夠極顯著地抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的生長，且對正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和小鼠肝細(xì)胞FL83B的毒性較低。

本研究以黃芩苷作為碳源，采用水熱法成功制備出粒徑小于10 nm的黃芩苷碳點，發(fā)現(xiàn)該碳點不僅具有良好的水溶性，且能夠有效抑制犬乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖，可為抗犬乳腺腫瘤中藥的創(chuàng)制提供試驗依據(jù)。然而，黃芩苷碳點作為一種新型零維碳納米材料，其成藥性還需進(jìn)一步探究，如增設(shè)陽性藥物對照組、采用正常細(xì)胞系進(jìn)行試驗以及在犬乳腺腫瘤在體模型上進(jìn)一步驗證等。