趙永祥，宋旭，周金柱，范寶超，赫文龍，李彬

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，江蘇 南京 210014)

豬繁殖和呼吸障礙綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)俗稱“藍(lán)耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染引起的一種嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益的豬傳染病。PRRSV可引起懷孕母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)和木乃伊胎等繁殖障礙，公豬精液質(zhì)量下降，仔豬和育肥豬呼吸困難等癥狀，已成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)的最重要病原之一[1]。

替米考星是一種用于家畜和家禽的新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，對胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌、支原體等均有抑制作用[2]。已有的研究表明，替米考星能夠抑制PRRSV的復(fù)制，且呈劑量依賴性，對PRRSVⅠ型和Ⅱ型均有抑制效果，還可以減少支原體、細(xì)菌等病原體的繼發(fā)感染[3-6]。國內(nèi)的研究也表明替米考星可以在體外抑制當(dāng)前流行的PRRSV高致病性毒株和類NADC30毒株在肺泡巨噬細(xì)胞中復(fù)制[7]，而替米考星在豬體內(nèi)抑制PRRSV復(fù)制的效果還有待進(jìn)一步研究。

本研究進(jìn)一步探索了替米考星在豬體內(nèi)抑制PRRSV復(fù)制的效果，研究了飼喂替米考星對豬感染PRRSV后的臨床表現(xiàn)、病毒血癥、肺臟病毒載量和病死率等方面的影響，以及飼喂替米考星對PRRSV感染前后仔豬生長性能的影響，為臨床使用替米考星防控藍(lán)耳病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、藥物、病毒與主要試劑

替米考星預(yù)混劑(泰勇，替米考星含量20%)購自禮藍(lán)(上海)動(dòng)物保健有限公司；4周齡健康仔豬(PRRSV、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒抗原和抗體均為陰性)購自規(guī)模種豬場；PRRSV高致病性毒株NF分離株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供；HiScript?反轉(zhuǎn)錄酶、探針法熒光定量試劑盒(AceQ qPCR Probe Master Mix)以及RNA提取試劑盒購自諾唯贊生物公司。

1.2 動(dòng)物分組、替米考星飼喂與PRRSV攻毒

如圖1所示，將20頭健康仔豬隨機(jī)分為2組，每組10頭。一組飼喂添加替米考星的飼料(10 kg飼料添加20 g泰勇混勻)，命名為“藥物組”。另一組飼喂不含藥飼料，作為無藥對照組。飼喂7 d后，2個(gè)組仔豬均進(jìn)行PRRSV攻毒，每頭豬肌肉注射2 mL病毒液(毒價(jià)105TCID50/mL)。

圖1 試驗(yàn)分組及流程

1.3 體溫監(jiān)測、采血及稱重

為監(jiān)測仔豬攻毒后的臨床表現(xiàn)，于攻毒后每天觀察仔豬臨床癥狀并測量直腸溫度。為檢測仔豬攻毒后的病毒血癥情況，于攻毒后第5天、第10天采血分離血清，提取RNA，通過熒光定量PCR檢測血清中病毒拷貝數(shù)。為計(jì)算替米考星對生產(chǎn)性能的影響，分別于給藥前、攻毒前及剖檢前稱重，計(jì)算日增重。

1.4 剖檢、肺臟采集及組織切片制備

將豬撲殺，剖檢觀察臟器病變情況并拍照記錄，采集適量肺臟組織提取RNA，通過熒光定量PCR測定肺臟中PRRSV載量。另外在肺臟的病變與正常組織交界處剪取適量組織，用4%多聚甲醛固定，用于制備肺臟組織病理切片，并進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色。病理切片制備和HE染色方法參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。

1.5 血清及肺臟病毒載量測定

為測定病毒血癥，每頭豬取200 μL血清提取RNA；為測定肺臟病毒載量，稱取1 g肺臟組織樣品，剪碎后加入1 mL PBS進(jìn)行勻漿。組織勻漿后于-80 ℃冰箱中反復(fù)凍融3次，再離心2 min，然后取300 μL上清液提取RNA。將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測PRRSV-N基因拷貝數(shù)。熒光定量引物及探針如表1所示。將pCDNA3.1-PRRSV-N真核表達(dá)質(zhì)粒10倍倍比稀釋為不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，通過熒光定量PCR檢測PRRSV-N基因不同拷貝數(shù)的Ct值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算測得的血清及肺臟樣品中病毒拷貝數(shù)，再換算出1 mL血清或1 g肺臟組織中的病毒載量。RNA提取、cDNA合成以及熒光定量PCR檢測方法按試劑說明書進(jìn)行。

表1 引物序列

A. 攻毒前日增重變化；B. PRRSV感染后日增重變化。

A. PRRSV感染仔豬的體溫變化；B. PRRSV感染仔豬的病毒血癥水平。

2 結(jié)果

2.1 飼喂替米考星對仔豬日增重的影響

分別記錄起始體重、攻毒前體重和剖殺時(shí)體重，計(jì)算仔豬平均日增重。結(jié)果顯示，攻毒前7 d，飼料中添加替米考星的試驗(yàn)組仔豬平均日增重為0.176 kg/d，飼料中無添加組仔豬生長平均日增重為0.137 kg/d，藥物組仔豬日增重顯著高于無藥組(圖2A)。攻毒后，所有仔豬體重均呈負(fù)增長，藥物組仔豬平均日減重0.056 kg/d，無藥組仔豬平均日減重0.086 kg/d，藥物組日減重低于無藥組(圖2B)。以上結(jié)果表明飼喂替米考星能夠提升仔豬的生長性能，并改善PRRSV感染導(dǎo)致的減重現(xiàn)象。

2.2 仔豬攻毒后體溫和病毒血癥檢測

PRRSV感染后每天測量仔豬直腸溫度，結(jié)果顯示藥物組在攻毒后第1天和第5天體溫較高，攻毒8 d后逐漸恢復(fù)正常。無藥組仔豬在攻毒后9 d內(nèi)體溫均高于正常值，且持續(xù)處于較高水平，除第7天外平均體溫均高于藥物組(圖3A)。期間臨床癥狀表現(xiàn)為被毛粗亂、精神萎靡、嗜睡。攻毒后第5天和第10天分別采集仔豬血清，熒光定量PCR檢測PRRSV的病毒載量。結(jié)果顯示，無藥組病毒血癥水平均顯著高于藥物組，且病毒血癥水平在第10天時(shí)較第5天有下降趨勢(圖3B)。上述結(jié)果表明飼喂替米考星可緩解PRRSV感染導(dǎo)致的體溫升高現(xiàn)象，減輕臨床癥狀，并顯著降低病毒血癥水平。

2.3 仔豬攻毒后的存活率

PRRSV攻毒后無藥組于第2、7、8、9天分別死亡4頭仔豬，藥物組于攻毒后第8、9天死亡2頭仔豬，藥物組仔豬存活率為80%，無藥組仔豬存活率為60%。表明飼喂替米考星可降低PRRSV感染導(dǎo)致仔豬死亡率(圖4)。

2.4 仔豬攻毒后肺臟病理變化及病毒載量

剖檢發(fā)現(xiàn)無藥飼喂組仔豬攻毒后肺臟有明顯病變，表現(xiàn)為腫脹、顯著實(shí)變，部分豬肺臟有出血或纖維樣滲出物；飼喂藥物組仔豬肺臟病變較輕微，稍微腫脹，存在散在實(shí)變。肺臟組織切片經(jīng)HE染色后，顯微鏡下觀察顯示，無藥飼喂組豬肺泡壁明顯增厚、間質(zhì)增寬、肺泡空間狹小；藥物組仔豬肺泡壁輕微增厚，肺泡形態(tài)基本正常。肺臟病變及組織切片結(jié)果見圖5A。采集肺臟組織，提取RNA 通過熒光定量PCR檢測肺臟組織中病毒載量，結(jié)果顯示無藥對照組仔豬肺臟病毒載量顯著高于藥物組的肺臟病毒載量(圖5B)。上述結(jié)果表明飼喂替米考星能夠減輕肺臟病變，降低肺臟中的病毒載量。

A. 肺臟病變(a、b)及組織切片(c、d)；c、d放大倍數(shù)為100×；B. 肺臟病毒載量。

3 討論

PRRSV給我國生豬產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也是影響全球養(yǎng)豬業(yè)最重要的病毒之一，探索PRRS防控措施具有重大意義。目前藍(lán)耳病的防控主要依靠疫苗免疫，由于PRRSV是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，容易發(fā)生變異和重組，使得臨床上不斷出現(xiàn)新的PRRSV毒株，而現(xiàn)有疫苗對異源毒株的保護(hù)力有限，不能滿足當(dāng)前藍(lán)耳病的防控需求[9-10]。同時(shí)，臨床上PRRSV經(jīng)常與支原體、胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌等存在混合感染，使得防控難度進(jìn)一步加大。在疫苗保護(hù)力不足、細(xì)菌混合感染嚴(yán)重的情況下，使用藥物抗病毒并控制細(xì)菌等病原的繼發(fā)感染，是藍(lán)耳病防控的另一個(gè)重要方向。

替米考星是Elanco研發(fā)的一種畜禽用新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素藥物，對支原體和多種細(xì)菌具有良好的抑制作用。替米考星口服吸收后肺臟中藥物濃度高，臨床上主要用于治療豬、奶牛和雞等畜禽的呼吸道感染性疾病[11]。已有研究表明替米考星可以抑制PRRSV的復(fù)制，包括Ⅰ型和Ⅱ型PRRSV，之前的體外研究結(jié)果也證實(shí)，替米考星可以有效抑制高致病性PRRSV和類NADC30 PRRSV毒株[7]。本研究進(jìn)一步在動(dòng)物體內(nèi)證實(shí)，替米考星可顯著抑制高致病性PRRSV的復(fù)制，降低病死率。因此替米考星在防控高致病性藍(lán)耳病和細(xì)菌繼發(fā)感染方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。替米考星在動(dòng)物體內(nèi)抑制類NADC30 PRRSV毒株的效果還有待進(jìn)一步研究。

替米考星作為一種新型的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，也具有一定的抗炎作用，研究表明大環(huán)內(nèi)酯類藥物可以調(diào)節(jié)宿主免疫細(xì)胞功能和組織炎癥，包括減少促炎介質(zhì)的積累以及調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞功能和凋亡[12-13]。替米考星還可以增加巨噬細(xì)胞IL-10的合成，可能是替米考星發(fā)揮抗炎作用的另一種機(jī)制[14]。在抗病毒方面，有研究表明替米考星是一種生物堿性藥，自身帶有堿性基團(tuán)，高濃度的替米考星可以改變巨噬細(xì)胞內(nèi)的酸堿度，還可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的趨化性、吞噬能力，提高巨噬細(xì)胞的活化水平，進(jìn)而抑制PRRSV的復(fù)制[15]。本研究中飼喂替米考星的仔豬肺臟炎癥相對無藥組顯著減輕，肺臟病毒載量也明顯降低，進(jìn)一步證實(shí)了替米考星的抗炎和抗病毒作用。

綜上，本研究表明飼料中添加替米考星飼喂仔豬可以減輕高致病性PRRSV感染導(dǎo)致的臨床癥狀，抑制血清和肺臟中的病毒復(fù)制，降低病死率，且可以提升日增重，表明替米考星對于PRRS的防控具有重要意義。