韓雨琪，章勝紅，潘樹濤，曾慧，杭蘇琴

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

我國飼用蛋白資源嚴(yán)重匱乏，制約了畜牧業(yè)現(xiàn)代化進(jìn)程。因此，應(yīng)大力研發(fā)和應(yīng)用非常規(guī)蛋白質(zhì)資源，以節(jié)約豆粕等資源[1]。棕櫚粕(palm kernel cake，PKC)是棕櫚果仁榨取棕櫚油后的副產(chǎn)品，由于其價(jià)格優(yōu)勢大且可替代常規(guī)飼料資源，所以我國近年來大量進(jìn)口PKC[2]。PKC在豬[3]、奶牛[4]、羊[5]等動(dòng)物飼喂試驗(yàn)上展現(xiàn)出良好的經(jīng)濟(jì)效益，在畜禽養(yǎng)殖中有廣泛的應(yīng)用前景[6]。

棕櫚粕營養(yǎng)豐富、價(jià)格低廉，且有大量的非淀粉多糖(non-starch polysaccharides，NSPs)，其中纖維素含量約為12%，甘露聚糖含量達(dá)78%[7]。半乳甘露聚糖和甘露聚糖是存在于棕櫚粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，甘露聚糖在動(dòng)物消化道增加食糜黏度，阻礙營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，限制動(dòng)物對其利用[8]。

研究表明，添加外源酶可改善棕櫚粕適口性，提高養(yǎng)分消化率[9]。甘露聚糖酶酶解棕櫚粕的最優(yōu)條件已有報(bào)道[10]，但用蛋白酶、甘露聚糖酶和纖維素酶3種酶復(fù)合來酶解棕櫚粕的研究還較少。基于蛋白質(zhì)易與纖維素形成復(fù)合物，導(dǎo)致蛋白質(zhì)不能直接利用[11]。優(yōu)化3種酶組成的復(fù)合酶體系的酶解條件，對提高棕櫚粕的營養(yǎng)價(jià)值具有一定的意義。近年來廣大學(xué)者將熵權(quán)法與TOPSIS法結(jié)合，以綜合評價(jià)試驗(yàn)方案，挑選出更準(zhǔn)確更客觀的參數(shù)組合[12]。

為降低甘露聚糖和粗纖維的含量，提高其利用率及消化率，本研究篩選了蛋白酶、甘露聚糖酶和纖維素酶3種酶復(fù)合的組成及濃度，結(jié)合正交試驗(yàn)和熵權(quán)法TOPSIS獲得棕櫚粕的適宜酶解條件，以提高棕櫚粕的營養(yǎng)價(jià)值，為棕櫚粕開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

選用產(chǎn)自馬來西亞的棕櫚粕，粉碎后過40目篩備用。甘露聚糖酶(1 000 U/g)、纖維素酶(50 000 U/g)、酸性蛋白酶(50 000 U/g)、木瓜蛋白酶(800 000 U/g)和中性蛋白酶(100 000 U/g)均購自上海源葉生物科技有限公司。

硫酸、三氯乙酸溶液(150 g/L)、五水硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉、3，5-二硝基水楊酸均為市售分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

TECAN酶標(biāo)儀、HENGZI電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、ANKOM A200i纖維分析儀、ANKOM F57濾袋、封口機(jī)、干燥器、分析天平、凱氏定氮儀FOSS kjeltec8400,消化爐和CRYSTAL臺式恒溫振蕩器。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)1研究了5種酶制劑的單獨(dú)適宜添加量和作用效果，確定復(fù)合酶組成及復(fù)合酶的各種酶制劑的優(yōu)化添加劑量。

試驗(yàn)2優(yōu)化了料水比、復(fù)合酶酶解時(shí)間、酶解pH值和酶解溫度4個(gè)水解條件，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個(gè)因素每個(gè)水平設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

試驗(yàn)3對顯著影響水解效果的料水比、復(fù)合酶酶解時(shí)間、酶解pH值和酶解溫度再進(jìn)行4因素3水平L18(34)正交試驗(yàn)，通過熵權(quán)TOPSIS方法進(jìn)行綜合分析，選出最佳酶解條件。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 蛋白酶種類的篩選

在37 ℃ pH值4.8條件下，分別用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶，在底物添加量為5.0 g、加酶量為250 U/g條件下酶解24 h，以三氯乙酸可溶蛋白含量為指標(biāo)篩選出酶解效果最佳的蛋白酶種類。

1.4.2 復(fù)合酶中各酶制劑濃度的篩選

以1.4.1篩選出的酸性蛋白酶為基礎(chǔ)，在37 ℃ pH值4.8，底物用量5.0 g，料水比為1∶2條件下，水解24 h，分別篩選0、25、45、100、200和400 U/g甘露聚糖酶，0、40、80、120、160和200 U/g纖維素酶，0、125、250和500 U/g酸性蛋白酶的最佳用量，酶解結(jié)束后沸水浴煮沸10 min終止反應(yīng)。多糖酶水解效果以還原糖產(chǎn)生量為指標(biāo)確定；蛋白酶水解效果以三氯乙酸可溶蛋白增量為指標(biāo)確定。

1.4.3 復(fù)合酶水解條件的單因素優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取5.0 g棕櫚粕，加入由甘露聚糖酶45 U/g、酸性蛋白酶250 U/g和纖維素酶160 U/g組成的復(fù)合酶。分別研究料水比為1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5和1∶3，酶解時(shí)間為5、8、12、16和20 h，酶解pH值為3.2、4.0、4.8、5.6和6.4；酶解溫度為22、27、32、37和42 ℃條件下的單因素水解試驗(yàn)。除研究因素外，其他酶解條件和評價(jià)方法均同前。每個(gè)水平重復(fù)3次。

1.4.4 正交試驗(yàn)法優(yōu)化復(fù)合酶酶解條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對料水比、時(shí)間、酶解pH值和酶解溫度進(jìn)行4因素3水平的 L18(34)正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)效果以三氯乙酸可溶蛋白、還原糖和纖維素含量為指標(biāo)確定，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.5 測定指標(biāo)及方法

反應(yīng)終止后所有樣品將料水比稀釋至1∶6，使用3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測定還原糖含量[13]。將樣品在105 ℃下烘干4 h，參照《飼料原料中酸溶蛋白的測定》NY/T 3801—2020的方法測定三氯乙酸可溶蛋白含量。采用ANKOM A200i型半自動(dòng)分析儀，使用ANKOM F57濾袋測定粗纖維含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本研究所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù) 3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用Graph Pad Prism 7.0軟件繪制圖，通過SPSS 20.0中的 One-way ANOVA 進(jìn)行單因素方差分析，并使用Duncan法進(jìn)行多重比較，采用在線SPSSAU系統(tǒng)平臺中熵權(quán)TOPSIS法對數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合評價(jià)，差異顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶組成的確定

2.1.1 纖維素酶濃度的篩選

由表2可知，在0～80 U/g濃度范圍內(nèi)，還原糖含量隨纖維素酶濃度的增加有顯著升高(P<0.05)；而當(dāng)纖維素酶濃度為160 U/g時(shí)，還原糖含量基本達(dá)到最大值，且隨著濃度的增加，還原糖含量升高不顯著(P>0.05)?？紤]到經(jīng)濟(jì)節(jié)約原則，選擇160 U/g為纖維素酶的最佳用量。

表2 纖維素酶濃度對還原糖含量的影響

2.1.2 甘露聚糖酶濃度的篩選

如表3所示，在0～45 U/g濃度范圍內(nèi)，隨甘露聚糖酶濃度的增加，還原糖含量呈上升趨勢，且當(dāng)甘露聚糖酶濃度為45 U/g時(shí)，還原糖含量已達(dá)到較大值。考慮到成本的因素，選擇45 U/g為甘露聚糖酶的最佳用量。

表3 甘露聚糖酶濃度對還原糖含量的影響

2.1.3 蛋白酶種類的篩選

表4顯示，酸性蛋白酶組酶解棕櫚粕中三氯乙酸可溶蛋白含量顯著高于其他處理組(P<0.05)，而中性蛋白酶組酶解棕櫚粕中三氯乙酸可溶蛋白含量與木瓜蛋白酶組無顯著差異(P>0.05)，故選擇酸性蛋白酶組成復(fù)合酶。

2.1.4 酸性蛋白酶濃度的篩選

如表5所示，不添加酸性蛋白酶時(shí)，三氯乙酸可溶蛋白含量僅為0.72%，而隨著酶濃度逐漸增加，三氯乙酸可溶蛋白含量也明顯提高，并在250 U/g時(shí)，酸溶蛋白含量已達(dá)到較大值，且繼續(xù)升高濃度，三氯乙酸可溶蛋白含量增加不顯著(P>0.05)，故選擇250 U/g為酸性蛋白酶的最佳用量。

表5 酸性蛋白酶濃度對三氯乙酸可溶蛋白含量的影響

2.2 復(fù)合酶水解條件的單因素優(yōu)化

2.2.1 料水比對復(fù)合酶水解效果的影響

由圖1所示，隨著水分含量的增多，還原糖含量也相應(yīng)增加，且在料水比為1∶3時(shí)，還原糖含量達(dá)到最大值，為55.53 mg/g。而料水比變化對三氯乙酸可溶蛋白蛋白含量無顯著影響，基本都保持在1.39%～1.82%之間。因此，最終選擇料水比 1∶2、1∶2.5、1∶3進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

同一指標(biāo)不同橫坐標(biāo)組之間比較；小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)；下同。

2.2.2 酶解時(shí)間對復(fù)合酶水解效果的影響

圖2顯示，隨著酶解時(shí)間的增加，三氯乙酸可溶蛋白含量和還原糖含量均呈上升趨勢，且在24 h達(dá)到最大值，故本研究選定復(fù)合酶解時(shí)間16、20、24 h 進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

同一指標(biāo)不同時(shí)間比較。

2.2.3 酶解pH值對復(fù)合酶水解效果的影響

由圖3可知，pH值的升高或降低都會抑制還原糖的生成。當(dāng)pH值為3.2時(shí)，還原糖含量僅為1 mg/g；當(dāng)pH為值4.8時(shí)，還原糖含量和三氯乙酸可溶蛋白含量都到達(dá)峰值(54.42 mg/g，1.473%)。因此，最終選定pH值4.0、4.8、5.6進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

同一指標(biāo)不同pH值比較。

2.2.4 酶解溫度對復(fù)合酶水解效果的影響

由圖4可見，當(dāng)溫度在27～42 ℃范圍內(nèi)，隨著酶解溫度的升高，三氯乙酸可溶蛋白含量和還原糖含量先升高后降低，且在37 ℃達(dá)到最高值(1.473%，54.57 mg/g)。當(dāng)溫度增加到47 ℃，三氯乙酸可溶蛋白含量和還原糖含量顯著低于37 ℃時(shí)的三氯乙酸可溶蛋白和還原糖含量(P<0.05)。綜上所述，選定32、37、42 ℃進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

同一指標(biāo)不同溫度比較。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表6。由表 7 的方差分析結(jié)果可知，料水比對還原糖和三氯乙酸可溶蛋白含量有顯著影響(P<0.05)。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果

表7 方差分析結(jié)果

2.4 Topsis綜合分析

用在線SPSSAU系統(tǒng)平臺中熵權(quán)Topsis法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到還原糖、三氯乙酸可溶蛋白和粗纖維權(quán)重系數(shù)分別為48.57%、48.60%和2.83%。由表8可知，第5組的試驗(yàn)條件為最佳酶解條件，即料水比1∶2、時(shí)間24 h、pH值4.8、溫度42 ℃。

表8 TOPSIS評價(jià)計(jì)算結(jié)果

3 討論

3.1 復(fù)合酶的確定

在飼料中添加外源酶制劑已是公認(rèn)的經(jīng)濟(jì)有效的提高飼料利用率的方法。甘露聚糖酶能將甘露聚糖降解為寡糖和單糖[14]，反應(yīng)中添加甘露聚糖酶能提高產(chǎn)物中還原糖的含量。纖維素酶能夠通過打破纖維素中的1，4-β-糖苷鍵將纖維素降解為葡萄糖[15]。外源蛋白酶將飼料中大分子水解為多肽和氨基酸是通過斷裂肽鍵、破壞蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)，從而提高其消化率[16]。寡糖和葡萄糖均屬于還原糖，以還原糖含量為指標(biāo)能有效描述這兩種酶的酶解效率。蛋白質(zhì)可被蛋白酶水解成小肽，這些小肽可被三氯乙酸溶解，以三氯乙酸可溶蛋白含量為指標(biāo)能有效描述蛋白酶的酶解效率。

3.2 復(fù)合酶水解條件的單因素優(yōu)化

料水比即底物與水劑的比例，當(dāng)水劑的量少而樣品的濃度高時(shí)，樣品與酶沒有足夠大的接觸面積[17]，還原糖生成量受到限制。而水劑含量增多，一定量的水劑可以使底物和酶制劑碰撞機(jī)率增加，促進(jìn)酶解反應(yīng)，從而提高還原糖含量[18]。

酶與底物結(jié)合需要一定時(shí)間，時(shí)間過短，酶與底物結(jié)合不完全，生成物少。而酶具有專一性，隨酶解時(shí)間延長，底物可被結(jié)合鍵已基本被結(jié)合完全，生成物增加量逐漸減少。

pH值可影響酶的空間結(jié)構(gòu)，從而改變酶的構(gòu)象及活性。當(dāng)pH值過低，甘露聚糖酶失去活力，使得還原糖含量極低。而在過酸條件下，促進(jìn)了蛋白質(zhì)的水解，改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)[19]，從而增加了三氯乙酸可溶蛋白的含量。本研究得到的最適pH值與目前報(bào)道的大多數(shù)甘露聚糖酶[20]、酸性蛋白酶、纖維素酶[21]的適宜pH值范圍相符，這也說明酶解反應(yīng)需要在合適的 pH值下才能高效進(jìn)行。

溫度對復(fù)合酶酶解效果的影響是從反應(yīng)速度和酶活兩個(gè)方面影響反應(yīng)效果的。在低溫條件下，酶活性穩(wěn)定，但是分子運(yùn)動(dòng)速度慢。物質(zhì)擴(kuò)散速度慢，所以反應(yīng)進(jìn)程慢。隨著溫度在一定范圍內(nèi)升高，反應(yīng)速度增加并且酶逐漸達(dá)到最適反應(yīng)溫度，會得到最佳的試驗(yàn)效果。溫度過高，生成物含量反而降低，這可能是因?yàn)轱暳霞庸み^程中溫度過高可能會增強(qiáng)美拉德反應(yīng)，阻斷了蛋白酶活性[22]。

3.3 最優(yōu)條件下酶解對棕櫚粕還原糖、三氯乙酸可溶蛋白和纖維素含量的影響

與固定條件(溫度37 ℃、pH值4.8、料水比1∶2、時(shí)間24 h)相比，在優(yōu)化后條件下反應(yīng)，還原糖含量與蛋白質(zhì)含量均顯著提高(54.57 mg/gvs. 65.29 mg/g；1.47%vs. 3.86%)。這與前人研究結(jié)果一致，者園園[10]優(yōu)化了甘露聚糖酶酶解棕櫚粕的條件如時(shí)間、pH值和溫度，將還原糖含量提高至7.43 mg/mL。說明優(yōu)化酶解條件是提高復(fù)合酶酶解效率、降低棕櫚粕中甘露聚糖的有效方法。經(jīng)優(yōu)化后，粗纖維含量有所降低，表明還原糖產(chǎn)生的原因之一是粗纖維的降解，也說明纖維素酶的添加有效地破壞了細(xì)胞壁，使它包裹著的甘露聚糖得以釋放，提高了甘露聚糖酶解效率，在很大程度上減輕了NSPs的抗?fàn)I養(yǎng)作用。樊云雪[23]探究了單酶(β-甘露聚糖酶)和復(fù)合酶(β-甘露聚糖酶和纖維素酶)酶解PKC中甘露聚糖的最佳工藝參數(shù)，發(fā)現(xiàn)使用復(fù)合酶水解率提高6%且酶解產(chǎn)物中葡萄糖含量增高，這也進(jìn)一步證實(shí)了將酶解條件優(yōu)化的有效性。

4 結(jié)論

甘露聚糖酶、酸性蛋白酶和纖維素酶組成的復(fù)合酶在料水比1∶2、時(shí)間24 h、pH值4.8和溫度42 ℃條件下水解棕櫚粕，反應(yīng)后還原糖含量可達(dá)65.29 mg/g，三氯乙酸可溶蛋白含量可達(dá)3.86%，粗纖維降至8.58%，能有效改善棕櫚粕的營養(yǎng)價(jià)值。